立枯絲核菌對高粱幼苗活性氧及抗氧化酶活性的影響

郭懷剛，趙長江，吳亞濱

(1 河南省農(nóng)業(yè)科學院長垣分院，河南長垣 453400； 2 黑龍江八一農(nóng)墾大學 農(nóng)學院，黑龍江大慶 163319)

中國是種植高粱(SorghumbicolorL.)最早的國家之一，目前雖然高粱已不再是主糧作物，但其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中仍是不可或缺的。高粱抗旱性好，在中國東北、華北、西北干旱地區(qū)和鹽堿地區(qū)的農(nóng)作物生產(chǎn)體系中具有不可替代的優(yōu)勢，值得一提的是，高粱產(chǎn)業(yè)也是國民經(jīng)濟發(fā)展所必需的，例如用于釀酒、飼料和能源等[1]。但是，高粱的種植過程中不同病害常年普遍發(fā)生，例如立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的高粱立枯病，發(fā)病嚴重時幼苗枯萎死亡。立枯絲核菌是一種土傳病原菌，寄主范圍廣且腐生性強，廣泛存在于大自然界中，可以侵染300多種植物，造成作物減產(chǎn)及品質(zhì)下降[2-3]。但是，迄今為止未發(fā)現(xiàn)對立枯絲核菌免疫的抗性材料，抗性品種的選育和利用十分有限，除了藥劑防治外，科研工作者還在生物防治方面進行了探索。例如，在水稻-油菜輪作土壤中發(fā)現(xiàn)彎曲芽胞桿菌(Bacillusflexus)和枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)對立枯絲核菌具有拮抗效應[4]；蚯蚓糞和活性污泥浸提液對立枯絲核菌抑制作用分別可高達78.3%和98.8%，能有效防治馬鈴薯莖潰瘍[5]；利用立枯絲核菌低毒菌株防治有機馬鈴薯生產(chǎn)中的土傳病害，可以減少土傳疾病，提高有機馬鈴薯生產(chǎn)的產(chǎn)量[6]。

其中關于水稻與立枯絲核菌互作機制研究較為系統(tǒng)，取得了長足的進展[2-3]。但是關于高粱與立枯絲核菌互作研究鮮有報道。高衛(wèi)東等[7]從高粱上得到26個分離物，發(fā)現(xiàn)侵染高粱的立枯絲核菌主要有AG-1-IA, AG-4和AG5，其中多數(shù)為AG1-IA。其中的優(yōu)勢種群與水稻紋枯病一致[8]，給探討高粱的抗性機制研究提供了較好的借鑒。本研究以立枯絲核菌AG1-IA侵染高粱，根據(jù)侵染時間的不同對高粱生長指標和代謝生理指標進行分析，揭示立枯絲核菌侵染高粱幼苗生理代謝過程，以期為高粱抗性育種和栽培提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)‘AG1-IA’由四川農(nóng)業(yè)大學鄭愛萍教授惠贈；供試高粱(SorghumbicolorL.)品種‘龍雜19號’由黑龍江省農(nóng)科院姜艷喜研究員提供。

1.2 植物種植

試驗于2017-2018年在黑龍江八一農(nóng)墾大學黑龍江省秸稈資源化利用工程技術(shù)研究中心進行。挑選大小飽滿一致無破損的種子，用10% NaHClO消毒15 min，期間不斷攪拌，無菌水沖洗4次，于培養(yǎng)箱中28 ℃暗催芽48 h，將芽長一致的高粱種子播種于基質(zhì)營養(yǎng)土(蛭石∶土=1∶1，V∶V)中，每盆定植20株。生長室培養(yǎng)條件為：晝夜溫度(25±2)℃/(20±2)℃，光照14 h，光強1000 μmol·m-2·s-1，相對濕度60%～80%。

1.3 病原菌接種及表型分析

高粱幼苗長至三葉一心時，采用葉鞘牙簽嵌入法進行立枯絲核菌菌絲接種，把長滿菌絲的牙簽嵌入高粱第一片和第二片葉葉鞘中，噴蒸餾水保濕，在28 ℃培養(yǎng)室內(nèi)的塑料小棚中控溫保濕培養(yǎng)72 h。分別在培養(yǎng)6 h(R6)、12 h(R12)、24 h(R24)、48 h(R48)、72 h(R72)和不接菌同期對照72 h(R0)時觀測幼苗表型并拍照，同時采用OS-30p葉綠素脈沖制熒光分析儀(美國Opti-Sciences公司)測定功能葉葉綠素熒光參數(shù)最大光化學效率(Fv/Fm)，并測定15株幼苗株高、根長、地上和地下鮮/干質(zhì)量，然后取葉片部分用錫箔紙包裹，投入液氮中速凍，-80 ℃冷藏備用，用于生理指標測定。每個處理3次重復。

1.4 相對電導率

剪取不同處理高粱植株相同葉位的葉片，取相同質(zhì)量，用去離子水沖洗干凈，避開主脈剪成大小適宜的長條。稱取0.5 g，置于玻璃試管中，加入10 mL去離子水，試管塞封口，室溫條件下靜置浸泡24 h，用電導率儀(DDSJ-308F，上海儀電科學儀器股份有限公司)測定浸提液電導率A，然后將玻璃試管置于沸水中煮沸30 min，取出冷卻至室溫，用電導率儀測定電導率B，重復3次，據(jù)此計算相對電導率(A/B×100%)[9]。

1.5 光合色素含量

參照王學奎[10]的方法測定665 nm、649 nm和470 nm波長處測量吸光度值，并計算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素(Car)的含量。

1.6 可溶性糖和可溶性蛋白含量

參照劉明楊等[11]用蒽酮法測定可溶性糖含量，在620 nm下測定其吸光度值。參照李合生[12]用考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量，在595 nm的條件下測定其吸光度值。

1.7 抗氧化相關指標

(1)丙二醛(MDA)含量：參照Hodges等[13]用硫代巴比妥酸法測定，在450 nm、532 nm、600 nm下測定其吸光度值。(2)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性：參照Jiang等[14]的氮藍四唑法測定，在560 nm波長下測定其吸光度值。(3)過氧化氫酶(catalase, CAT)活性:參照Jiang等[14]的方法測定，在240 nm波長下測定其吸光度值。(4)抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)活性:參照Jiang等[14]的方法測定，在290 nm的波長下測定其吸光度值。(5)過氧化物酶(peroxidase, POD)活性:參照Chen等[15]的愈創(chuàng)木酚法測定，在470 nm的波長下測定其吸光值。

1.8 活性氧相關指標

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行整理和圖表制作，利用SPSS 21軟件進行單因素方差分析，采用Duncan’s檢驗法進行多重比較及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 立枯絲核菌接種對高粱幼苗生長的影響

與對照(R0)相比，高粱幼苗在接種立枯絲核菌48 h表現(xiàn)出明顯的癥狀，接種72 h所有高粱幼苗因接種部位壞死而表現(xiàn)為枯死、垂折表型(圖1)。同時，隨病程的發(fā)展接菌高粱幼苗株高、根長、地上(莖和葉片)鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、地下(根)鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均隨著接種時間延長呈下降趨勢，且各指標在R24、R48和R72處理時均顯著降低，其中在R72時較對照分別下降了41.0%、29.2%、50.0%、50.0%、53.3%和50.0%(表1)，說明立枯絲核菌侵染會阻礙高粱生物量的積累，影響植株正常生長。

表1 接種立枯絲核菌后高粱幼苗生物量的變化

表2 接種立枯絲核菌后高粱幼苗葉片光合色素含量和Fv/Fm的變化

2.2 立枯絲核菌接種對高粱葉片葉綠素含量和最大光化學效率的影響

由表2可知，與對照(R0)相比，接種高粱葉片葉綠素a含量隨處理時間延長逐漸降低，在R24、R48和R72顯著降低，降幅分別達到1.7%、7.3%和45.3%；然而，葉片葉綠素b和類胡蘿卜素含量卻呈現(xiàn)增加趨勢，兩種色素含量在R72處理中分別顯著增加35.2%和19.1%。說明立枯絲核菌侵染高粱后顯著影響光合色素的含量，且隨發(fā)病嚴重度逐漸明顯。進一步分析接種后高粱幼苗葉片F(xiàn)v/Fm，且隨立枯絲核菌株接種時間的增加呈逐漸下降趨勢，在R24、R48和R72時較對照分別顯著下降了14.0%、42.3%和70.9%。由此可見，病菌侵染高粱會導致葉片最大PSⅡ的光能最大光化學效率下降。

2.3 立枯絲核菌接種對高粱幼苗葉片丙二醛含量和相對電導率的影響

與對照(R0)相比，處理組高粱葉片中MDA含量和相對電導率隨立枯絲核菌接種時間增加均呈逐漸上升趨勢，且在R24、R48和R72處理下均與對照差異顯著。其中MDA含量分別顯著上升了32.7%、128.8%和244.6%(圖2，A)，相對電導率分別相應顯著上升了72.0%、120.4%和149.1%(圖2，B)。可見，病菌侵染導致高粱膜質(zhì)發(fā)生氧化損傷、膜透性增大。

2.4 立枯絲核菌接種對高粱幼苗葉片超氧陰離子產(chǎn)生速率和過氧化氫含量的影響

總體來看，處理組高粱幼苗葉片內(nèi)活性氧含量隨病程的發(fā)展逐漸顯著增加。在R24、R48和R72處理下，超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率較對照分別顯著上升了109.7%、68.3%和140.4%(圖2，C)，過氧化氫含量則分別顯著上升了82.8%、147.0%、137.0%(圖2，D)。說明病菌侵染導致高粱幼苗體內(nèi)超氧陰離子自由基和過氧化氫含量顯著升高。

2.5 立枯絲核菌接種高粱幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

與對照(R0)相比，接種病菌高粱葉片中抗氧化酶活性隨病程的發(fā)展均發(fā)生了顯著變化，除POD外，SOD、CAT和APX活性變化趨勢相似，即都出現(xiàn)低于對照的處理點(圖3)。其中，SOD活性呈先上升后下降再上升的趨勢，R24和R72分別顯著增加了8.3%和16.5%，而R48顯著下降了11.3%(圖3，A)；POD活性呈先上升后下降的趨勢，但均不同程度地高于對照，在R24、R48和R72分別顯著上升了34.5%、63.8%和60.3%(圖3，B)；CAT和APX活性呈先下降后上升的趨勢，并均在R24處理下達到最低值，兩種酶活性在R12～R48時分別較對照顯著降低了9.1%～68.2%和44.2%～78.8%，在R72處理時較對照分別顯著增加了50.0%和36.5%(圖3，C、D)。由此可見，病菌接種致使高粱幼苗體內(nèi)抗氧化酶活性不同程度增強，用于清除ROS，維持體內(nèi)ROS穩(wěn)態(tài)，避免膜的氧化損傷。

2.6 立枯絲核菌接種對高粱幼苗葉片可溶性物質(zhì)含量的影響

與對照(R0)相比，隨病程的發(fā)展處理組高粱幼苗葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量均呈逐漸上升趨勢，且R24、R48、R72處理差異顯著(圖4)。其中，可溶性蛋白含量分別顯著上升了10.0%、14.3%和21.0%(圖4，A)，可溶性糖含量則分別顯著上升了73.4%、152.8%和216.7%(圖4，B)。表明病菌侵染引起高粱體內(nèi)蛋白和糖含量增加，以利于寄主抵御病菌侵染。

3 討論與結(jié)論

立枯絲核菌有較高的侵染性，當病原菌接觸感知植物信號，刺激菌體產(chǎn)生侵染結(jié)構(gòu)，并通過分泌蛋白實現(xiàn)穿透寄主植物表面，建立寄生關系的目標[17]。本研究以立枯絲核菌侵染高粱，在不同侵染時間考察高粱生長指標的變化，發(fā)現(xiàn)接種立枯絲核菌可致高粱植株產(chǎn)生病斑，阻礙高粱生物量積累，影響植株正常生長，且隨接種時間的延長危害加重。結(jié)合前人研究立枯絲核菌可減少光合色素含量，阻礙植物生物量積累[18-19]的結(jié)論，推測立枯絲核菌對植株生長的負面影響具有普遍性。

植物受病原菌侵染后會啟動體內(nèi)的抗病反應機制，植物體內(nèi)產(chǎn)生一系列復雜的生理生化變化，主要體現(xiàn)為一些防御酶活性發(fā)生變化。據(jù)報道，立枯絲核菌侵染大豆時，大豆植株體內(nèi)的超氧陰離子和H2O2水平呈現(xiàn)上升趨勢，隨后體內(nèi)一些防御酶POD、CAT和SOD等活性均明顯增強[20]；玉米接種立枯絲核菌后，其SOD活性表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢，而POD活性呈逐漸增加趨勢[21]。本研究結(jié)果表明，接種立枯絲核菌24 h后SOD、POD酶活性開始增強，說明此時植株體內(nèi)已積累過量活性氧，而APX和CAT酶活性隨接菌時間的增加均呈先下降后上升趨勢，可能是植株內(nèi)原有酶含量消耗到一定程度，刺激植株自身免疫系統(tǒng)，酶活增強，提高清除活性氧能力。同時，本研究中立枯絲核菌侵染高粱植株后，使植物發(fā)生膜脂氧化現(xiàn)象，導致MDA含量増加、膜結(jié)構(gòu)破壞，細胞內(nèi)液外流，這也是導致細胞浸出液電導率上升的直接原因，與立枯絲核菌在水稻方面的相關研究結(jié)果一致[22]。

前人研究表明，馬鈴薯接種立枯絲核菌后塊莖可溶性糖與可溶性蛋白含量發(fā)生顯著變化[23]，玉米紋枯病使葉片可溶性糖含量、總蛋白質(zhì)和總脯氨酸含量上升[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，當高粱幼苗受到立枯絲核菌菌絲侵染后，在侵染前期宿主體內(nèi)可溶性蛋白和可溶性糖含量增加，說明高粱植株受到立枯絲核菌侵染帶來的傷害時，以積累更多滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來保持細胞持續(xù)生長，保護抗氧化酶活性、維持細胞膜穩(wěn)定性。

綜上所述，接種立枯絲核菌可致高粱幼苗植株產(chǎn)生病斑，體內(nèi)活性氧過量積累，膜質(zhì)發(fā)生顯著氧化損傷；而宿主植株可積累更多可溶性糖和可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和刺激植株自身免疫系統(tǒng)，誘導宿主體內(nèi)抗氧化酶類SOD、POD、APX和CAT等活性增強，以維持高粱體內(nèi)活性氧代謝穩(wěn)態(tài)平衡，減少植物膜進一步氧化損傷。