人富血小板血漿試管法人工制備及保存的研究進展

李夢婕，陳寧杰，王海濤,

（1.濱州醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺，264100；2.山東大學(xué)附屬威海市立醫(yī)院，山東 威海，264200）

富血小板血漿（Platelet‐rich Plasma,PRP）是一種血小板濃度高于生理濃度的濃縮物，其激活后釋放的生長因子、細(xì)胞因子等多種生物活性物質(zhì)能夠促進細(xì)胞增殖及組織愈合，在組織修復(fù)上具有獨特優(yōu)勢。目前PRP已在燒（創(chuàng)）傷、慢性難愈性創(chuàng)面、運動性損傷等多種與組織損傷修復(fù)相關(guān)的疾病中應(yīng)用，與單獨使用重組生長因子相比，其療效毋庸置疑，且近年來開始越來越多的應(yīng)用到醫(yī)療美容領(lǐng)域如面部年輕化、禿發(fā)等的預(yù)防及治療中[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)PRP療效與血小板濃度、活性等多種因素相關(guān)，而PRP中血小板濃度和活性受制備方法的影響。PRP常用的制備方法包括試管手工法、機采法、套裝法和血袋法等，但目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化制備方案，制備過程中的血液條件、抗凝劑、離心參數(shù)等多個方面均可對最后的成品產(chǎn)生影響，進而影響其療效[1‐5]。同時，運用標(biāo)準(zhǔn)方法制備一定量的PRP進行保存，再根據(jù)治療量取用可能是保證其療效均一的可行性方法。本文就PRP的試管手工法制備、保存進行探討，以期為本領(lǐng)域研究者的工作中提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 分 類

作為由血液制備而成的高血小板濃度血漿濃縮物，PRP常通過采集患者自體靜脈血制備。根據(jù)離心濃縮后產(chǎn)物中的白細(xì)胞含量分為純富血小板血漿（pure platelet‐rich plasma，P‐PRP）和富白細(xì)胞富血小板血漿(leukocyte and platelet‐rich plasma，L‐PRP)[3]。臨床醫(yī)生在實際操作過程中往往根據(jù)不同的治療需求進行選擇。

2 試管手工法PRP 的制備原理及方法

PRP最終產(chǎn)量和質(zhì)量與血液狀態(tài)、性別、身高等自身條件，及抽血量、制備方法、離心策略等操作因素均相關(guān)。采血量根據(jù)用途不同而有所差異，單管采血量可以在8～60mL不等，所得PRP最終體積可根據(jù)所需血小板濃度，通過生理鹽水或貧血小板血漿（platelet‐poor plasma，PPP）進行調(diào)節(jié)，一般約為抽血量的1/5～1/10[4,5]。國際細(xì)胞醫(yī)學(xué)會提出PRP的血小板濃度有低倍(2.5～3.0倍)和高倍(5～9倍)之分；國內(nèi)學(xué)者普遍認(rèn)為在臨床應(yīng)用時，PRP中的血小板濃度應(yīng)以4～8倍為宜[1‐2,6]。

PRP主要制備方法包括血袋采集制備法、專用分離套裝制備法、試管手工采集法、成分血細(xì)胞單采機采集制備法等。前三種制備方法的原理基本相同，為基于二次差速離心法的血細(xì)胞分離[2]，是目前最常采用的方法，利用全血中各血液成分不同的沉降率和比重將不同血液成分進行分離，其中血小板比重及密度在血細(xì)胞中最低，僅略高于血漿。第一次低速離心也稱為軟離心，離心后血液被分為三層，底層為紅細(xì)胞層，約占總體積的一半；中間很薄的淺棕色層為泛白層(buffy coat)，含有血小板和大量白細(xì)胞，上層為血漿層[3,7]。不同位置的血漿中血小板濃度和平均血小板體積差異較大[8]，離心后約半數(shù)的血小板在泛白層中，下1/3血漿及泛白層中的血小板數(shù)量可超過全血的80%[5]。在保證血小板損失量最小的情況下去除底部紅細(xì)胞后進行第二次高速離心，也稱為硬離心，以進一步縮小產(chǎn)物體積、濃縮血小板，從而獲得較高的血小板回收率及最佳的血小板產(chǎn)量和質(zhì)量。硬離心后血小板和殘留的紅細(xì)胞下沉到容器底部，上層為PPP，去除上層多余的PPP，將剩余部分混勻即為PRP[4,9]。

也有學(xué)者根據(jù)所保留成分的不同將第二次離心細(xì)分為純富血小板血漿法（貧白細(xì)胞富血小板血漿）和泛白層法（富白細(xì)胞血小板血漿）。純富血小板血漿法是從試管中只分離出上層血漿層進行硬離心，不干擾泛白層或紅細(xì)胞層，但因泛白層中也含有血小板，該方法在減少白細(xì)胞含量的同時會損失一定量血小板。泛白層法是指軟離心后收集上層血漿層和全部的泛白層進行硬離心[5]。

3 影響PRP 制備效果的因素

血小板在激活后能釋放大量生長因子，因此，PRP中血小板數(shù)量、血小板回收率等是評價制備方法經(jīng)常考慮的問題。不同個體可能需要不同的血小板濃度比來達到相似的效果，且血小板中含有的生長因子濃度在不同患者之間也存在差異。PRP制備過程受控于多個因素：

3.1 離心參數(shù)

很多研究者就二次離心的PRP制備方法進行了探索，根據(jù)需求、環(huán)境及設(shè)備等不同，在保持基本原理不變的前提下選用不同離心參數(shù)，見表1。

3.1.1 第一次離心

不同離心機的轉(zhuǎn)子大小和半徑有所差異，描述時通常會用相對離心力（relative centrifugal force，RCF）來表達。其公式為：

當(dāng)全血體積和離心時間固定時，血小板和白細(xì)胞的回收率隨著離心力的增加逐漸增加達到峰值，而后過大的離心力可能會對細(xì)胞造成破壞從而使回收率逐漸下降，全血體積越大這種下降趨勢越不明顯。第一次離心以后上層血漿的體積會隨著離心力的增大而增加，在一定離心力區(qū)間內(nèi)，血小板回收率與第一次離心后上層血漿的獲取率成正相關(guān)[11‐13]。

Ozer等人[14]發(fā)現(xiàn)無論實驗中選取的離心力高低，最終都能達到想要的血小板濃度；當(dāng)離心力較大時，離心時間應(yīng)盡量短，反之亦然。第一次的離心參數(shù)范圍通常在70～900×g，5～10min之間，此時血小板的回收率較高且白細(xì)胞含量少，同時不會對血小板造成破壞[15]。Muthuprabakaran等[5]發(fā)現(xiàn)離心力越大，泛白層中所含的血小板就越多,Perez[12]認(rèn)為在相同的離心條件下單管處理較少的血容量可以更有利于血小板的回收，而離心時間可以作為一個調(diào)控PRP中白細(xì)胞水平的參數(shù)，離心時間長，白細(xì)胞濃度會降低。Araki[15]等認(rèn)為如需較高的白細(xì)胞含量，離心力可控制在70×g。Amable等[7]指出當(dāng)離心時間較短時，不同溫度對最終產(chǎn)物無明顯影響。

3.1.2 第二次離心

第二次離心時血小板回收率同樣會隨離心力的增加逐漸增高，但長時間高速離心可能因破壞血小板細(xì)胞膜而影響生長因子釋放[12]。研究者們認(rèn)為第二次離心參數(shù)最佳設(shè)定范圍在400～1500×g，10～17min之間，該范圍內(nèi)所得PRP的血小板濃度和回收率較高且?guī)缀醪缓渌?xì)胞[8,16]。張昭遠(yuǎn)等[11]認(rèn)為離心后泛白層中的血小板濃度能達到全血的20～40倍以上，Perez等[12]將第二次離心時離心時間設(shè)為10min，發(fā)現(xiàn)當(dāng)離心力超過400×g時，PPP中殘留血小板較少，當(dāng)離心力超過800×g時，血小板膜的完整性會遭到破壞從而使血小板被激活，且離心后沉淀在底部的少量紅細(xì)胞能吸附約20%的血小板使其不能很好的重懸。Bausset等人[17]則認(rèn)為第二次離心力在250×g以上都能得到較好的血小板濃度，但離心力的增加會導(dǎo)致血小板會發(fā)生自發(fā)性聚集使重懸程度降低，靜息血小板形態(tài)變差，這與Perez的觀點基本一致。

3.2 抗凝劑的選擇

血小板的抗凝狀態(tài)通過拮抗鈣離子實現(xiàn)，在不激活PRP的前提下，其在制備后能夠形成穩(wěn)定的抗凝狀態(tài)約8h[18]。常用抗凝劑包括枸櫞酸類、乙二胺四乙酸（EDTA）及肝素[19]。除肝素是通過抗凝血酶作用外，其余抗凝劑均通過一定程度的螯合鈣離子而發(fā)揮抗凝作（表2）用[16]。

表2 不同抗凝劑的作用機制

枸櫞酸鈉（sodium citrate,SC）是枸櫞酸類抗凝劑中常用的一種，6mg枸櫞酸鈉能抗凝1mL血液，在制備PRP時通常選用3.2%的枸櫞酸鈉按照1:9的比例與全血進行混合，該比例也適用于其他抗凝劑[16]。枸櫞酸鈉‐葡萄糖溶液（acid citrate dextrose，ACD）作為制備PRP常用的抗凝劑之一，能在制備過程中更好地維持血小板內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，從而提高了血小板的整體反應(yīng)性[17]；使用ACD作為抗凝劑并以較低的離心力離心能夠一定程度上保護血小板膜的完整性[3]。非聚集血小板的保存對于最大限度地提高血小板和血小板各類因子的濃度也至關(guān)重要，EDTA作為一種鈣螯合劑，與ACD相比作用更強；在防止血液凝固和血小板聚集方面明顯優(yōu)于枸櫞酸類抗凝劑，能使PRP中的血小板產(chǎn)量更高[15]。但有研究認(rèn)為EDTA做抗凝劑雖然能夠使血小板產(chǎn)量達到枸櫞酸鹽類抗凝劑的2倍，卻會造成血小板的完整性受損[20]，Aizawa等[21]也有類似觀點，認(rèn)為ACD對血小板的大小和功能，包括血小板的激活和生長因子的保留，優(yōu)于其他的抗凝劑。不過Aizawa也表示EDTA能夠制作出懸浮較好的PRP，在保留部分生長因子濃度的方面與ACD相似，因此如果能將EDTA劑量維持在對局部其他細(xì)胞組織無毒性的條件下，可作為ACD的替代品。

血小板在肝素抗凝環(huán)境中隨著時間延長會更易聚集[22]，且肝素在對PRP質(zhì)量控制和凝血活性恢復(fù)方面不能得到很好地控制，因此不適合用于PRP制備[21]。

3.3 紅細(xì)胞、血小板壓積及其數(shù)量對制備PRP 的影響

紅細(xì)胞壓積可影響PRP的質(zhì)量，其百分比越高，PRP中血小板數(shù)量越多；每增加1%的紅細(xì)胞壓積，PRP中的血小板計數(shù)約增加40×103/μL[19,23]。血小板壓積為血小板總數(shù)與平均血小板體積的乘積，機體調(diào)節(jié)過程中傾向于保持血小板壓積而不是數(shù)量的均衡，因此其也可作為評價PRP質(zhì)量的因素之一。此外，基礎(chǔ)血小板總數(shù)每增加1×103/μL，PRP中增加4.98×103血小板/μL[8]。

每個人全血的血小板數(shù)和濃度皆不相同，僅用血小板濃度及基線倍數(shù)來對PRP進行標(biāo)定時，同樣方法所得的產(chǎn)物會有很大差異。Tian等[16]設(shè)計了一種能夠通過公式來準(zhǔn)確控制血小板計數(shù)來控制最終PRP中血小板濃度的標(biāo)準(zhǔn)化PRP制備方法。首先估算第二次離心后保留的PRP體積(mL)：

PRP(mL)=[取血量(mL)×設(shè)定血小板回收率%×全血血小板濃度(109/L)÷(1000×109/L)；

將通過公式計算制得的PRP混勻后，如果血小板濃度大于1000×109/L，則再次利用公式計算出用來稀釋的PPP體積：

加入PPP體積(mL)=第二次離心后保留PRP(mL)×[第二次離心后血小板濃度(109/L)÷(1000×109/L)‐1]。

3.4 其他

身高可能是影響PRP質(zhì)量的因素之一，身高越高的人PRP中血小板濃度越大[19]，性別也是一個可能影響PRP質(zhì)量的因素[6]。此外，雖然全血制備前的保存溫度和制備時的溫度會對PRP質(zhì)量產(chǎn)生一定影響，但這種影響并不大[11]。

4 PRP 的不同保存方法及其效果

4.1 PRP 的低溫保存

Caiado等[26]將L‐PRP在‐30～‐20℃下進行三次重復(fù)的凍融循環(huán)后在至少‐20℃的等離子冰箱中低溫保存，解凍后應(yīng)用并通過進一步檢測其成分發(fā)現(xiàn)該保存方法至少可以保存PRP一年而不會對其質(zhì)量造成明顯破壞。Kim等[24]將PRP分別置于三種不同溫度下（室溫24℃，冷藏4℃，及低溫冷凍‐70℃），保存0～7d后對其進行激活并在37℃下孵育一小時后分析發(fā)現(xiàn)，儲存的PRP中生長因子濃度受儲存時間、儲存溫度及體外激活方式影響明顯，其中血小板計數(shù)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor‐basic,FGF‐B)濃度受解凍過程的影響很大。低溫保存1d后檢測，血小板計數(shù)顯著下降而FGF‐B濃度顯著升高，這可能與解凍過程中的細(xì)胞裂解有關(guān)系。而對于其他的生長因子而言，在7d的檢測范圍之內(nèi)，并沒有觀察到儲存溫度對生長因子濃度有明顯的影響。

Kaux等[27]通過兩次凍融循環(huán)（‐80℃，10min及37℃，5min）制備凍融PRP，并在兩周期之間進行15s的均質(zhì)處理，后在2000×g、5min的參數(shù)下離心去除膜碎片并在1h之內(nèi)應(yīng)用；結(jié)果表明冷凍PRP與新鮮PRP對組織的愈合一樣有效，但新鮮PRP治療速度略快。同時由于凍融后的細(xì)胞裂解和血小板脫顆粒，凍融PRP的部分生長因子含量較新鮮PRP有顯著增高，這也與Kim的觀點相一致。Kikuchi等[28]則發(fā)現(xiàn)被氯化鈣激活后凍存的樣本相比于先凍融再激活的樣本有較高的生長因子濃度。

此外，在冷凍5～7d以后，細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)能夠造成血小板的損傷，因此Hedge等也表示可以適當(dāng)應(yīng)用抗氧化劑以保護血小板不被清除[29]。

4.2 PRP 的凍干

da Silva等[30]人在‐80℃下對PRP進行冷凍后干燥處理并在‐20℃下保存，觀察凍干PRP再復(fù)溫后血小板的活性，發(fā)現(xiàn)新鮮PRP和凍干PRP在釋放生長因子的水平及生長因子的功能上并沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，證明了凍干PRP在臨床應(yīng)用中代替新鮮制備PRP的一種可能性。Kinoshita等[31]將PRP凍干4周后重懸檢測，凍干PRP在4周后仍能保留部分生長因子活性。Huber等[32]發(fā)現(xiàn)凍干PRP雖然破壞了其中40%～90%的血小板，但是生長因子的含量較新鮮PRP有明顯倍數(shù)增加。

凍干PRP的復(fù)水化可以通過PPP進行；生理鹽水、超純水和PBS緩沖液也可代替PPP作為凍干PRP的復(fù)水液，且在對生長因子的影響上無明顯差異，但使用超純水復(fù)水化后會有較多絮狀物且快速形成凝膠[33]。

5 結(jié)語

綜上，試管手工制備法大多是在二次離心法的原理基礎(chǔ)上，結(jié)合已有文獻自行選擇離心參數(shù)進行制備，區(qū)別主要在于離心力和離心時間的差異上；同時，手工提取時也可通過白膜層控制是否需要留存白細(xì)胞。PRP目前已在整形美容及再生醫(yī)學(xué)的多個領(lǐng)域中應(yīng)用，例如毛發(fā)再生、面部年輕化、面部填充等，但不同制備方法后，PRP中各有效成分含量對治療效果的影響、白細(xì)胞含量是否影響治療結(jié)局等方面研究仍舊較少。目前在臨床應(yīng)用中，大多數(shù)醫(yī)生更傾向于臨床使用新鮮制作的PRP，但PRP受制于全程制備耗時較長、制備套裝價格昂貴等因素影響，應(yīng)用上仍存在一定限制。因此，探索不同的成分對實際應(yīng)用中結(jié)局的影響，合理、安全且有效的短期保存方法等方向仍可作為未來的重點。

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