耶氏肺孢子菌肺炎分子生物學(xué)診斷方法研究進(jìn)展

唐秀文

【關(guān)鍵詞】肺炎;耶氏肺孢子菌;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);宏基因組二代測(cè)序技術(shù)

中圖分類(lèi)號(hào)：R563.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.06.015

耶氏肺孢子菌肺炎（PJP）是一種由耶氏肺孢子菌（PJ）引起的呼吸系統(tǒng)機(jī)會(huì)性感染，常見(jiàn)于免疫功能低下或缺陷者。近年來(lái)，接受高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（HAART）和肺孢子菌肺炎預(yù)防措施的HIV感染患者發(fā)生PJP的概率明顯減少，但隨著癌癥患者、器官移植者、老年患者、先天性或獲得性免疫缺陷及因其他疾病而接受免疫抑制劑等肺孢子菌肺炎高危人群的擴(kuò)大，臨床肺孢子菌肺炎患者日趨增多，年病死率達(dá)30%～50%[1～2]。PJP患者的臨床癥狀、體征、X線胸片及常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查均無(wú)特異性，易漏診和誤診。目前耶氏肺孢子菌缺乏穩(wěn)定、可靠的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，無(wú)法從培養(yǎng)方法獲得;血清β-D-葡聚糖（BDG）檢測(cè)敏感度高，但缺乏特異性[3～4];只能作為輔助診斷指標(biāo)。目前診斷PJP的檢查“金標(biāo)準(zhǔn)”仍然是下呼吸道標(biāo)本通過(guò)染色鏡檢發(fā)現(xiàn)特征性包囊和滋養(yǎng)體，推薦的GMS染色對(duì)包囊染色特異性好，對(duì)比性強(qiáng)，菌體容易辨認(rèn)，故在臨床得到廣泛應(yīng)用，但受限于標(biāo)本質(zhì)量、肺孢子菌的載量、檢驗(yàn)師的從業(yè)經(jīng)驗(yàn)以及耶氏肺孢子菌的形態(tài)多形性，檢出率較低，因此孢子菌肺炎的早期診斷比較困難?？茖W(xué)家們用分子生物學(xué)方法探求PJP的病原體，使用分子生物學(xué)方法檢測(cè)耶氏肺孢子菌采用的基因序列有：肺孢子菌線粒體大亞基核糖體核糖核酸（mitochondrial partial LSU rRNA gene，mtLSU rRNA）、內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（internally transcribed spacer，ITS）、主要表面糖蛋白（the major surface glycoproteins，MSG）及二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）等。本文主要綜述不同分子生物學(xué)診斷方法檢測(cè)耶氏肺孢子菌的研究進(jìn)展。

1耶氏肺孢子菌分子生物學(xué)檢測(cè)方法

1.1普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis在20世紀(jì)80年代發(fā)明的一種用于擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，并以此獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。國(guó)外在1990年首次報(bào)道應(yīng)用PCR技術(shù)從宿主肺泡灌洗液（BALF）中檢出PJ-DNA，2006年，將PCR與免疫熒光法（IFA）兩種方法對(duì)比，結(jié)果顯示PCR方法敏感性更好。而GMS染色鏡檢法與PCR兩種方法相比則PCR的敏感性更高，更適合于臨床無(wú)創(chuàng)性標(biāo)本的檢測(cè)。國(guó)內(nèi)有關(guān) PCR方法用于肺孢子菌肺炎（PCP）的文獻(xiàn)薈萃分析，大部分文獻(xiàn)證明PCR檢測(cè)法診斷PCP的敏感性和特異性明顯高于其他檢測(cè)法，但普通的PCR易受環(huán)境污染，具有一定的假陽(yáng)性，可以用于臨床PCP患者的篩選，還可用于臨床治療效果評(píng)價(jià)[5]。

1.2巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（nested polymerase chain reaction，Nested-PCR）巢式PCR 方法是在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新方法，通過(guò)兩輪PCR反應(yīng)，先后使用兩對(duì)引物，從極少量的模板擴(kuò)增特異性DNA片段。1990年，相關(guān)研究以 pAZ102-E和pAZ102-H為引物，在患者支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本中擴(kuò)增出肺孢子菌mtLSUrRNA片段，并證實(shí)PCR技術(shù)可以識(shí)別臨床數(shù)據(jù)和銀染色的假陽(yáng)性及假陰性診斷，檢出率遠(yuǎn)高于GMS染色法，可以用于早期診斷，漏診率和假陽(yáng)性發(fā)生率低。國(guó)內(nèi)有研究通過(guò)mtLSU巢式PCR對(duì)98例呼吸疾病急性發(fā)作期患者的103 份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)mtLSU巢式PCR可以擴(kuò)增出最低含量為366 fg的肺孢子菌基因，具有很高的靈敏性，8種其他真菌和細(xì)菌的DNA樣本均未擴(kuò)增出目的片段，具有高度的特異性[6]。極大地提高了病原微生物檢測(cè)的敏感性和特異性，但其延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間，也增加了檢測(cè)成本。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time PCR，qPCR）qPCR是對(duì)樣品特定的DNA進(jìn)行定性及定量分析的PCR。通常使用熒光標(biāo)記引物，通過(guò)儀器連續(xù)監(jiān)測(cè)每一次擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物含量，獲得反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線，得出樣品中的起始濃度。qPCR與普通PCR相比在檢測(cè)疑診PJP患者的陽(yáng)性率方面更節(jié)約時(shí)間，同時(shí)保持著較高的敏感性。而直接免疫熒光測(cè)定法（DFA）和qPCR兩種檢測(cè)方法檢測(cè)宿主PCP感染率的結(jié)果表明，qPCR特異性和敏感性顯著高于DFA。國(guó)內(nèi)有學(xué)者應(yīng)用qPCR技術(shù)與GMS染色對(duì)艾滋病合并肺部感染患者的BALF標(biāo)本進(jìn)行肺孢子菌檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在標(biāo)本量少的情況下，qPCR法檢測(cè)肺孢子菌陽(yáng)性率為53.8%（21/39），GMS染色法陽(yáng)性率僅為2.5%（1/18）。RUIZ-RUIZ等[7]發(fā)明了一種新的實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)肺孢子菌，即設(shè)計(jì)了Msg和mtLSUrRNA兩套引物，加入SYBR Green為熒光染料，與基于肺孢子蟲(chóng)mtLSUrRNA序列的巢式PCR方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)巢式PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的70例標(biāo)本，實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性;3例巢式PCR檢測(cè)為陰性的樣本經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)為陽(yáng)性。此方法使用多重PCR，并用SYBR Green染料替代熒光探針，增加了檢測(cè)樣本中靶基因數(shù)，提高了檢測(cè)靈敏度，節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間和成本。用qPCR檢測(cè)肺孢子菌可為臨床區(qū)分患者定植和感染，選擇治療方案提供參考，并且其檢測(cè)過(guò)程均在封閉條件下進(jìn)行，可有效防止樣本污染。

1.4環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）LAMP是2000年日本科學(xué)家Notomi發(fā)明的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)，該方法采用了一種具有鏈置換功能的BstDNA聚合酶和四種專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的引物，可以識(shí)別目標(biāo)DNA上的6個(gè)不同的序列，只有6個(gè)序列全部匹配時(shí)才能繼續(xù)擴(kuò)增，因此大大提高了特異性。該方法很好地結(jié)合兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，既能縮短報(bào)告時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，還能區(qū)分定植和感染。XUE等[8]也在LAMP的基礎(chǔ)上增加了實(shí)時(shí)檢測(cè)，改良的LAMP檢測(cè)方法與其他常見(jiàn)的肺微生物無(wú)交叉反應(yīng)性，其敏感性是常規(guī)PCR的1000倍。使用該方法檢測(cè)403例患者，其中281例（69.7%）檢測(cè)到肺孢子菌的定植，且間質(zhì)性肺疾病比在慢性阻塞性肺疾?。–OPD）中更常見(jiàn)，與穩(wěn)定的COPD患者相比，COPD急性加重患者的吉氏桿菌定植患病率更高。HUBER等[9]將LAMP反應(yīng)與熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)相結(jié)合，將報(bào)告時(shí)間縮短至10分45秒至31分15秒，其中平均動(dòng)手時(shí)間為2分45秒，測(cè)試運(yùn)行的平均時(shí)間為9分38秒。該方法很好地結(jié)合兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，既能縮短報(bào)告時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，還能區(qū)分定植和感染。2015年，張楠等人[10]在肺孢子菌16s rRNA保守序列設(shè)計(jì)引物，建立了LAMP法檢測(cè)肺孢子菌基因，最低檢出拷貝數(shù)為50 copies/mL，敏感性高于普通PCR最低檢出拷貝數(shù)（104 copies/mL），并且與其他病原體無(wú)交叉反應(yīng)，具有較高特異度。LAMP檢測(cè)對(duì)抑制劑的敏感性較低，因此可以直接在呼吸標(biāo)本中進(jìn)行，既能縮短報(bào)告時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，還能區(qū)分定植和感染。缺點(diǎn)是引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，反應(yīng)涉及多種酶，不能進(jìn)行長(zhǎng)鏈DNA擴(kuò)增，易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

1.5熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）FISH是一種非放射性原位雜交技術(shù)，原理是利用報(bào)告分子（如生物素、地高辛等）標(biāo)記核酸探針，然后將探針與靶DNA雜交而形成探針及DNA雜交體，利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測(cè)體系對(duì)靶DNA進(jìn)行定性、定量及定位分析。免疫功能低下的患者難以利用痰液及肺泡灌洗液標(biāo)本診斷肺孢子菌肺炎，因此人體組織樣本更具診斷價(jià)值。DE SOUSA等[11]對(duì)30個(gè)石蠟包埋組織樣本進(jìn)行熒光原位雜交試驗(yàn)，以Grocott染色作為參考標(biāo)準(zhǔn)，并用呼吸道分泌物的實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行評(píng)估，證實(shí)FISH是一種肺組織中的肺孢子菌檢測(cè)高度敏感的篩查方法;而石蠟包埋活檢的特異性不理想，在FISH篩查結(jié)果呈陽(yáng)性的情況下，需要使用其他技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證性檢測(cè)。在呼吸道分泌物中，吉氏梭菌特異性FISH檢測(cè)的診斷應(yīng)用具有可接受的敏感性和良好的特異性。

1.6其他聚合酶鏈反應(yīng)

1.6.1降落聚合酶鏈反應(yīng)（touchdown PCR，TD-PCR）在PCR反應(yīng)過(guò)程中，其他條件保持不變，退火溫度每個(gè)循環(huán)降低1 ℃，從高于Tm值逐漸降低至低于Tm值，在最低退火溫度下循環(huán)10次左右，使特異性產(chǎn)物富集而降低非特異性產(chǎn)物。有人開(kāi)發(fā)了一種基于肺孢子菌二氫葉酸還原酶基因的定量TD-PCR，并將此方法用于臨床呼吸道標(biāo)本檢測(cè)，證明具有較好的敏感性和特異性，可區(qū)分定植和感染。

1.6.2PCR熔解曲線技術(shù)（melting curve PCR，MC-PCR）在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，逐漸增加溫度使雙鏈DNA變性，熒光染料又回復(fù)到游離狀態(tài)導(dǎo)致熒光信號(hào)降低，監(jiān)測(cè)每一步的熒光信號(hào)可產(chǎn)生熔解曲線，在擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度上有一特征峰可以區(qū)分特異產(chǎn)物與非特異產(chǎn)物。BERNAL-MARTNEZ等[12]發(fā)現(xiàn)一種基于real-time PCR的MC-PCR方法，可用于鑒別肺孢子菌和結(jié)核分枝桿菌及其他真菌感染。

1.7宏基因組測(cè)序法（metagenomic next-generation sequencing， mNGS）mNGS是一種不依賴(lài)傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，基于二代測(cè)序技術(shù)的高通量測(cè)序方法，可快速準(zhǔn)確地檢出所有微生物，覆蓋范圍廣，檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性和靈敏度高于傳統(tǒng)病原體檢測(cè)[13]。隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，測(cè)序成本呈指數(shù)級(jí)下降，推動(dòng)了mNGS技術(shù)的快速普及，在臨床上被廣泛應(yīng)用于病原體快速診斷和抗生素耐藥性監(jiān)測(cè)等。HUANG等[14]用mNGS對(duì)127份傳統(tǒng)病原體檢測(cè)陰性的肺部樣品進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示其中120份為陽(yáng)性，包括了許多傳統(tǒng)病原體檢測(cè)方法通常無(wú)法檢出的真菌如肺孢子菌、霉菌等，以及容易檢出的病原菌如銅綠假單胞菌、結(jié)核分枝桿菌及鮑曼不動(dòng)桿菌等。與傳統(tǒng)病原體檢測(cè)相比，mNGS敏感性更高（前者為25.73%，后者為88.30%），而特異性較低（前者為88.41%，后者為81.16%）。JIANG等[15]用mNGS對(duì)60例非HIV感染的PJP患者和134例診斷為非PJP肺炎患者的肺泡灌洗液及血清樣本進(jìn)行鑒定，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法Gomori甲胺銀染法和血清（1，3）-β-D-葡聚糖對(duì)比，發(fā)現(xiàn)mNGS診斷PJP的敏感性為100%，顯著高于Gomori甲胺銀染色（25.0%）和血清（1，3）-β-D-葡聚糖（67.4%），mNGS的特異性（96.3%）明顯高于血清（1，3）-β-D-葡聚糖（81.4%），mNGS能有效鑒別患者的合并感染，在mNGS診斷后，71.7%的PJP患者修改了最初的抗菌治療方案。XIE等[16]通過(guò)mNGS早期明確診斷后，臨床依據(jù)結(jié)果調(diào)整患者治療方案，患者28 d、90 d生存率均有所提高，90 d生存率從57.7%提高至83.3%。mNGS受抗生素影響小，在使用抗生素前提下，mNGs的陽(yáng)性率 （91.3%）顯著高于傳統(tǒng)方法（43.5%）[17～18]，ZHANG等[19]和CAMARGO等[20]研究均發(fā)現(xiàn)用mNGS與涂片鏡檢結(jié)果比較，mNGS敏感率和特異性明顯優(yōu)于涂片鏡檢方法。最近，mNGS作為一種多功能的診斷工具，已成功地用于各種傳染病中，與傳統(tǒng)方法相比，PJ的檢測(cè)陽(yáng)性率增加[21～22]。另外，使用抗菌藥物對(duì)mNGS影響很小，mNGS有比傳統(tǒng)方法更快更準(zhǔn)確的診斷優(yōu)勢(shì)，LI等[23]使用mNGS技術(shù)成功診斷PJP。因此mNGS能檢測(cè)和鑒定包括真菌、細(xì)菌及病毒等多種病原體，明顯提高病原體檢出敏感率和特異度，尤其對(duì)混合感染的檢測(cè)更具優(yōu)勢(shì);但也有局限性，存在去人源化難度大、對(duì)RNA病毒檢出率低、真菌和結(jié)核菌提取DNA相對(duì)困難及可檢測(cè)標(biāo)本中多種病原體等問(wèn)題，所以臨床醫(yī)生需要結(jié)合患者的臨床癥狀、檢查資料及流行病學(xué)資料綜合分析，避免非致病菌干擾并作出正確判讀。

2小結(jié)

近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷用于臨床疾病診療的探討，也運(yùn)用于PJP診斷研究中，明顯提高敏感性和特異性。即七種分子生物學(xué)方法檢測(cè)陽(yáng)性率均高于涂片染色鏡檢。但每種方法各有優(yōu)劣勢(shì)，普通PCR可作為篩查項(xiàng)目;qPCR及LAMP等技術(shù)能有效區(qū)分定植為臨床診療提供參考。mNGS能快速進(jìn)行病原體鑒別，可同時(shí)鑒定出多種病原體，對(duì)混合感染的檢測(cè)具有優(yōu)勢(shì)，對(duì)抗生素耐藥性分析、疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等個(gè)性化診斷，為推進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療，實(shí)現(xiàn)患者的個(gè)性化治療提供技術(shù)支持，具有較好的發(fā)展空間。但是也有局限性，不能區(qū)分感染和定植。為了使這些新技術(shù)為臨床診療發(fā)揮更好的作用，相關(guān)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)發(fā)布了相應(yīng)專(zhuān)家共識(shí)[24～26]。在耶氏肺孢子菌肺炎臨床診療中應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適合的分子生物學(xué)方法，建議用多種方法聯(lián)合檢測(cè)，可以提高病原體診斷的準(zhǔn)確性，減少漏診和誤診。

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（編輯：潘明志）