壯腰通絡方對腰椎間盤退行性病變大鼠病理變化及血清炎癥因子表達的影響

孫凱，魏戌，朱立國，2，張平，銀河，尹遜路，朱宏偉，秦曉寬

1.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100102；2.中醫(yī)正骨技術北京市重點實驗室，北京 100007

腰背痛是骨傷科臨床最常見的慢性疼痛疾病，具有患病率高、疾病負擔重、容易復發(fā)等特點，嚴重影響患者工作效率和生活質(zhì)量。腰椎間盤退行性病變（lumbar intervertebral disc degeneration，LIDD）是引起腰背痛的主要原因。研究表明，在50歲以上人群中，超過80%會出現(xiàn)椎間盤退變相關病理變化。中藥治療LIDD療效顯著。前期臨床觀察顯示，壯腰通絡方可有效改善腰椎間盤突出癥患者腰膝酸軟等不適癥狀，但其作用機制尚未闡明。腰痹通膠囊作為上市中成藥廣泛用于腰腿疼痛的臨床治療，研究表明，其能提高兔椎間盤Ⅱ型膠原含量，下調(diào)腫瘤壞死因子（TNF）-α和白細胞介素（IL）-1β mRNA表達，有效延緩LIDD。因此，本研究以腰痹通膠囊為對照，觀察壯腰通絡方對模型大鼠椎間盤病理變化及血清炎癥因子表達的影響，為明確其延緩LIDD的作用機制奠定實驗基礎。

1 實驗材料

1.1 動物

健康雄性SD大鼠65只，5月齡，體質(zhì)量（400±20）g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2019-0010，動物質(zhì)量合格證號110324210101287583。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所動物房，溫度（25±3）℃，相對濕度（55±10）%，12 h光暗交替，自由攝食飲水，每周更換2次墊料。實驗操作遵守實驗動物福利倫理原則。

1.2 藥物及制備

壯腰通絡方（杜仲15 g、熟地黃15 g、當歸12 g、丹參12 g等9味藥組成），飲片購于中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院藥學部，由中日友好醫(yī)院制劑室制備，飲片經(jīng)煎煮、過濾后，濃縮至原藥材濃度分別為1.425、0.713、0.356 g/mL，置于-4 ℃冰箱備用。腰痹通膠囊，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，0.42 g/粒，批號18081309885，取內(nèi)容物，配制成0.025 g/mL藥液。

1.3 主要試劑與儀器

Masson染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號G1340），大鼠IL-6 ELISA 試劑盒、大鼠TNF-α ELISA試劑盒、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）13抗體、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）抗體、復合消化液、抗原修復液（武漢博士德生物工程有限公司，貨號分別為EK0412、EK0526、A00420-2、BA2967-1、AR0022、AR0026）。ASP300 脫水機（德國徠卡公司），EG1150H 包埋機（德國徠卡公司），RM2235 切片機（德國徠卡公司），90型號牙科打磨機（功成醫(yī)療器械專營店），SynergyH1 酶標儀（美國伯騰儀器有限公司），TDZ4A-WS臺式低速離心機（湖南湘儀儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機抽取10只作為空白組，其余55只為造模組。造模前12 h禁食，0.3%戊巴比妥鈉（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，剔除腰背部毛發(fā)，俯臥位固定于實驗臺，碘酊和75%酒精消毒，以大鼠雙側(cè)髂嵴為體表骨性定位標志，以腰背部正中線與兩側(cè)髂后上棘連線交點為手術切口，沿切口上下各延伸1.5 cm左右，鈍性分離，充分暴露L～L棘突及兩側(cè)關節(jié)突關節(jié)，使用拉鉤撐開兩側(cè)皮膚和椎旁肌肉，咬骨鉗小心咬除L～L棘突（避免破壞椎板），牙科打磨機磨除兩側(cè)關節(jié)突關節(jié)，逐層縫合傷口，將傷口表面血漬擦除干凈。因麻醉及手術不當死亡4只，剩余51只大鼠隨機分為模型組、腰痹通膠囊組及壯腰通絡方高、中、低劑量組。根據(jù)人與大鼠體表面積換算給藥劑量，壯腰通絡方高、中、低劑量組分別按22.5、11.25、5.625 g/kg灌胃（相當于60 kg成人臨床用藥量的2、1、0.5 倍），腰痹通膠囊組按0.394 g/kg灌胃，灌胃體積10 mL/kg，空白組和模型組灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)8周。

2.2 取材

給藥結(jié)束后，0.3%戊巴比妥鈉（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，置于-80 ℃冰箱保存，用于血清炎癥因子及生化指標檢測。取造模腰椎節(jié)段，剔除其他組織后，將椎體及椎間盤置于4%多聚甲醛中固定，用于Masson染色及免疫組化檢測。

2.3 檢測指標

2.3.1 Masson染色

將大鼠椎間盤組織置于4%多聚甲醛中固定1周后進行脫鈣處理，每周更換2次脫鈣液，脫鈣3周，病理組織脫水機脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，切片脫蠟至水，蘇木素染色5 min，自來水沖洗5 min，鹽酸酒精分化5～10 s，蒸餾水浸洗3 min，麗春紅酸性復紅染色液染色5 min，2%冰醋酸浸洗1 min，1%磷鉬酸分化5～10 s，苯胺藍染色5 min，0.2%冰醋酸浸洗1 min，脫水、透明后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.3.2 血清炎癥因子及生化指標檢測

取大鼠血清，參照ELISA 試劑盒說明書檢測TNF-α和IL-6含量，全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、血尿素氮（BUN）和血肌酐（SCr）水平。

2.3.3 免疫組化檢測

椎間盤組織石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水洗3 次，PBS 洗2 次，檸檬酸緩沖液高壓鍋抗原修復3 min，PBS 洗2 次，每次5 min，3%HO室溫靜置10 min，PBS 洗2 次，每次5 min，分別滴加Aggrecan（1∶100）、MMP13（1∶50）一抗，37 ℃孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min，滴加二抗，37 ℃孵育50 min，PBS洗3 次，每次5 min，DAB 顯色3～5 min，自來水沖洗，蘇木素復染2 min，鹽酸酒精分化，脫水、透明后，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察，以棕色染色為陽性表達，計算陽性表達的平均光密度。

3 統(tǒng)計學方法

4 結(jié)果

各組大鼠一般情況良好，正常進食，初期因造模后傷口未完全愈合，部分大鼠出現(xiàn)皮下血腫，灌胃時出現(xiàn)躁動不配合甚至傷口裂開情況。因灌胃損傷等原因，空白組、腰痹通膠囊組各死亡1只，模型組、壯腰通絡方高、中劑量組各死亡2只。最終空白組9只、模型組9只、壯腰通絡方高劑量組8只、壯腰通絡方中劑量組8 只、壯腰通絡方低劑量組10 只、腰痹通膠囊組9只。

4.1 壯腰通絡方對模型大鼠椎間盤組織病理形態(tài)的影響

空白組大鼠椎間盤形態(tài)結(jié)構(gòu)較完整，髓核細胞核呈深藍色，可見豐富的膠原間質(zhì)，排列有序，椎間盤退變程度最輕；模型組大鼠椎間盤髓核細胞明顯減少，零星分布，排列不規(guī)則，椎間盤退變程度最重；壯腰通絡方高劑量組大鼠椎間盤髓核細胞明顯減少，分布不均勻，椎間盤退變程度較重；壯腰通絡方中劑量組大鼠椎間盤髓核細胞分布較規(guī)則，可見明顯膠原纖維，椎間盤退變程度較輕；壯腰通絡方低劑量組大鼠椎間盤髓核細胞相對減少，可見膠原纖維散在分布，椎間盤退變程度相對較輕；腰痹通膠囊組大鼠椎間盤髓核細胞較多，排列較規(guī)則，可見膠原纖維分布，椎間盤退變程度較輕。見圖1。

圖1 各組大鼠椎間盤組織形態(tài)（Masson染色，×400）

4.2 壯腰通絡方對模型大鼠血清炎癥因子和生化指標的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清TNF-α和IL-6含量增加（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清TNF-α含量減少（＜0.05），壯腰通絡方中劑量組和腰痹通膠囊組大鼠血清IL-6含量減少（＜0.05）。見圖2。各組大鼠血清ALT、AST、BUN和SCr差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05），見圖3。

圖2 各組大鼠血清TNF-α和IL-6含量比較（，每組8～10只）

圖3 各組大鼠血清生化指標比較（，每組8～10只）

4.3 壯腰通絡方對模型大鼠椎間盤組織聚集蛋白聚糖和基質(zhì)金屬蛋白酶13表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠椎間盤組織Aggrecan表達明顯降低，MMP13表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；與模型組比較，壯腰通絡方中、低劑量組和腰痹通膠囊組大鼠椎間盤組織Aggrecan表達明顯升高，MMP13表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。見圖4～圖6。

圖4 各組大鼠椎間盤組織Aggrecan陽性表達（免疫組化染色，×400）

圖5 各組大鼠椎間盤組織MMP13陽性表達（免疫組化染色，×400）

圖6 各組大鼠椎間盤組織Aggrecan和MMP13表達比較（，每組8～10只）

5 討論

隨著人口老齡化發(fā)展及生活方式的改變，以LIDD為代表的脊柱退行性疾病患病人數(shù)不斷增加。中醫(yī)藥在治療該類疾病中發(fā)揮了重要作用。LIDD屬中醫(yī)學“腰痛”“腰腿痛”“腰痹”等范疇，肝主筋，腎主骨，其發(fā)生發(fā)展與肝、腎等臟腑功能及陰陽平衡密切相關?！峨s病源流犀燭》記載：“腰痛，精氣虛而邪客病也……腎虛，其本也；風寒濕熱、痰飲、氣滯血瘀、閃挫，其標也?！北静《嘁娪谥欣夏昊颊撸愿文I虧虛為本，臨床常兼夾其他證候，如腎虛感受外邪、風寒濕邪兼夾氣滯血瘀等。夏炳江等認為，LIDD病機以五臟虛損為本，痰濁瘀血為標。本研究中壯腰通絡方在補益肝腎、活血通絡治法指導下，以杜仲、熟地黃等入肝、腎經(jīng)藥物為主。杜仲甘溫，偏于補陽，常用于肝腎不足之腰膝酸痛、痿軟無力之證；熟地黃微溫，偏于補陰，具有補血滋陰、益精填髓功效。二者陰陽并補，共奏補肝腎、強筋骨、益精髓功效。腎充則骨強，肝充則筋健，當歸、丹參皆可入肝經(jīng)以補血養(yǎng)血、活血祛瘀止痛。該方治療腰椎退行性疾病取得了較好的臨床效果。

LIDD過程復雜，髓核、纖維環(huán)、軟骨終板等重要組成部分的變化均會影響椎間盤退變。其病變與衰老、遺傳、局部異常應力集中、炎癥因子刺激等因素密切相關。在退變過程中，椎間盤細胞外基質(zhì)（ECM）合成減少，降解酶類增加，椎間盤內(nèi)Ⅱ型膠原及蛋白聚糖含量顯著降低，Ⅰ型膠原含量顯著增加。Aggrecan是椎間盤蛋白聚糖中最重要的組成部分，通過其硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素鏈維持椎間盤組織的水合作用，其含量下降是椎間盤早期退變的標志性事件。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠椎間盤組織Aggrecan表達降低，導致椎間盤滲透壓逐漸下降，進而形成惡性循環(huán)，加速椎間盤退變。壯腰通絡方和腰痹通膠囊干預后，能延緩Aggrecan丟失。MMP13是MMPs家族的重要膠原酶，不僅能降解Ⅱ型膠原，還能降解Ⅰ、Ⅲ、Ⅹ型膠原，在椎間盤及軟骨膠原破壞中扮演重要角色。本研究顯示，模型組大鼠椎間盤組織MMP13表達升高，壯腰通絡方和腰痹通膠囊能降低模型大鼠椎間盤組織MMP13表達。

在LIDD發(fā)展中，IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α等炎癥因子刺激導致MMPs和Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶表達上調(diào)，加劇ECM降解，下調(diào)ECM合成相關基因表達。Schistad等研究表明，血清IL-6水平升高不利于腰椎疼痛患者恢復。本研究發(fā)現(xiàn)，壯腰通絡方能降低大鼠血清TNF-α和IL-6含量，表明其能抑制炎癥因子表達，發(fā)揮治療LIDD作用。同時，血清生化指標檢測結(jié)果顯示，各組之間差異無統(tǒng)計學意義，表明壯腰通絡方給藥后不會造成大鼠肝、腎功能損傷。

綜上所述，壯腰通絡方可有效延緩大鼠LIDD，且具有較好的安全性，其作用機制可能與延緩Aggrecan丟失、降低MMP13及血清炎癥因子水平有關。本研究初步揭示壯腰通絡方治療LIDD的作用機制，為今后深入研究奠定基礎。