3種粒型油莎豆種質(zhì)特性分析

李春鑫，王會偉，王 艷，劉玉蘭，陳道玉，楊鐵鋼*

(1 河南省農(nóng)業(yè)科學院 經(jīng)濟作物研究所，鄭州 450002； 2 河南工業(yè)大學 糧油食品學院，鄭州 450001；3 息縣農(nóng)業(yè)科學研究所，河南信陽 464300)

世界人口的不斷增長和社會生活水平的提高，使人類社會對食用植物油的消費需求日益增長，同時，世界范圍內(nèi)對低價生物柴油的需求也十分旺盛，這都要求油料作物必須保持產(chǎn)量水平的持續(xù)提高[1]。因此，亟需尋找一種可以快速提高油料產(chǎn)能的新途徑。油莎豆(CyperusesculentusL. var.satovus)，通用名‘虎堅果’(tigernut)，又名‘虎堅果莎草’(tigernut sedge)、‘鐵荸莽’、‘地下核桃’等，是目前已知植物中唯一在地下塊莖中大量積累油份的作物[1]。其產(chǎn)量高、易種易管、抗旱耐澇、邊際土壤適應性強，營養(yǎng)價值豐富[1]，既可食用也可用作生物燃料，是較為理想的作物類型[2]。油莎豆在植物學上屬于單子葉綱莎草科莎草屬多年生草本植物[1]，廣泛分布于熱帶、溫帶和寒帶，屬于C4型植物[3]，在農(nóng)業(yè)上被用作一年生作物，在中國黃淮地區(qū)生育期約130～150 d。

油莎豆通過地下匍匐莖(后面統(tǒng)稱為莖豆)膨大收獲經(jīng)濟產(chǎn)量，其莖豆含20%～40%淀粉、20%～36%油、15%～20%糖、5%～9%蛋白質(zhì)和6%～10%纖維[1, 4]，在非洲部分國家一直被作為重要營養(yǎng)食物來源之一[1]。研究顯示油莎豆莖豆中含有高水平的磷、鐵和鉀，以及維生素E和C[5]。油莎豆莖豆有生吃、榨油、面粉全食和制作成豆奶等多種食用方式，其中，以油莎豆為主原料的飲料在西班牙和西歐廣受歡迎[6]。油莎豆莖豆中含有大量的糖分，可用作冰淇淋、餅干、沙拉、湯、酸奶、糖果、嬰兒食品、保健棒、面包、蛋糕和其他食品的調(diào)味劑[7]。有研究表明，油莎豆莖豆具有疏肝、通氣、健脾和健胃功效，在促進血液循環(huán)，減少心血管疾病和心臟病發(fā)作，防止中風和呼吸道炎癥，治療腸胃脹氣和降低患結(jié)腸癌風險等方面也有較高的藥用潛力[1,6]。

莎草科物種普遍存在后減數(shù)分裂行為及染色體的分裂和融合[8]。油莎豆染色體數(shù)目的研究結(jié)果也存在爭議。有報道認為它的基本染色體數(shù)目(n)是54或108[8]，但有學者先后得出油莎豆種內(nèi)染色體數(shù)目為18、108和206等不同結(jié)論[8-9]。中國的油莎豆經(jīng)過多次國外引種和國內(nèi)各省份間交換，目前保存的種質(zhì)來源復雜，背景不明，其染色體數(shù)目和倍性研究基本處于空白狀態(tài)，嚴重阻礙了油莎豆品種的遺傳改良和基礎研究工作的深入開展。

莖豆是油莎豆核心經(jīng)濟價值部位，從莖豆形態(tài)上，可以分為中長、中圓及大粒型3類。本研究選用‘豫油莎2號’(中圓粒)、‘豫油莎3號’(中長粒)和‘YYS-4’(大粒)3種粒型油莎豆材料，通過分析株高、分蘗、粒重、單株結(jié)豆數(shù)、光合特性等形態(tài)性狀和品質(zhì)性狀，明確了中國油莎豆種質(zhì)的形態(tài)學和品質(zhì)性狀特點。利用染色體制片、熒光染色和端粒探針熒光原位雜交技術(shù)，首次對中國3種粒型油莎豆材料的染色體數(shù)目進行了解析，其結(jié)果對于促進中國油莎豆細胞學的發(fā)展，加快中國油莎豆資源的應用和基礎研究具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 供試材料

3種不同粒型油莎豆材料‘豫油莎3號’(圖1，A)、‘豫油莎2號’(圖1，B)、‘YYS-4’(圖1，C)均由河南省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所油莎豆育種研究室選育和提供。供試材料各選取5粒莖豆，以單粒播的方式種植于沙壤土中，在植株長至成熟后，測定每個材料的形態(tài)學相關(guān)性狀，測定性狀有：株高(自地面量至最高葉片頂端)、分蘗數(shù)(分蘗高度大于25 cm)、葉長(主分蘗最長葉片自葉環(huán)至葉尖1/3處寬度)、葉寬(主分蘗最長葉片自葉環(huán)至葉尖1/3處寬度)、單粒重(單株莖豆總重/單株總粒數(shù))、粒色、粒長(挑選10粒飽滿的莖豆，總長度/10)、粒寬(挑選10粒飽滿的莖豆，總寬度/10)及結(jié)實集中度(重量大于等于平均單粒豆重的粒數(shù)/總粒數(shù))。性狀測定結(jié)果去掉最高和最低值，剩余3個值取平均數(shù)作為該性狀測定值。

1.2 供試材料品質(zhì)性狀測定

取3個供試材料的莖豆200 g左右，送至農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試鄭州分中心進行品質(zhì)性狀測定，蛋白質(zhì)、總灰分、含油量、淀粉、可溶性糖測定分別依據(jù)標準GB5009.5-2016、GB5009.4-2016、NY/T1285-2007、GB5009.9-2016和GB/T37493-2019進行檢測。

1.3 光合性狀測定

在晴天條件下選取3個供試材料，每個材料選取5株長勢、葉片著生部位、葉面積大小和朝向基本一致的主莖葉片，測定葉綠素熒光參數(shù)和光合參數(shù)，剔除最高和最低值，剩余3株數(shù)據(jù)取平均值作為測定結(jié)果。測定時盡量測定葉片中部并避開葉片的主脈。葉綠素熒光參數(shù)測定使用FMS-2脈沖調(diào)制式熒光儀(Hansatech, UK)，光合作用測定使用CIRAS-3便攜式光合熒光測定儀(美國PP Systems公司)，以上兩種設備測定時嚴格按照儀器使用說明書進行操作。

1.4 染色體數(shù)目分析

1.4.1 材料處理選用來自同一單株的成熟、飽滿莖豆，統(tǒng)一浸種72 h，每6 h換水一次，待莖豆萌動露白后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，進行生根培養(yǎng)(底部鋪設雙層濾紙)，待莖豆芽點基部生出白色的吸水根時，即可進行取樣制片。所有材料試驗均在20～22 ℃培養(yǎng)箱中進行，所有材料均設置生物學重復試驗3次。

1.4.2 染色體制片和計數(shù)主要參考Han等[10]的方法，并根據(jù)油莎豆的莖豆生長特點進一步優(yōu)化后制定，具體的方法為：(1)待樣品根尖長度達到2～3 cm時進行剪根。剪根前，事先準備0.5 mL頂端扎孔的離心管，并在實驗前將管內(nèi)用水潤濕。將剪下的根尖放入管中插入冰內(nèi)；(2)將裝有根尖的離心管放置于充氣罐內(nèi)，充入0.9～1.0 MPa的N2O，靜置處理2 h；(3)在冰浴條件下，將90%預冷冰乙酸加入離心管內(nèi)，靜置處理10 min，用膠頭滴管將冰乙酸吸出，并用ddH2O進行2次清洗；(4)用刀片將根尖白色部分切下，放入裝有25 μL酶液的0.5 mL離心管中。酶液為纖維素酶與果膠酶3∶1混合，酶解在37 ℃水浴條件下進行1 h(具體時間可根據(jù)根尖大小調(diào)整)；(5)用70%的酒精將根尖清洗3次，并用解剖針將根尖在剩余酒精中充分破碎和震蕩，4 000 r/min離心，將細胞離心至管底后，通過倒置和晾干將剩余酒精從離心管中移除；(6)根據(jù)根尖數(shù)量，在離心管內(nèi)加入25～45 μL冰乙酸，瞬時離心后，充分震蕩混勻。將潔凈的載玻片放置在預先準備的濕潤的盒子中，室溫保持在23 ℃左右。從離心管中吸取8 μL細胞懸浮液，在距離載玻片一定距離的正上方滴下，隨后立即將盒子蓋上，直到細胞散開，載玻片晾干后取出；(7)將染色體標本在普通光學顯微鏡或相差顯微鏡下進行鏡檢，找到目標分裂相保存?zhèn)溆?，在避光狀態(tài)下，滴加熒光染料DAPI，加上蓋玻片，用指甲油將蓋玻片四周封固，備用；(8)用熒光顯微鏡觀察染色體數(shù)目和核型。確定每個染色體數(shù)目時，所觀察的分裂相數(shù)目不低于20個。

1.5 端粒熒光雜交試驗

根據(jù)Tang等[11]方法，利用端粒特異性探針Telo對油莎豆材料有絲分裂中期染色體進行熒光原位雜交試驗。端粒特異性探針Telo(TTTAGG-GTTTAGGGTTTAGGG)由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用6-carboxyfluorescein (6-FAM)對探針序列進行綠色熒光標定，其合成按照Lang等[12]報道的方法。 由于細胞會在試驗過程中出現(xiàn)破碎和解體情況，DAPI雜交和端粒雜交試驗可能會用樣本不同的細胞開展。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)的顯著性分析采用軟件SPSS(20.0)的最小顯著性法(LSD)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種油莎豆主要農(nóng)藝性狀比較

3個材料粒色均為深棕色，其他形態(tài)學性狀測定的表型見表1。產(chǎn)量直接相關(guān)的分蘗數(shù)、單粒重和單株結(jié)豆數(shù)3個性狀在材料間的差異顯著。其中，‘豫油莎3號’分蘗數(shù)最高，分別是‘豫油莎2號’的2.1倍、‘YYS-4’的1.5倍；‘YYS-4’的單粒重則最高，是其他兩個材料的2倍以上；單株結(jié)豆數(shù)‘豫油莎3號’達245個，分別是‘豫油莎2號’、‘YYS-4’的1.3倍和1.6倍；粒長和粒寬屬于單粒重的亞性狀，在3個材料間的表現(xiàn)與粒重基本一致，并均以‘YYS-4’最高，‘豫油莎2號’粒寬高于‘豫油莎3號’，但粒長值則相反。其他性狀均以‘豫油莎2號’的檢測值為3個材料中最高。

2.2 3種油莎豆主要品質(zhì)相關(guān)性狀比較

3個油莎豆的品質(zhì)性狀見表2。其中，蛋白質(zhì)含量以‘YYS-4’最高(7.63%)，‘豫油莎2號’最低(4.70%)；油分含量以‘豫油莎2號’最高，達32.00%，‘豫油莎3號’和‘YYS-4’基本相同；淀粉含量在3份供試材料中都在30%以上，其中‘YYS-4’最高，達36.7%；可溶糖含量以‘豫油莎3號’最高(21.30%)，‘YYS-4’也表現(xiàn)出較高的糖分含量(19.28%)；總灰分含量以‘豫油莎2號’最高(4.40%)，‘YYS-4’最低(1.80%)。

2.3 3種油莎豆主要光合特性比較

葉綠素熒光測定結(jié)果顯示(表3)，‘豫油莎2號’的最大光化學效率(Fv/Fm)最高(0.800)，顯著高于‘豫油莎3號’和‘YYS-4’(分別為0.783和0.778)；實際光量子效率(PS Ⅱ)以‘豫油莎2號’最高，為0.739；熱耗散能力即非光化學淬滅系數(shù)(NPQ)以‘豫油莎2號’最小(1.129)，‘YYS-4’最高(1.416)；電子傳遞效率(ETR)在 3個材料差異較小。

3個油莎豆材料光合性能表現(xiàn)為：胞間 CO2濃度(Ci)以‘豫油莎2號’最低(293.00 μmol·mol-1)，‘YYS-4’材料最高(336.25 μmol·mol-1)；3個材料的氣孔導度(Gs)變幅為261.67～338.50 mmol·mol-1，并以‘YYS-4’最大、‘豫油莎2號’最?。蝗~片凈光合速率(Pn)以‘豫油莎2號’最高(18.17 μmol·m-2·s-1)，‘YYS-4’材料最低(15.13 μmol·m-2·s-1)；蒸騰速率(Tr)和水分利用率(WUE)是相互關(guān)聯(lián)的2個參數(shù)，‘豫油莎2號’和‘豫油莎3號’的蒸騰速率較低，相對應的水分利用率均顯著高于‘YYS-4’。

2.4 3種油莎豆染色體數(shù)目比較

3份供試材料根尖有絲分裂中期細胞染色體壓片和DAPI熒光染色的結(jié)果顯示，3個材料的染色體數(shù)目均為156條，長度為0.5～1.2 μm(圖2)，3種材料的生物學重復試驗結(jié)果也均無差別。

表1 3種粒型油莎豆材料的主要農(nóng)藝性狀

表2 3種粒型油莎豆材料的品質(zhì)性狀

表3 3種粒型油莎豆材料的光合性狀

為了進一步確認DAPI染色結(jié)果，對3份供試材料根尖的有絲分裂中期細胞染色體進行端粒序列熒光原位雜交。結(jié)果顯示，‘豫油莎3號’、‘豫油莎2號’和‘YYS-4’的染色體數(shù)目均為156條(圖3)，與DAPI染色后計數(shù)的結(jié)果相同。生物學重復試驗結(jié)果也完全一致。由此，確認3份供試材料染色體數(shù)目相同，且均為156條。

3 討 論

油莎豆起源于非洲[1]，20世紀50年代中國將其作為油料作物引入國內(nèi)。有正式記載的引種分別是1952年的前蘇聯(lián)、1960年的保加利亞和20世紀70年代的朝鮮大粒類型[2]，中國的油莎豆種質(zhì)經(jīng)過數(shù)十年的種質(zhì)交流和自留種，各省、地區(qū)油莎豆材料的來源和譜系資料混亂。目前，油莎豆尚未發(fā)現(xiàn)可用的雜交種，相比可雜交的其他植物，油莎豆育種更加依賴現(xiàn)有種質(zhì)資源的初始綜合農(nóng)藝性狀。從地上部形態(tài)看，油莎豆葉型基本分為寬葉、細葉兩種類型；粒色共有黃、棕、黑、紅共4種顏色[13]，中國現(xiàn)有資源以棕色和黃色占絕大多數(shù)，少數(shù)資源呈現(xiàn)黑色和紅色。而與產(chǎn)量直接相關(guān)的粒型性狀可分為中長粒、中圓粒、大粒3種類型，本研究對3種粒型油莎豆的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)分析可為今后的育種和應用提供參考。

3種材料的多個形態(tài)學性狀和品質(zhì)性狀差異顯著。其中，‘YYS-4’材料單株產(chǎn)量水平最高(297 g)，‘豫油莎2號’和‘豫油莎3號’分別為113.46 g和90.65 g；‘豫油莎3號’是典型的細葉、多分蘗類型材料，‘豫油莎2號’則表現(xiàn)為典型的寬葉型材料。從品質(zhì)方面看，‘豫油莎3號’可溶糖達到了21.30%，是高糖型品種，‘豫油莎2號’和‘YYS-4’材料分別是高油型和高淀粉型材料。

光合作用是植物的生命之源，能較好地說明該物種對光、溫、水氣等環(huán)境資源的轉(zhuǎn)化效率[14]。本研究結(jié)果顯示，‘豫油莎2號’在光合參數(shù)方面表現(xiàn)較為突出，其葉片凈光合速率在3類粒型中最高，顯示了該材料較高的產(chǎn)量潛力。目前，油莎豆的光合相關(guān)性狀研究國內(nèi)外正式報道較少，本結(jié)果可為后續(xù)的相關(guān)研究提供參考。

Roalson[8]對莎草科的31屬851種的染色體數(shù)目研究進行了匯總，發(fā)現(xiàn)莎草科物種存在明顯的種內(nèi)染色體數(shù)目差異，31屬851種中，共發(fā)現(xiàn)4 231個不同的單倍體染色體數(shù)目，莎草科不同種的單倍體染色體數(shù)目中頻率最高的是30、28和29，其次為5、10、20和35，最高的為114條。莎草屬不同種間的單倍體染色體數(shù)分布較為分散，在8、18、32、36、40、48、52、54和56處相對集中，數(shù)目最少為6條，最多為114條[8，15-19]。油莎豆種內(nèi)同樣存在不同染色體條數(shù)的報道[8]，其中，Heiser[20]報道了一種二倍體油莎豆具有108條染色體；Suzuka等[21]發(fā)現(xiàn)了染色體數(shù)為18的二倍體材料；有的研究報告則認定其獲得的油莎豆染色體數(shù)目為208條，同時也鑒定了單倍體的染色體為104條[8]；Rath等[8,22]報道了其發(fā)現(xiàn)的兩種材料的單倍體染色體數(shù)均為54條；Mulligan等[23]在加拿大的安大略發(fā)現(xiàn)了一種n=48的油莎豆材料。然而，Zonneveld認為以上各報道的油莎豆染色體數(shù)目結(jié)果的準確性仍有待進一步商榷[9]。本研究通過DAPI染色和端粒探針熒光原位雜交兩種方法確認了中國現(xiàn)有3種粒型油莎豆材料的染色體數(shù)目均為156條，這一結(jié)果與前人報道不同。其原因可能有：(1)油莎豆為無性繁殖植物，發(fā)生染色體自然加倍、著絲粒斷裂、融合等的突變后的個體相比有性繁殖植物更容易存活，經(jīng)過長期固化、繁衍后產(chǎn)生了多樣性豐富的染色體數(shù)目類型；(2)種內(nèi)突變株的衍生使油莎豆資源產(chǎn)生明顯的地域分化，各國學者研究選用的研究材料本身來源不同，造成了結(jié)果的差異。確切的結(jié)論需要今后更多的試驗數(shù)據(jù)給予證實。