散發(fā)性腦動靜脈畸形KRAS突變及其與臨床特征的關(guān)系

李昊，許宏遠，押小龍，曹勇，2

腦動靜脈畸形（brain arteriovenous malformation，BAVM）臨床表現(xiàn)多樣，其中顱內(nèi)出血是其最嚴重也是最常見的癥狀[1]。在BAVM中，顱內(nèi)出血的年發(fā)病風險為2%～4%，相關(guān)死亡率約為10%[2-3]。針對散發(fā)性BAVM的研究發(fā)現(xiàn)BAVM組織中存在Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）激活型體細胞突變，突變率在28.5%～76.2%不等[4-8]，提示KRAS基因突變可能與BAVM的發(fā)生、發(fā)展存在一定關(guān)聯(lián)。此外，KRAS突變是否與BAVM的臨床特征有關(guān)還尚不清楚。因此，有必要進一步探究KRAS突變與BAVM發(fā)生之間的關(guān)系以及這些突變與患者臨床特征的關(guān)聯(lián)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究采用回顧性分析的方法，連續(xù)納入2017-2019年就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科的BAVM患者。納入標準：①經(jīng)過DSA或CTA診斷為BAVM；②患者或家屬簽署知情同意并接受外科手術(shù)治療；③無BAVM家族史；④切除的病變部位進行了福爾馬林固定和石蠟包埋（formalin-fixation and paraffin-embedding，F(xiàn)FPE）處理且樣本保存良好。排除標準：①未接受手術(shù)治療；②接受外科手術(shù)治療但是不能獲取組織標本或標本未達到檢測標準；③家族性BAVM。

BAVM的診斷是依據(jù)DSA發(fā)現(xiàn)動靜脈畸形團和動靜脈分流，并且經(jīng)過病理學(xué)檢查確診。從病歷資料中提取相關(guān)數(shù)據(jù)，包括入院年齡、性別、首發(fā)癥狀（包括腦出血、癲癇、頭痛、其他等）。根據(jù)術(shù)前頭顱MRI判讀BAVM的位置、最大直徑（矢狀位）、體積[計算公式：（長×寬×高）/2]。

1.2 DNA檢測 從5 μm的FFPE組織切片中提取DNA。將顯微組織切片與組織裂解緩沖液（Qiagen，Hilden）混合后，在98 ℃下熱處理15 min，然后在56 ℃下用蛋白酶K消化3 d。采用DNeasy組織血液試劑盒（DNeasy tissue and blood k it，Qiagen）提取DNA。使用NanoDrop ND-1000熒光光譜儀（NanoDrop，Wilmington，DE）對提取的DNA進行定量測定。通過PCR擴增KRAS的指定區(qū)域（檢測位點為chr12：25398284）。KRAS的PCR引物是使用Primer 3軟件的修改版本設(shè)計的，引物序列如下：正向，GGTCCTGCACCAGTAATATGC；反向，ATTAACCTTATGTGTGACATGTTC。用該引物擴增170～240 bp之間的產(chǎn)物。使用2步方案進行PCR擴增，在單個Hiseq泳道中將所有批次樣品的PCR產(chǎn)物一起測序。最后產(chǎn)物進一步進行超深度測序，使用之前開發(fā)的LEMONADE流程過濾篩選合格數(shù)據(jù)并檢測KRAS基因位點突變[9]。

1.3 統(tǒng)計分析 采用 Python 3.8進行統(tǒng)計分析，連續(xù)性變量符合正態(tài)分布，采用表示。分類變量采用例數(shù)和率表示，若分類表格中有頻數(shù)＜5，則采用Fisher確切概率，否則采用Pearsonχ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點 本研究共納入145例BAVM患者，均為漢族，其中男性94例，女性51例，年齡3～61歲，以腦出血為首發(fā)癥狀者居多（48.3%）。只有1例患者在BAVM切除術(shù)前接受了血管內(nèi)部分栓塞治療（表1）。

表1 臨床特征數(shù)據(jù)匯總

2.2KRAS突變檢測 145例樣本中有63例有KRAS體細胞突變，其中41例（28.3%）樣本檢測到c.35G→A（G12D）突變，14例（9.7%）樣本檢測到c.35G→T（G12V）突變。此外，還發(fā)現(xiàn)了其他研究很少報道的幾種KRAS突變，包括c.34G→T（G12C）突變8例（5.5%）、c.34G→A（G12S）突變7例（4.8%）、c.35G→C（G12A）突變2例（1.4%）、c.34G→C（G12R）突變1例（0.7%），其中有8例（5.5%）樣本包含1個以上的KRAS突變體。

2.3KRAS突變與BAVM臨床特征的關(guān)系KRAS突變組（63例）和非突變組（82例）的性別、年齡、首發(fā)癥狀（包括腦出血、癲癇、頭痛等）、病灶最大直徑、病灶體積之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

表2 KRAS突變組與無突變組臨床特征比較

3 討論

KRAS屬于大鼠肉瘤病毒癌基因（rat sarcoma viral oncogene，RAS）家族，RAS是一種鳥苷三磷酸酶（guanosine triphosphatases，GTPase）開關(guān)信號蛋白，可以與鳥苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）和鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）相結(jié)合，調(diào)控自身活動狀態(tài)。RAS基因突變會破壞鳥嘌呤切換周期，并將RAS蛋白“鎖定”在與GTP結(jié)合的功能狀態(tài)，從而激活下游信號通路[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)KRAS突變發(fā)生于BAVM組織的內(nèi)皮細胞，主要通過激活腦血管內(nèi)皮細胞中的有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號通路損傷內(nèi)皮細胞連接[4]。

散發(fā)性BAV M的發(fā)病機制目前尚不清楚，但是最近的一項研究發(fā)現(xiàn)74%（29/39）的病例存在KRAS激活型體細胞突變[4]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，在小鼠內(nèi)皮細胞中轉(zhuǎn)入Kras突變基因能誘發(fā)BAVM，提示KRAS體細胞突變可能是BAVM發(fā)生的原因之一，而且僅KRAS基因的突變就足以在體內(nèi)引發(fā)BAVM，提示KRAS突變與BAVM的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[12]。內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是BAVM的重要病理特點，有研究顯示KRAS突變可導(dǎo)致內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，推測內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化可能是KRAS突變導(dǎo)致BAVM形成的機制或因素之一[9]。

由于檢測技術(shù)、樣本類型、測序深度和患者種族等不同，不同研究所報告的KRAS突變率存在一定差異。Nikolaev等[4]使用全外顯子測序技術(shù)檢測突變頻率，將讀長超過0.5%的KRAS變異定義為突變閾值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)46.2%（12/26）的BAVM患者存在相應(yīng)變異，而采用微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）檢測，發(fā)現(xiàn)74.4%（29/39）的BAVM患者存在KRAS突變。研究者分析突變率差異的原因可能是由于讀長在基因組上的異質(zhì)性分布使得特定KRAS點上的讀長覆蓋度較低，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，而ddPCR能夠檢出＞0.1%突變閾值的基因，檢測的準確性相對較高[13]，另外，材料（包括新鮮樣品和FFPE樣品）的差異也可能影響KRAS突變的檢測結(jié)果[12，14]。本研究在比既往研究更大的樣本量中測定KRAS突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)43.4%（63/145）的BAVM患者存在KRAS突變，與既往研究數(shù)據(jù)相似。另外，本研究發(fā)現(xiàn)G12D突變是最常見的突變類型，也與既往多數(shù)研究一致[4-5，9]。此外，在本研究樣本量較大的優(yōu)勢下，還發(fā)現(xiàn)了一些罕見報道的新的突變類型，如G12C和G12A。值得注意的是，針對G12C突變抑制藥物的試驗成功，提示KRAS等位基因特異性突變靶向治療的有效性[15-16]，本研究發(fā)現(xiàn)的一系列KRAS突變類型，為研發(fā)靶向突變藥物提供了可能的位點信息。

有多項研究探討了KRAS突變與BAVM患者臨床特征之間的關(guān)系[5，7]，但目前結(jié)論不一致。有研究者發(fā)現(xiàn)KRAS突變的病例多以出血為首發(fā)癥狀，還有研究者發(fā)現(xiàn)基因（包括KRAS和BRAF）的變異頻率與腦和脊髓動靜脈畸形病灶的體積呈負相關(guān)[5]。本研究未發(fā)現(xiàn)患者的臨床特征如性別、年齡、腦出血、癲癇、病變最大直徑和體積等指標與KRAS基因突變的關(guān)聯(lián)，可能與研究的入選標準、病理取材、檢測方式、樣本量差異等原因有關(guān)。

本研究存在以下不足：首先，本研究中的病變樣本是經(jīng)過FFPE處理的BAVM組織，可能會導(dǎo)致基因檢測的準確性下降；其次，本研究僅在KRAS的突變熱點（chr12：25398284）附近擴增基因，可能錯過其他KRAS突變的位點；再次，本研究未針對發(fā)現(xiàn)的不同突變類型進一步分析其與臨床特點的關(guān)系。后續(xù)應(yīng)進行前瞻性、更多樣本量的深入研究來探索KRAS突變與BAVM的病理機制、臨床表現(xiàn)的關(guān)系。

【點睛】本研究在較大樣本量FFPE處理的BAVM組織中發(fā)現(xiàn)KRAS突變較常見，除了既往常見的突變位點G12D和G12V外，還發(fā)現(xiàn)了既往少見報道的突變位點，特別是G12C和G12A，為研發(fā)靶向突變藥物提供了可能的位點信息。