SLC2A9基因rs13137074位點(diǎn)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建及其對(duì)基因活性的影響

陳鄔錦,瑪依娜·卡哈爾,田婷婷,李 瑞,梁美婷,4,賀 怡,4,崔月娜,劉業(yè)洲,白 冰,孫玉萍△

新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院：1.形態(tài)中心；2.微生物教研室；3.人體寄生蟲學(xué)教研室，新疆烏魯木齊 830011；4.新疆第二醫(yī)學(xué)院，新疆克拉瑪依 834000

高尿酸血癥(HUA)可導(dǎo)致痛風(fēng)，與慢性炎癥及衰老的機(jī)制存在關(guān)聯(lián)[1]。人體每天約2/3的尿酸經(jīng)腎臟排出，腎臟中參與尿酸排泄的轉(zhuǎn)運(yùn)體可大致分為尿酸再吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體和排泄轉(zhuǎn)運(yùn)體2類[2-3]。葡萄糖易化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-9(SLC2A9)屬于尿酸再吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體位于腎小管上皮細(xì)胞基側(cè)，參與尿酸鹽的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和排出[4]。對(duì)SLC2A9基因調(diào)控區(qū)域的功能研究可闡釋HUA的發(fā)病機(jī)制[5]。本課題組前期對(duì)SLC2A9基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的測(cè)序發(fā)現(xiàn)rs13137074位點(diǎn)的多態(tài)性與尿酸代謝存在關(guān)聯(lián)[6]。有研究指出該位點(diǎn)的基因多態(tài)性可能與機(jī)體尿酸代謝紊亂相關(guān)[7]，但并未具體闡明rs13137074位點(diǎn)突變是否與SLC2A9基因的轉(zhuǎn)錄存在關(guān)聯(lián)。因此，本研究通過定點(diǎn)突變技術(shù)聯(lián)合雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)觀察rs13137074位點(diǎn)對(duì)SLC2A9基因轉(zhuǎn)錄的影響，為進(jìn)一步了解HUA的發(fā)病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人胚胎腎細(xì)胞293T細(xì)胞株購(gòu)自青旗(上海)生物技術(shù)發(fā)展有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒DNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，pGL3-Basic質(zhì)粒、pGL3-Control質(zhì)粒、pGL3-rs13137074-A重組質(zhì)粒、pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒及pAcGFP1-C1質(zhì)粒均購(gòu)自通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司，KpnⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)BioLabs公司，T4 DNA Ligase購(gòu)自Takara(大連)生物技術(shù)有限公司，Lipofectamine 3000購(gòu)自Thermo Fisher公司，引物、DNA片段合成及膠回收試劑盒等購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.2SLC2A9基因rs13137074位點(diǎn)野生型及突變質(zhì)粒構(gòu)建 (1)基因位點(diǎn)合成：將KpnⅠ及XhoⅠ酶切位點(diǎn)分別合成至rs13137074位點(diǎn)的野生型和突變型上、下游，備用。(2)質(zhì)粒連接：將空載質(zhì)粒pGL3-Basic 900 ng加入由CutSmart 5 μL、KpnⅠ及XhoⅠ酶各1 μL、ddH2O 42 μL共同組成的酶切體系中，37 ℃水浴15 min，再60 ℃水浴30 min，取出后4 ℃過夜保存。取上述合成片段3 μL、開鏈pGL3-Basic質(zhì)粒1 μL加入由10×ligation 2 μL、T4 DNA Ligase 1 μL及ddH2O 3 μL組成的連接體系中4 ℃連接過夜。(3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)：取連接好的質(zhì)粒2 μL與50 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞混懸液混合后冰上靜置15 min。將上述混合物全部加入電擊杯中，于25 μF、200 Ω、2 500 U、2 mm條件下電擊，取出后迅速加入500 μL LB培養(yǎng)液置搖床160 r/min 37 ℃孵育1 h。取出培養(yǎng)液將其涂布于含有氨芐西林(AMP)的平板中37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落液體擴(kuò)增備用。(4)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取:取上述培養(yǎng)液5 mL，以3 000 r/min離心10 min棄上清液，加入1 mL Bacterial Endotoxin Erasol顛倒混勻4～6次12 000 r/min離心1 min棄上清液，重復(fù)清洗2次后用參照質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提。(5)質(zhì)粒鑒定：將抽提質(zhì)粒參照(2)酶切鑒定成功后送測(cè)序、并與參比序列比對(duì)完全一致后備用。

1.2.3雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)[8](1)細(xì)胞復(fù)蘇與傳代：將人胚胎腎細(xì)胞(293T)從液氮中取出后遵循“慢凍快融”原理進(jìn)行復(fù)蘇和凍存，傳代標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞貼壁融合達(dá)90%時(shí)。細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM完全培養(yǎng)基(含雙抗及10%胎牛血清)。培養(yǎng)特殊要求為飽和濕度。(2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染條件摸索：將含有DMEM培養(yǎng)基50 μL，1 μL水平為1～5 μg/μL的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(pAcGFP1-C1)質(zhì)粒，2 μL P3000TM轉(zhuǎn)染體系中加入0.375、0.750 μL Lipofectamine 3000試劑并各自設(shè)立24 h組及48 h組，共4組每組3個(gè)平行樣品，混勻后室溫靜置15 min備用。將上述混合液全部轉(zhuǎn)移至貼壁生長(zhǎng)好的293T細(xì)胞培養(yǎng)板中置細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別按照24 h和48 h繼續(xù)培養(yǎng)。(3)實(shí)驗(yàn)分組：共設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(pGL3-Control質(zhì)粒)、陰性對(duì)照組(空載pGL3-Basic質(zhì)粒)、SLC2A9基因rs13137074位點(diǎn)野生型組(pGL3-SLC2A9-WT質(zhì)粒)和SLC2A9基因rs13137074位點(diǎn)突變型組(pGL3-rs13137074-A質(zhì)粒)4組，每組3個(gè)平行樣進(jìn)行檢測(cè)。每組按照均20:1的比例加入目標(biāo)質(zhì)粒及pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒。(4)雙熒光素酶活性檢測(cè)：按照(2)所得最佳培養(yǎng)時(shí)間取出轉(zhuǎn)染細(xì)胞，平衡至室溫后取150 μL細(xì)胞加入裝有150 μL已制備的Dual-Glo Luciferase試劑的EP管中室溫靜置30 min。待細(xì)胞充分裂解后吹打混勻后避光條件下取75 μL加入黑色96孔板中，靜置30 min后檢測(cè)螢火蟲熒光素酶熒光值。隨后向每孔添加已制備的Dual-Glo Stop& Glo試劑75 μL靜置30 min后檢測(cè)海腎熒光素酶的熒光值。熒光素酶活性=海腎熒光素酶熒光值/螢火蟲熒光素酶的熒光值。

2 結(jié) 果

2.1雙酶切鑒定結(jié)果 將野生型質(zhì)粒pGL3-SLC2A9-WT與突變型質(zhì)粒pGL3-rs13137074-A經(jīng)雙酶切后電泳顯示目標(biāo)片段連接成功，均出現(xiàn)了2條明顯的條帶見圖1。

注：A為野生型質(zhì)粒酶切電泳圖；B為突變型質(zhì)粒酶切電泳圖；M為分子標(biāo)準(zhǔn)帶；1為雙酶切前野生型質(zhì)粒；2為雙酶切后野生型質(zhì)粒；3為雙酶切前突變型質(zhì)粒；4為雙酶切后突變型質(zhì)粒。

2.2質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果 野生型質(zhì)粒pGL3-SLC2A9-WT測(cè)序結(jié)果經(jīng)分析與參比序列完全一致，見圖2。

圖2 pGL3-SLC2A9-WT部分測(cè)序峰圖

2.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染條件摸索 經(jīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000在0.75 μL/孔(24孔板)效果最好，即每1mL培養(yǎng)液中需加入1.5 μL Lipofectamine 3000試劑，最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間為48 h。

2.4SLC2A9基因rs13137074位點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)錄活性影響檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)雙熒光素檢測(cè)可得轉(zhuǎn)染rs13137074位點(diǎn)突變型報(bào)告載體，與野生型載體相比，其熒光素酶活性顯著下調(diào)了23.60%，見表1。

表1 雙熒光素酶檢測(cè)SLC2A9基因rs13137074位點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)錄活性的影響

3 討 論

尿酸是嘌呤代謝的終產(chǎn)物，在體內(nèi)主要以尿酸鹽的形成存在于血清中，作為一種氧自由基的清除劑，參與機(jī)體多種細(xì)胞的抗氧化、抗衰老及代謝過程[9]。體內(nèi)過高濃度的尿酸會(huì)引起高尿酸血癥、慢性腎病及痛風(fēng)等疾?。欢^低濃度的尿酸則會(huì)引起人體出現(xiàn)多種炎癥及與誘發(fā)抗氧化能力下降相關(guān)疾病，如阿爾茨海默癥、帕金森及多發(fā)性硬化癥等[10]。人體尿酸平衡的維持主要依賴于腎臟對(duì)尿酸鹽的重吸收和排泄，SLC2A9作為腎臟尿酸鹽排泄途徑中重要轉(zhuǎn)運(yùn)體之一[11]，該基因的突變與腎臟引起的HUA存在顯著關(guān)聯(lián)[12]。SLC2A9基因除了在腎臟表達(dá)外還可表達(dá)于肝臟、胎盤和胰腺等多種細(xì)胞和器官中，同時(shí)也是癌癥抑制因子P53的直接靶基因，可有助于抗氧化防御作用[13]，目前報(bào)道的該基因的調(diào)控相關(guān)蛋白只有核受體家族成員(HNF)4α及PDZ結(jié)構(gòu)域1(PDZK1)[14]。但其他與SLC2A9調(diào)控相關(guān)的基因尚未被深入研究，多項(xiàng)研究指出SLC2A9的多個(gè)位點(diǎn)SNP與血清尿酸水平存在關(guān)聯(lián)，但大多位于內(nèi)含子非編碼區(qū)，且這些位點(diǎn)改變血尿酸水平的分子機(jī)制尚不清楚[15-16]。本課題前期在對(duì)本地區(qū)居民SLC2A9基因功能區(qū)突變與HUA的關(guān)聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn)多個(gè)SNP與尿酸代謝異常存在關(guān)聯(lián)，但未涉及rs13137074位點(diǎn)SLC2A9基因轉(zhuǎn)錄活性的探索[6]。本研究定點(diǎn)突變r(jià)s13137074位點(diǎn)并通過雙熒光素酶檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)發(fā)生突變使得SLC2A9基因轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)了23.60%。說(shuō)明rs13137074位點(diǎn)位于SLC2A9基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控區(qū)，該基因的突變與SLC2A9基因轉(zhuǎn)錄存在明顯關(guān)聯(lián)。本研究的開展進(jìn)一步證實(shí)了rs13137074位點(diǎn)SNP可影響SLC2A9基因的表達(dá)進(jìn)而影響人群血尿酸水平。