基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選肺炎鏈球菌感染的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路研究

李 靜，王 書(shū)，張 穎

(安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(合肥市第一人民醫(yī)院) 老年醫(yī)學(xué)科，安徽 合肥 230000)

0 引言

肺炎鏈球菌是一種人類共生細(xì)菌和主要的機(jī)會(huì)性呼吸道病原體，它不僅會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的侵襲性疾病，甚至每年在全世界造成數(shù)百萬(wàn)人死亡[1]。鼻咽分泌物的吸入可使肺炎鏈球菌在肺實(shí)質(zhì)中侵襲和傳播，從而導(dǎo)致肺部感染[2]。肺炎球菌肺炎的高發(fā)病率和高死亡率給個(gè)人和社會(huì)帶來(lái)了沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[3]。因此，探究機(jī)體對(duì)肺炎鏈球菌感染的反應(yīng)機(jī)制對(duì)防治肺炎鏈球菌感染至關(guān)重要。近年來(lái)，運(yùn)用生物信息學(xué)方法在分子水平上進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，為研究各種疾病的分子機(jī)制提供了新的思路。本研究通過(guò)對(duì)肺炎鏈球菌感染小鼠的肺關(guān)鍵基因的分析及鑒定，以期了解機(jī)體抵制肺炎鏈球菌感染背后的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載和處理

GSE83612數(shù)據(jù)集來(lái)自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，共納入4例肺炎鏈球菌(SP)感染小鼠和4例磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)對(duì)照的小鼠基因表達(dá)信息，其檢測(cè)平臺(tái)為GPL6887。對(duì)從 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的探針表達(dá)矩陣文件進(jìn)行歸一化和log2轉(zhuǎn)換，將平臺(tái)注釋文件與每個(gè)探針表達(dá)矩陣進(jìn)行匹配，并保留注釋良好的探針。對(duì)于對(duì)應(yīng)一個(gè)基因的多個(gè)探針，取平均表達(dá)值用于進(jìn)一步分析。

1.2 DEG 的鑒定

基于對(duì)照(HC)樣本和SP樣本表達(dá)值的比較，通過(guò)RStudio軟件(版本：1.3.1056)的limma包[4]篩選出差異表達(dá)基因(DEGs)。DEG 的篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：log2 倍數(shù)變化 (FC) 應(yīng)大于 2 或小于-2，調(diào)整后P<0.05。

1.3 功能富集分析

應(yīng)用colorspace，stringi，colorspace包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行 GO (Gene Ontology)分析和 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析，P<0.05且Q<0.05為篩選條件。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與模塊分析

為了探索不同基因編碼蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系，將DEGs導(dǎo)入STRING網(wǎng)站(https://www.string-db.org/)進(jìn)行進(jìn)一步分析。最低交互分?jǐn)?shù)應(yīng)大于 0.9，并刪除網(wǎng)絡(luò)中的孤立節(jié)點(diǎn)。接下來(lái)，將分析結(jié)果輸出一個(gè)TSV格式的文件中，并使用Cytoscape軟件(版本：3.8.2)進(jìn)行細(xì)節(jié)處理和模塊分析。MCODE是從 Cytoscape App Store下載的插件，可以根據(jù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中找到緊密相連的節(jié)點(diǎn)。因此，應(yīng)用此插件，以degree cutoff=2，node score cutoff=0.2，k-core=2和max.depth=100為標(biāo)準(zhǔn)[5]，來(lái)檢測(cè)PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵模塊，并應(yīng)用Cytohubba插件，按degree算法計(jì)算出評(píng)分位于前10位的樞紐基因。

2 結(jié)果

2.1 DEG 的鑒定

通過(guò)使用limma包分析整合數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)，獲得了325個(gè)DEG由281個(gè)上調(diào)基因和44個(gè)下調(diào)基因組成(表1列出部分)，以及按調(diào)整后的P值排序的前 20 個(gè)基因的表達(dá)(見(jiàn)表2)。

表1 部分差異表達(dá)基因

表2 按調(diào)整后的P值排序的前20個(gè)基因的表達(dá)

2.2 GO 和 KEGG 富集分析

Cluster Profiler包進(jìn)行的富集分析揭示了與DEG相關(guān)的生物學(xué)功能和途徑。如表3所示，DEG的GO注釋由3部分(BP，CC，MF)組成(每部分列出前10項(xiàng))。發(fā)現(xiàn)主要細(xì)胞成分(CC)位于血漿脂蛋白粒子、液泡、溶酶體等；主要分子功能(MF)與細(xì)胞因子活性、趨化因子活性、G蛋白偶聯(lián)受體等相關(guān)；主要涉及白細(xì)胞及各種粒細(xì)胞遷移、γ-干擾素反應(yīng)等生物過(guò)程。KEGG分析的前10條路徑(見(jiàn)表4)表明DEGs參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥反應(yīng)相關(guān)通路，如腫瘤壞死因子信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和IL-17信號(hào)通路等。

表3 差異表達(dá)基因的GO富集分析結(jié)果(列出了每個(gè)類別的前10項(xiàng))

表3(續(xù))

表4 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析結(jié)果(列出前10項(xiàng))

2.3 PPI2.3網(wǎng)絡(luò)搭建與MCODE插件分析

STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)經(jīng)Cytoscape調(diào)整可視化。為了找出復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的核心模塊，進(jìn)行了MCODE插件分析，確定了得分最高的2個(gè)重要模塊(其一：Ccl4，Il1b，Il1a，Csf2，Ccl7，Tnf，Cxcl13，Cxcr3，Cxcl1，Il6，Cxcl10。其二：Ifi44，Oas2，Rsad2，Isg15，MX1，Oasl1，Oasl2，Rtp4，Usp18)，得分均為5分，顯示主要與趨化因子及干擾素反應(yīng)相關(guān)。運(yùn)用cytoHubba插件，利用MCC法篩選出排名前10的樞紐基因依次為Irf7，Ifit1，Rsad2，Usp18，Oas12，Mx1，Ifi44，Cxcl10，Il1b，Isg15。

3 討論

肺炎球菌感染可導(dǎo)致人類高死亡率和發(fā)病率[6]。作為鼻咽共生菌群的一部分，肺炎球菌如何從共生狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏顟B(tài)所涉及的宿主反應(yīng)目前尚不清楚。確定宿主感染肺炎鏈球菌后機(jī)體的反應(yīng)機(jī)制，有利于開(kāi)發(fā)宿主導(dǎo)向的療法和篩選測(cè)試，進(jìn)行個(gè)體化的治療。本研究旨在通過(guò)生物信息學(xué)分析來(lái)識(shí)別肺炎球菌感染的生物標(biāo)志物并揭示其生物學(xué)功能，為制定相關(guān)的防治靶點(diǎn)提供思路。

在分析中，篩選出281個(gè)上調(diào)和44個(gè)下調(diào)的 DEG，肺炎鏈球菌感染和對(duì)照樣本之間的變化至少為 4 倍。按調(diào)整后的P值排序的前 50 個(gè)基因的表達(dá)顯示Igsf6，Ccd33，Il1b等基因在肺炎鏈球菌感染的肺轉(zhuǎn)錄組中顯著高表達(dá)，表明這些基因可能參與肺炎球菌感染的發(fā)生發(fā)展。接下來(lái)，通過(guò)功能富集分析對(duì)DEGs進(jìn)行注釋，觀察可知這些基因與細(xì)胞反應(yīng)和炎癥信號(hào)密切相關(guān)，例如各種炎性細(xì)胞遷移、趨化因子信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路和IL-17 信號(hào)通路。使用STRING網(wǎng)站和Cytoscape軟件建立DEG的PPI網(wǎng)絡(luò)。在MCODE插件的幫助下，篩選出最重要的子網(wǎng)絡(luò)，主要集中在調(diào)控干擾素及趨化因子的基因上，類似地，最后應(yīng)用cytoHubba篩選出的前10位樞紐基因，也主要與這兩種基因有關(guān)。

在樞紐基因及顯著模塊中，干擾素相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)。據(jù)報(bào)道，I型干擾素(IFN-I)通過(guò)調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)可降低上皮細(xì)胞通透性和抑制細(xì)菌遷移[7]，防止肺炎鏈球菌局部肺部感染發(fā)展為侵襲性疾病[8]。研究表明，缺乏 IFN-I 受體的小鼠在肺部感染肺炎鏈球菌后顯示出菌血癥風(fēng)險(xiǎn)的增加[7]。類似的，II型干擾素(IFN-γ)在肺炎球菌肺炎期間可以控制傳染源和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[9]，增強(qiáng)高親和力細(xì)胞表面分子FcγRI(CD64)和主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的表達(dá)從而參與炎癥反應(yīng)[10]。然而，IFN信號(hào)過(guò)度活化或沒(méi)有及時(shí)消除也會(huì)引起免疫系統(tǒng)紊亂，有可能會(huì)引發(fā)慢性炎癥，因此需要表達(dá)免疫負(fù)調(diào)控因子準(zhǔn)確、適時(shí)地調(diào)整胞內(nèi)信號(hào)通路的激活，從而保證機(jī)體免疫平衡。本研究中Irf7，Ifit1，Rsad2，Usp18，Oas12，Mx1，Ifi44，Isg15作為樞紐基因，協(xié)同調(diào)控干擾素在肺炎鏈球菌感染期間的作用。最顯著模塊中的基因還包括趨化因子及促炎細(xì)胞因子，如Cxcl10，Ccl4，Cxcl1，Ccl2等趨化因子顯著上調(diào)，趨化因子可與白細(xì)胞上的細(xì)胞表面受體結(jié)合，并將它們吸引到宿主感染部位[1]，通過(guò)及時(shí)和協(xié)調(diào)地招募免疫細(xì)胞，在對(duì)抗微生物感染和啟動(dòng)組織修復(fù)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11]。發(fā)揮重要作用的促炎細(xì)胞因子包括IL-6和Tnf等，IL-6可通過(guò)促進(jìn)肺修復(fù)、上皮細(xì)胞存活和減少成纖維細(xì)胞積累，在氣道細(xì)菌和病毒感染期間作為維持屏障完整性的關(guān)鍵免疫介質(zhì)[12]；腫瘤壞死因子(TNF)是免疫的中樞調(diào)節(jié)劑[13]。在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校钄郥NF-α和IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)或作用會(huì)削弱肺炎球菌肺炎期間的宿主防御能力，并導(dǎo)致細(xì)菌清除受損和存活率降低[14]。

綜上，筆者整合了多種生物信息學(xué)工具，確定了10個(gè)中樞基因可能作為肺炎鏈球菌感染的潛在治療靶點(diǎn)，在未來(lái)可通過(guò)嘗試使用化學(xué)誘導(dǎo)物(如趨化因子)將免疫細(xì)胞募集到肺部或直接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能(調(diào)節(jié)相應(yīng)細(xì)胞因子活性或信號(hào)通路的開(kāi)放)等手段治療肺炎鏈球菌肺炎。