基于宏基因組測序的四川麩醋醋醅微生物組和風味形成相關基因分析

劉愛平 吳潔 王玉婷 澤仁德西 陳冉 鄧明琴 李琴 李建龍 敖曉琳 陳蓉 劉書亮

摘要： 四川麩醋因風味獨特而備受消費者青睞，醋醅中微生物組與麩醋的風味密切相關。本研究旨在基于宏基因組測序技術揭示醋醅的微生物組和風味形成相關基因。結果表明，醋醅中的微生物隸屬于70個門、885個屬和3 168 個種，優(yōu)勢菌包括金山乳桿菌、耐酸乳桿菌、耐熱芽孢桿菌和巴氏醋桿菌等。在COG數據庫中注釋到8 656 個COG功能單元，在KEGG數據庫中注釋到43個KEGG通路，氨基酸代謝、碳水化合物代謝是醋醅微生物發(fā)酵的主要代謝功能。從醋醅樣品中檢測到223個不同的碳水化合物活性酶，其中糖基轉移酶豐度最高（reads數占比為37.09%）;各氨基酸代謝途徑之間的主要基因、酶存在較大差異;醋醅基因組中包含編碼轉氨、脫羧和脫氫等作用的基因，具備通過氨基酸代謝形成風味物質的基礎。研究結果為闡明四川麩醋醋醅微生物組，揭示風味形成機制提供了參考。

關鍵詞： 四川麩醋; 醋醅; 宏基因組; 微生物組

中圖分類號： TS26;S188 + .4?? 文獻標識碼： A?? 文章編號： 1000-4440（2022）03-0806-07

Microbiota and flavor formation-related genes of Sichuan bran vinegar ?Pei ： insights from metagenome

LIU Ai-ping1， WU Jie1， WANG Yu-ting1， ZEREN De-xi1， CHEN Ran1， DENG Ming-qin1， LI Qin1，LI Jian-long1， ?AO Xiao-lin1， CHEN Rong2， LIU Shu-liang1

（1. College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China; 2.Sichuan Baoning Vinegar Co.， Ltd.， Langzhong 637400， China）

Abstract： Sichuan bran vinegar has unique flavor and is favored by consumers. The microbiota in vinegar ?Pei ?is closely related to the flavor of bran vinegar. This study aims to reveal the microbial composition and flavor formation-related genes of vinegar based on metagenomic sequencing technology. The results indicated that the microorganisms in vinegar ?Pei ?belonged to 70 phyla， 885 genera， and 3 168 species， and the dominant bacteria included ?Lactobacillus jinshani ， ?Lactobacillus acetotolerans ， ?Bacillus sporothermodurans ， and ?Acetobacter pasteurianus . 8 656 COG functional units were annotated in the COG database， and 43 KEGG pathways were annotated in the KEGG database. Amino acid metabolism and carbohydrate metabolism were the main metabolic functions of microbial fermentation in vinegar ?Pei . 223 different carbohydrate-active enzymes were detected， and the abundance of glycosyltransferase was the highest， accounting for 37.09%. The main genes and enzymes in amino acid metabolic pathway were quite different. Genes encoding amino acid aminotransferase， decarboxylation and dehydrogenase were found in vinegar ?Pei ?genome， possessing the basis for flavor development through amino acid metabolism. The results provide a reference for elucidating the microbiota and flavor formation mechanism of Sichuan bran vinegar.

Key words： Sichuan bran vinegar; vinegar ?Pei ; flavor; metagenome; microbiota

食醋是單獨或混合使用各種含有淀粉與糖的物料、食用乙醇經微生物發(fā)酵釀制而成的液體酸性調味品（GB 2719-2018《食品安全國家標準 食醋》），具有誘人的顏色、風味和功能特性 [1] 。每個國家和地區(qū)均有各自獨特的食醋產品，如歐美國家以水果為原料生產的果醋和東亞國家以谷物為原料生產的谷物醋 [2] 。食醋釀造在中國已有兩千多年的歷史，形成了以山西老陳醋、鎮(zhèn)江香醋、四川保寧醋、福建永春老醋為代表的中國四大名醋 [3] 。傳統(tǒng)食醋釀造主要分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩大類，由于前者風味更佳，因此中國食醋釀造多采用固態(tài)發(fā)酵方式生產 [4-5] 。

保寧醋是四川麩醋的典型代表，而風味是評價麩醋品質的重要指標。隨著現代分析技術的發(fā)展，基于GC-MS（氣相色譜-質譜儀）、GC-O（氣相色譜-嗅聞儀）、氨基酸自動分析儀、高效液相色譜等技術 [6-8] 的食醋風味研究越來越深入。發(fā)酵食品的風味形成與發(fā)酵過程中微生物的演替息息相關，研究者常采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法或免培養(yǎng)法與高通量測序技術相結合的方法來研究發(fā)酵食醋過程中微生物的動態(tài)變化 [9-11] 。宏基因組測序可以系統(tǒng)展示發(fā)酵體系的微生物基因組信息，并可輔助開展功能及代謝通路的分析，便于挖掘菌群的生物多樣性、群落結構、功能特性及其相互關系 [12-14] 。Lu等 [15] 基于宏基因組和克隆文庫分析了乙偶姻合成機制，Wu等 [16] 基于宏基因組測序技術分析了鎮(zhèn)江香醋的風味代謝途徑，但是目前鮮有關于宏基因組測序技術用于四川麩醋的研究。本研究基于宏基因組測序技術分析了四川麩醋醋醅的微生物組成及其主要代謝通路，并注釋其風味形成的功能基因，以期為四川麩醋風味形成機制及品質提升提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 四川麩醋醋醅的采樣與處理

參考Liu等 [8] 報道的方法進行醋醅采樣，隨機選擇四川保寧醋有限公司一個剛完成發(fā)酵的發(fā)酵池，在發(fā)酵池前、中、后段的上、中、下層共取9個點，取出醋醅充分混勻，通過四分法舍去多余醋醅后，將200 g醋醅樣品收集于無菌自封袋中，當天運回實驗室（冰盒中保溫），于-80 ℃ 保存。稱取25 g醋醅置于含有200 ml無菌生理鹽水的三角瓶內，低速振蕩15 min（100 r/min ）后在超凈工作臺內用無菌的4層紗布過濾，收集濾液，于300 r/min 離心5 min，收集上清液;于10 000 ?r/min 高速離心5 min，收集沉淀，將沉淀用無菌生理鹽水洗滌3次;將所得沉淀分裝于1.5 ml 離心管中，于-80 ℃ 保存。

1.2 醋醅總DNA的提取

稱取0.5 g醋醅，按照FastDNA土壤試劑盒（FastDNA SPIN Kit for Soil，美國MP Biomedicals公司產品）說明書步驟提取醋醅總DNA，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行宏基因組測序。

1.3 生物信息學分析

（1）數據拼接?；贖iseq原始測序數據，使用fastp軟件進行數據質量控制，獲得高質量reads。使用Megahit拼接軟件對序列進行拼接組裝，選擇最優(yōu)組裝結果。（2）非冗余基因集的構建。用MetaGene對拼接結果進行開放閱讀框（ORF）的預測，用CD-HIT軟件進行聚類，用SOAPaligner軟件分別將高質量reads與非冗余基因集進行比對（默認參數為95%相似度），統(tǒng)計基因在對應樣品中的豐度信息。（3）數據庫注釋。使用BLASTp將非冗余基因集與NR數據庫、eggNOG數據庫、KEGG數據庫進行比對，完成豐度和功能注釋。（4）統(tǒng)計分析和作圖。用R軟件完成。

以上生物信息學分析均依托美吉生物云平臺（www.majorbio.com）。

2 結果與分析

2.1 微生物群落結構

提取醋醅樣品基因組，經宏基因組測序和去除低質量數據后，得到醋醅樣品的基因組全長為66 379 836 ?bp，包含101 448 條序列。對醋醅基因組進行物種注釋，共鑒定出來自70個門、118個綱、199個目、334個科、885個屬和3 168個種的醋醅微生物，其中相對含量大于1%的優(yōu)勢菌群在屬、種水平上的數量分別為5個（圖1a）、8個（圖1b）。

優(yōu)勢菌屬包括乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、醋酸桿菌屬、駒形桿菌屬和類芽孢桿菌屬，前三者的相對豐度最高，分別為71.0%、9.3%和8.4%。相對含量大于1.0%的優(yōu)勢菌種包括金山乳桿菌、耐酸乳桿菌、耐熱芽孢桿菌、巴氏醋桿菌、果實醋桿菌、嗜熱淀粉芽孢桿菌、未分類的芽孢桿菌科芽孢桿菌屬菌株和枯草芽孢桿菌，前三者的相對豐度最高，分別為62.0%、7.9%和2.8%。綜上可見，乳桿菌是醋醅樣品中占比最高的優(yōu)勢菌種，這與聶志強等 [17] 關于天立獨流老醋的研究結果類似。

金山乳桿菌是具有異型乳酸發(fā)酵特性的革蘭氏陽性、兼性厭氧菌株，由Yu等 [18] 首次從鎮(zhèn)江香醋固態(tài)發(fā)酵過程中分離得到，該菌也廣泛存在于白酒釀造產物中 [19] 。耐酸乳桿菌是白酒糟醅發(fā)酵過程中一種較具優(yōu)勢的菌 [20] ，易從谷物醋中分離得到。巴氏醋桿菌是食醋工業(yè)中應用得最廣泛的醋酸菌，能夠在有氧條件下將乙醇轉化為乙酸。

2.2 數據庫注釋分析

2.2.1 COG數據庫注釋分析 將測序數據與EggNOG數據庫進行比對，獲得各基因對應的COG注釋概況（圖2），共鑒定到8 656 個COG功能單元，這些功能單元分屬于23個主要的功能大類。其中基因數排名前10的功能類別是轉錄，碳水化合物轉運和代謝，復制、重組和修復，氨基酸轉運和代謝，細胞壁/膜/包膜生物合成，無機離子轉運和代謝，能量產生和轉換，次級代謝物生物合成，翻譯后修飾、蛋白質周轉、分子伴侶，輔酶轉運和代謝;對應的基因數分別是448個、370個、355個、265個、254個、228個、202個、148個、144個和135個。從測序reads的豐度看，排名前5名的功能類別是未知功能類，復制、重組和修復，氨基酸轉運和代謝，翻譯、核糖體結構和生物合成，碳水化合物轉運和代謝。

2.2.2 KEGG數據庫注釋分析 由圖3可以看出，醋醅中的20 626 032 個reads匹配到KEGG數據庫中6類共44個KEGG通路，其中reads最多的10個KEGG通路為碳水化合物代謝、氨基酸代謝、翻譯、輔因子和維生素代謝、復制和修復、膜運輸、核苷酸代謝、能量代謝、脂質代謝和信號轉導。碳水化合物代謝、氨基酸代謝和翻譯通路對應的reads數分別為1 717 454 個、1 364 306個 和1 107 840 個。該注釋結果中與食醋風味成分形成密切相關的碳水化合物代謝和氨基酸代謝是主要的代謝活動，與COG數據庫注釋結果相符。四川麩醋醋醅中碳水化合物代謝、氨基酸代謝和翻譯通路對應的reads數與Wu等 [16] 關于鎮(zhèn)江香醋的研究結果相近，且遠高于Wu等 [21] 關于山西老陳醋的報道，但四川麩醋、鎮(zhèn)江香醋和山西老陳醋醋醅中碳水化合物代謝和氨基酸代謝對應的reads數占比均最高。

2.2.3 基于CAZy數據庫的碳水化合物活性酶分析 碳水化合物是微生物重要的能源和碳源。COG、KEGG數據庫注釋結果均表明，碳水化合物代謝是醋醅微生物最豐富的功能類別之一。CAZy數據庫包含糖苷水解酶（ GH ）、糖基轉移酶（ GT ）、多糖裂解酶（ PL ）、碳水化合物酯酶（ CE ）、碳水化合物結合模塊（Carbohydrate binding modules，CBM）和輔助活動模塊（Auxiliary activities，AA）共六大類蛋白質家族。本研究從醋醅樣品中檢測到223個不同的碳水化合物活性酶，其中糖苷水解酶120個，糖基轉移酶37個，碳水化合物酯酶14個，輔助活動模塊10個，碳水化合物結合模塊24個，多糖裂解酶18個。從各類酶的相對豐度看，糖基轉移酶最高（reads數為299 206 個，占比37%），其次為糖苷水解酶（占比27%）和碳水化合物酯酶（占比24%）（圖4）。食醋的固態(tài)發(fā)酵首先是將谷物原料轉化為可發(fā)酵糖供微生物利用，因此碳水化合物活性酶廣泛存在于固態(tài)發(fā)酵過程中。與本研究結果類似，湯涵嵐 [22] 的研究結果也表明，食醋大曲中糖苷水解酶對應的基因數最多。

2.2.3.1 糖苷水解酶（ GH ） 目前，CAZy數據庫中有171個糖苷水解酶家族，醋醅宏基因組中共注釋到81個 GH 家族。其中reads數較多的糖苷水解酶家族是GH25（reads數55 664 個，占比25.76%）、GH13（reads數27 232 個，占比12.60%）和GH32（reads數26 648 個，占比12.33%）。GH25具有溶菌酶活性，GH13具有 α -淀粉酶活性、支鏈淀粉酶活性等，GH32具有轉化酶、菊粉內切酶、 β -2，6-果聚糖6-左旋糖化酶活性。

2.2.3.2 糖基轉移酶（ GI ） 目前，CAZy數據庫中有114個糖基轉移酶家族，醋醅宏基因組中共注釋到37個 GT 家族，其中reads數較多的糖基轉移酶家族是GT4（reads數87 924 個，占比37.09%）、GT41（reads數66 842 個，占比28.20%）和GT28（reads數25 994 個，占比10.97%）。GT4具有蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、 α -葡萄糖基轉移酶活性，GT41具有5′-二磷酸尿嘧啶核苷（UDP）- N -乙酰葡糖胺：肽 β - N -乙酰氨基葡萄糖轉移酶、二磷酸尿苷葡萄糖：肽 N - β -葡萄糖基轉移酶等活性，GT28具有1，2-二?；视?- β -半乳糖基轉移酶、1，2-二?；视?- β -葡萄糖基轉移酶、雙半乳糖二?；视秃铣擅傅然钚?。

2.2.3.3 碳水化合物酯酶（ CE ） 目前，CAZy數據庫中有19個碳水化合物酯酶家族，醋醅宏基因組中共注釋到14個 CE 家族。其中reads數較多的碳水化合物酯酶家族是CE10（reads數86 344 個，占比44.48%）、CE1（reads數45 110 個，占比23.24%）和CE7（reads數24 944 個，占比12.85%）。CE10具有芳酯酶、羧基酯酶、乙酰膽堿酯酶活性，CE1具有乙酰木聚糖酯酶、肉桂酸酯酶、阿魏酸酯酶等活性，CE7具有乙酰木聚糖酯酶、頭孢菌素- C 脫乙酰酶活性。

2.2.3.4 碳水化合物結合模塊（CBM） 目前，CAZy數據庫中有88個碳水化合物結合模塊家族，醋醅宏基因組中共注釋到24個CBM家族。其中reads數較多的碳水化合物結合模塊家族是CBM47（reads數800個，占比25.86%）、CBM32（reads數678個，占比21.91%）和CBM50（reads數550個，占比17.78%）。CBM47具有巖藻糖結合活性，CBM32具有與耶爾森氏菌聚半乳糖醛酸結合的活性，CBM50具有結合GH18、GH19、GH23、GH24、GH25和GH73等的活性。

2.2.3.5 輔助活動模塊（AA） 目前，CAZy數據庫中有17個輔助活動模塊家族，醋醅宏基因組中共注釋到7個AA家族。其中reads數較多的輔助活動模塊家族是AA1（reads數42 548 個，占比43.56%）、AA3（reads數24 660 個，占比25.25%）和AA6（reads數20 420 個，占比20.91%）。AA1具有漆酶、鄰二酚：氧氧化還原酶、鐵氧化酶活性，AA3具有纖維二糖脫氫酶、葡萄糖1-氧化酶、芳醇氧化酶等活性，AA6具有1，4-苯醌還原酶活性。

2.2.3.6 多糖裂解酶（ PL ） 目前，CAZy數據庫中有42個多糖裂解酶家族，醋醅宏基因組中共注釋到12個 PL 家族。其中reads數較多的多糖裂解酶家族是PL9（reads數1 060 個，占比41.25%）、PL11（reads數558個，占比21.71%）和PL12（reads數400個，占比15.56%）。PL9具有果膠裂解酶、外聚半乳糖醛酸裂解酶、硫肽聚糖裂解酶活性，PL11具有鼠李糖半乳糖醛酸內切酶、鼠李糖半乳糖醛酸外切酶活性，PL12具有硫酸肝素裂解酶、肝素裂解酶活性。

2.3 食醋風味物質形成的基因分析

四川麩醋富含氨基酸，表1列出了相對豐度排名前3的氨基酸代謝相關基因和酶，可以看出，各氨基酸代謝的主要基因與酶存在較大差異。氨基酸代謝形成風味主要依靠轉氨作用，首先在轉氨酶的作用下將氨基酸轉化為 α -酮酸， α -酮酸再在脫羧酶催化下轉化為醛，醛進一步在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（ NADH ）的輔助下轉化為高級雜醇，高級雜醇還會在醇乙酰轉移酶的催化作用下發(fā)生酯化反應生成乙酸酯類物質 [23] ，這些成分均為食醋中重要的風味成分 [8] 。醋醅基因組中參與轉氨途徑的酶及其編碼基因見表2。醋醅基因組中的轉氨酶基因主要包括支鏈氨基酸轉氨酶基因（編號EC2.6.1.42）、天冬氨酸轉氨酶基因（編號EC2.6.1.1）和 D -丙氨酸轉氨酶基因（編號EC2.6.1.21），三者對應的reads數分別為13 450 個、3 894 個和1 406 個。支鏈氨基酸轉氨酶主要參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，天冬氨酸轉氨酶主要參與苯丙氨酸代謝， D -丙氨酸轉氨酶主要參與 D -精氨酸和 D -鳥氨酸代謝。酮酸主要通過氧化脫羧直接轉化為羧酸，依靠酮酸脫氫酶（ KaDH ）、磷酸轉乙?；福?PTA ）和?；っ福?ACK ），在醋醅中存在 PTA 的編碼基因 pta和ACK 的編碼基因 ackA 。同時，醋醅中存在豐富的醛脫氫酶和醇脫氫酶的編碼基因，催化醛類、醇類物質轉化成相應的醇類、羧酸類物質。因此，四川麩醋醋醅具備以氨基酸為底物形成食醋風味的基礎。氨基酸在各類食醋中均有檢出，不同類別的食醋可能在氨基酸代謝的基因種類和基因豐度上存在區(qū)別。

3 結 論

醋醅中的微生物種類、數量和代謝在很大程度上決定了食醋的風味。本研究隨機選擇1個工業(yè)化生產規(guī)模發(fā)酵池，取9份發(fā)酵成熟的醋醅混合為1個樣品進行宏基因組測序。宏基因組測序可揭示樣本中存在的所有DNA信息，因此通過對1個成熟醋醅樣品的測序即可較全面地揭示發(fā)酵體系中與風味形成相關的基因。

本研究結果表明，醋醅中豐度最高的優(yōu)勢菌屬是乳桿菌屬，占比為71%。氨基酸代謝、碳水化合物代謝是醋醅微生物最旺盛的代謝功能，醋醅樣品中檢測到大量碳水化合物活性酶和氨基酸轉氨、脫羧和脫氫反應的基因，具有形成食醋風味的分子基礎。本研究結果可為四川麩醋微生物組及風味形成機制解析提供理論參考，但由于宏基因組更多用于解析微生物潛力，后期可進一步結合宏轉錄組、代謝組定量分析發(fā)酵過程中核心微生物中與風味形成相關基因的表達，更深入揭示食醋風味形成機制。

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（責任編輯：徐 艷）

收稿日期：2021-10-27

基金項目：四川省科技廳重點研發(fā)項目（2020YFN0133、2019YFN0112）

作者簡介：劉愛平（1986-），男，湖北荊州人，博士，副教授，主要從事食品微生物研究。（E-mail）aipliu@sicau.edu.cn

通訊作者：劉書亮，（E-mail）lsliang999@163.com