miR-125a-3p介導(dǎo)DUSP1信號通路對急性髓系白血病細(xì)胞化療敏感度的影響

郭艷榮　　金麗虹　　林佩佩　　段玉波

[摘要] 目的 分析沉默微小RNA-125a-3p（miR-125a-3p）介導(dǎo)雙特異性磷酸酶1（DUSP1）信號通路對急性髓系白血病細(xì)胞化療敏感性的影響。 方法 購買人急性白血病細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，分為空白組、耐藥組、沉默組、過表達(dá)組。檢測每組細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞DUSP1信號通路蛋白表達(dá)情況，并分析其作用機(jī)制。 結(jié)果 與耐藥組相比，沉默組miR-125a-3p表達(dá)量降低，過表達(dá)組miR-125a-3p表達(dá)量升高（均P<0.05），與沉默組相比，過表達(dá)組miR-125a-3p表達(dá)量升高（P<0.05），說明miR-125a-3p轉(zhuǎn)染成功。與耐藥組相比，沉默組細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率降低，過表達(dá)組細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率升高（均P<0.05）;與沉默組相比，過表達(dá)組細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率升高（均P<0.05）。與耐藥組相比，沉默組化療敏感性降低，過表達(dá)組化療敏感性升高（均P<0.05），與沉默組相比，過表達(dá)組化療敏感性升高（P<0.05）。與耐藥組相比，沉默組DUSP1蛋白表達(dá)量升高，p38、MAPK蛋白表達(dá)量降低，過表達(dá)組DUSP1蛋白表達(dá)量降低，p38、MAPK表達(dá)量升高（P<0.05）;與沉默組相比，過表達(dá)組DUSP1蛋白表達(dá)量降低，p38、MAPK表達(dá)量升高（均P<0.05）。 結(jié)論 過表達(dá)miR-125a-3p可抑制急性髓性白血病細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖、增強(qiáng)敏感性，其作用機(jī)制可能與DUSP1信號通路被激活相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] miR-125a-3p;DUSP1信號通路;急性髓系白血病細(xì)胞;化療敏感性

[中圖分類號] R733.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）17-0027-04

Effect of miR-125a-3p-mediated DUSP1 signaling pathway on the chemotherapy sensitivity of acute myeloid leukemia cells

GUO Yanrong1? ?JIN Lihong2 LIN Peipei1? ?DUAN Yubo3

1.Department of Hematology，Taizhou Central Hospital （Taizhou University Hospital）， Taizhou 318000，China;2.Department of Pediatric Surgery，Taizhou Hospital of Zhejiang Province affiliated to Wenzhou Medical University，Taizhou 317000，China;3.Department of Intensive Care Unit， Jiangxi Cancer Hospital， Nanchang 330000，China

[Abstract] Objective To analyze the effect of miR-125a-3p-mediated dual specificity phosphatase 1 （DUSP1） signaling pathway on the chemotherapy sensitivity of acute myeloid leukemia cells. Methods Human acute leukemia cell lines were purchased for culture and divided into the blank group， the drug-resistant group， the silent group and the overexpression group.Cell proliferation， apoptosis， and the protein expression in the cellular DUSP1 signaling pathway in each group were detected， and the mechanism of action was analyzed. Results Compared with the drug-resistant group， the miR-125a-3p expression was decreased in the silent group and increased in the overexpression group（all P<0.05），and compared with the silent group， the miR-125a-3p expression was increased in the overexpression group（P<0.05），indicating the successful transfection of miR-125a-3p. Compared with the drug-resistant group， the inhibition rate of cell proliferation and apoptosis rate were decreased in the silent group and increased in the overexpression group（all P<0.05），and compared with the silent group， the inhibition rate of cell proliferation and apoptosis rate were increased in the overexpression group（all P<0.05）.Compared with the drug-resistant group， the chemotherapy sensitivity was decreased in the silent group and increased in the overexpression group（all P<0.05）， and compared with the silent group， the chemotherapy sensitivity was increased in the overexpression group（P<0.05）.Compared with the drug-resistant group， DUSP1 protein expression was increased and the expressions of p38 and mitogen-activated protein kinase （MAPK） were decreased in the silent group， and DUSP1 protein expression was decreased and the expressions of p38 and MAPK were increased in the overexpression group（all P<0.05）. Compared with the silent group，DUSP1 protein expression was decreased and the expressions of p38 and MAPK were increased in the overexpression group（all P<0.05）. Conclusion Overexpression of miR-125a-3p can inhibit apoptosis， promote proliferation and enhance sensitivity of acute myeloid leukemia cells， and the mechanism of action may be related to the activated DUSP1 signaling pathway.

[Key words] miR-125a-3p; DUSP1 signaling pathway; Acute myeloid leukemia cells; Chemotherapy sensitivity

白血病是由于造血系統(tǒng)惡性克隆產(chǎn)生的疾病，并浸潤其他造血組織器官，抑制正常造血功能，出現(xiàn)發(fā)熱、貧血、出血、浸潤等臨床癥狀[1]。急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是白血病的重要亞型。目前白血病治療的主要手段為化療，但白血病特有的生物學(xué)特征使白血病細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，使白血病患者對化學(xué)藥物的敏感性降低，且在化療過程易出現(xiàn)重癥感染[2]。目前臨床研究表明，AML發(fā)生化療耐藥性是因miRNA表達(dá)異常，喪失對下游靶基因的正常調(diào)控[3]。雙特異性磷酸酶1（DUSP1）是雙特異性磷酸酶家族的一員，負(fù)調(diào)節(jié)有絲分裂原蛋白激酶通路（MAPK），抑制該通路上絲氨酸和酪氨酸的磷酸化[4]?；谏鲜鲅芯勘尘?，本研究分析沉默微小RNA-125a-3p（miR-125a-3p）對急性髓系白血病細(xì)胞增殖、凋亡及DUSP1信號通路的影響，為臨床髓系白血病的化療敏感性研究提供新方向。

1 材料與方法

1.1 研究材料

研究細(xì)胞：人急性白血病細(xì)胞株K562購于上海圻明生物科技有限公司。主要試劑：PRMI-1640培養(yǎng)基（北京百奧萊博科技有限公司）;miR-125a-3p沉默質(zhì)粒、miR-125a-3p過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）;Lipofectamine 2000試劑盒（Invitrogen公司）;DUSP1、p38、MAPK檢測試劑盒（上海梵態(tài)生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1? 急性髓系白血病細(xì)胞培養(yǎng)? 取人急性髓系白血病化療耐藥細(xì)胞株K562放入37℃ 5% CO2含10%胎牛血清的PRMI-1640的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，對K562細(xì)胞加入5 μg/ml化療藥物進(jìn)行培養(yǎng)耐藥維持表型，試驗前兩周換為不含化療的培養(yǎng)液。取生長期的細(xì)胞分別接種于96孔板，向細(xì)胞中加入0.01、0.1、1、5、10、50和100 μg/ml的化療藥物放入37℃ 5% CO2、飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個濃度設(shè)5個平行復(fù)孔，每孔加入10 μl MTT溶液繼續(xù)孵育4 h，每孔加入10 μl 10% DMSO終止反應(yīng)。試驗重復(fù)測量3次。

1.2.2? 細(xì)胞轉(zhuǎn)染? 取對數(shù)K562耐藥細(xì)胞，將其接種于6孔板，細(xì)胞融合至80%時，將miR-125a-3p過表達(dá)質(zhì)粒、miR-125a-3p沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于K562耐藥細(xì)胞，對其進(jìn)行48 h的培養(yǎng)。耐藥組不做任何處理，另外取不做任何處理的人急性髓性白血病細(xì)胞株K562作為空白組。

1.2.3? 細(xì)胞增殖檢測? 采用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖情況，調(diào)整測定細(xì)胞濃度，將其接種于96孔板中，并在孔板中加入200 μl細(xì)胞懸液，放入37℃、5% CO2環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，24、48、72 h后加入10 μl MTT試劑，孵育4 h后采用酶標(biāo)儀對OD值進(jìn)行測定，并計算增殖率。

1.2.4? 細(xì)胞凋亡檢測? 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，取各組細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，采用Annnexin V-FITC凋亡試劑盒，37℃避光孵育0.5 h，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡數(shù)。

1.2.5? DUSP1通路蛋白檢測? 采用Western Blot法檢測細(xì)胞DUSP1、p38、MAPK表達(dá)情況，對所培養(yǎng)的細(xì)胞做離心、蛋白提取，之后收集上清，使用BCA試劑盒檢測DUSP1、p38、MAPK蛋白含量，提取等量蛋白質(zhì)，100℃變性5 min，使用凝膠電泳分離，4℃條件下加入一抗孵育過夜，洗滌15 min 3次，加入稀釋好的二抗，孵育2 h，洗滌15 min 3次，定量分析蛋白表達(dá)情況。以GAPDH為內(nèi)參，重復(fù)試驗3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）描述，多組間比較采用F檢驗，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組miR-125a-3p表達(dá)量比較

與空白組相比，耐藥組、沉默組miR-125a-3p表達(dá)量降低，過表達(dá)組miR-125a-3p表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）;與耐藥組相比，沉默組miR-125a-3p表達(dá)量降低，過表達(dá)組miR-125a-3p表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），與沉默組相比，過表達(dá)組miR-125a-3p表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明miR-125a-3p轉(zhuǎn)染成功。見表1。

2.2 四組細(xì)胞化療敏感性比較

與空白組相比，耐藥組、沉默組化療敏感性降低，過表達(dá)組化療敏感性升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義均（P<0.05）;與耐藥組相比，沉默組化療敏感性降低，過表達(dá)組化療敏感性升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），與沉默組相比，過表達(dá)組化療敏感性升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 四組細(xì)胞增殖抑制、凋亡情況比較

與空白組相比，耐藥組、沉默組細(xì)胞增殖抑制率降低，凋亡率降低，過表達(dá)組增殖抑制率升高，凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）;與耐藥組相比，沉默組細(xì)胞增殖抑制率降低，凋亡率降低，過表達(dá)組細(xì)胞增殖抑制率升高，凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）;與沉默組相比，過表達(dá)組細(xì)胞增殖抑制率升高，凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。見表3、封三圖2。

2.4 四組細(xì)胞DUSP1通路蛋白表達(dá)量比較

與空白組相比，耐藥組、沉默組DUSP1蛋白表達(dá)量升高，p38、MAPK蛋白表達(dá)量降低，過表達(dá)組DUSP1蛋白表達(dá)量降低，p38、MAPK蛋白表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）;與耐藥組相比，沉默組DUSP1蛋白表達(dá)量升高，p38、MAPK蛋白表達(dá)量降低，過表達(dá)組DUSP1蛋白表達(dá)量降低，p38、MAPK表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）;與沉默組相比，過表達(dá)組DUSP1蛋白表達(dá)量降低，p38、MAPK表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。見表4、圖2。

3 討論

白血病是因造血組織退化產(chǎn)生的異質(zhì)性克隆障礙疾病，其發(fā)病主要原因為造血干細(xì)胞失去分化為正常細(xì)胞的能力，細(xì)胞增殖失控、凋亡受阻，造成未分化成熟的白細(xì)胞在骨髓或其他造血組織中呈腫瘤性異常增生，正常血細(xì)胞生成減少[5～7]。目前治療急性髓性白血病的主要方式為化療，對化療藥物的敏感性降低[8～10]?；谏鲜鲂问?，本研究分析過表達(dá)miR-125a-3p及DUSP1信號通路對急性髓系白血病化療敏感性的影響，為臨床上研究化療藥物的敏感性提供參考。

微小RNA（miRNA）是存在于真核生物類的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后通過與靶mRNA的堿基結(jié)合發(fā)揮其降解、抑制翻譯的作用[11～13]。經(jīng)上述作用后，miRNA參與機(jī)體一系列生理病理過程。研究表明，miR-125a低表達(dá)的亞型總體生存短、預(yù)后差，miR-125a-3p在肺癌、胃癌、前列腺癌多種惡性腫瘤組織中下調(diào)，異常的miR-125a-3p表達(dá)參與某些腫瘤獲得耐藥性，影響腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[14，15]。結(jié)果提示，miR-125a-3p過表達(dá)在急性髓系白血病中發(fā)揮著重要作用，過表達(dá)其miR-125a-3p可改變上述異常情況，最終發(fā)揮其改善急性髓系白血病的作用。

研究表明，DUSP1與肺癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病等腫瘤密切相關(guān)，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后，DUSP1通過激活MAPK/ERK通路改善生存，且DUSP1是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，DUSP1還可抑制前列腺細(xì)胞中MAPK/p38誘導(dǎo)的凋亡[16～18]。研究表明，在ALL細(xì)胞中，DUSP1蛋白表達(dá)水平受Notch3調(diào)控，可通過激活DUSP1-p38通路增加其化療敏感性[19，20]。

綜上所述，miR-125a-3p過表達(dá)處理的急性髓系白血病細(xì)胞化療敏感性明顯增強(qiáng)，增殖率減少，其作用機(jī)制可能與激活DUSP1信號通路相關(guān)。

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（收稿日期：2021-05-24）