LPR5基因多態(tài)性與絕經(jīng)后女性2型糖尿病患者并發(fā)骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系*

徐 偉，何 艷，王莉華，羅 涌

重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶萬州 404000

2型糖尿病(T2DM)屬于一種因胰島素抵抗導(dǎo)致胰島素相對分泌不足的疾病，多發(fā)生于成年人，一般在40歲后發(fā)病[1]。膳食結(jié)構(gòu)、遺傳因素、環(huán)境改變等均容易引起T2DM。T2DM是一種慢性內(nèi)分泌代謝綜合征，機(jī)體出現(xiàn)胰島素作用障礙，導(dǎo)致糖、蛋白質(zhì)、脂肪代謝等紊亂。骨質(zhì)疏松癥(OP)以骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化、骨量減少為特征的，容易引起骨折，多發(fā)生于老年人群及絕經(jīng)后女性中。約有1/3的絕經(jīng)后女性患有OP。隨著診療技術(shù)的提高，臨床中糖尿病患者并發(fā)OP的檢出率有所升高，尤其是T2DM患者多有骨密度(BMD)異常的表現(xiàn)，這增加了骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[2]。OP被認(rèn)為與遺傳因素有關(guān)，有研究表明雌激素受體、轉(zhuǎn)化生長因子β及Ⅰ型膠原α鏈基因等多態(tài)性位點(diǎn)可作為反映骨量遺傳性因素的標(biāo)志[3]。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(LRP5)廣泛分布于人體內(nèi)，為細(xì)胞表面受體。有研究證實(shí)，LRP5存在于骨細(xì)胞上，且編碼該蛋白基因的異常容易引起B(yǎng)MD的升高或降低[4]。本文旨在探討LRP5基因多態(tài)性與絕經(jīng)后女性T2DM患者并發(fā)OP的關(guān)系，為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2019年8月至2021年9月收治的絕經(jīng)后女性210例，其中體檢健康女性50例(A組)，年齡54～66歲，絕經(jīng)3～8年；單純T2DM女性患者50例(B組)，年齡53～68歲，絕經(jīng)4～8年；單純OP女性患者52例(C組)，年齡55～65歲，絕經(jīng)3～9年；女性T2DM并發(fā)OP患者58例(D組)，年齡55～69歲，絕經(jīng)3～9年。各組年齡、絕經(jīng)年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、腰臀比等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。所有患者均對本研究方案知情并簽署同意書。本研究方案通過本院倫理委員會的批準(zhǔn)。

表1 各組患者一般資料比較

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)[5]：(1)患者T2DM、OP的診斷符合WHO文件中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn);(2)絕經(jīng)后女性；(3)入組人員意識清楚，無交流障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾??；(2)使用過對骨代謝有影響的藥物，如糖皮質(zhì)激素、降鈣素等；(3)患有1型糖尿病、骨骼疾病及其他對本研究可能產(chǎn)生影響的疾?。?4)合并嚴(yán)重心、肝、肺、腎等重要臟器功能障礙。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 抽取納入研究者空腹肘靜脈血5 mL，受檢者于前1天晚飯后進(jìn)行8～12 h的禁食，后續(xù)將對血液標(biāo)本進(jìn)行骨代謝、糖代謝及基因型檢測。

1.3.2糖代謝、骨代謝指標(biāo)及BMD檢測 采用全自動(dòng)生化分析儀對糖化血紅蛋白(HbA1c)、空腹胰島素(FINS)等糖代謝指標(biāo)進(jìn)行檢測，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對受檢者的血清骨堿性磷酸酶(B-ALP)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)等骨代謝指標(biāo)進(jìn)行檢測，采用DEXA公司的雙能X線BMD檢測儀對受檢者的股骨頸及腰椎L2～4進(jìn)行BMD檢測，受檢者取仰臥位，所有受檢者檢測操作均由同一檢測員完成,參考國際臨床骨密度學(xué)會(ISCD)共識文件[6]對BMD進(jìn)行測定。

1.3.3LRP5基因多態(tài)性檢測 采用QIAamp DNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，提取LRP5基因組DNA。采用限制性片斷長度多態(tài)性(RFLP)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法對提取的DNA進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，從而進(jìn)行基因型判讀。按照人LRP5基因DNA序列設(shè)計(jì)引物，分析LRP5基因A1330V、Q89R位點(diǎn)多態(tài)性。A1330V位點(diǎn)上游引物為5′-GCTGGGCTGTTGATGTTTAGA-3′，下游引物為5′-AGAGGCAAGGTTTTCCCATAA-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)30次；72 ℃ 延伸4 min。Q89R位點(diǎn)上游引物為5′-TCTGGGCATAGTGCTCCATC-3′，下游引物為5′-TTCCGGGATGTGCCATTGAG-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s；72 ℃ 20 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸4 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后將瓊脂糖凝膠上被內(nèi)切酶切斷的DNA片斷置于紫外分析儀中進(jìn)行顯示分析。Q89R多態(tài)性AvaⅡ酶切片段:RR型(突變型)274、162 bp，QR型(雜合子)162、274、436 bp，QQ型(野生型)436 bp。A1330V多態(tài)性DraⅢ酶切片段:VV型(突變型)24、119 bp，AV型(雜合子)24、119、143 bp，AA型(野生型)143 bp。由兩人同時(shí)對帶型結(jié)果進(jìn)行判讀，兩人判讀結(jié)果一致才能得出結(jié)論。

1.4觀察指標(biāo) 對B、C、D組與A組的糖代謝、骨代謝指標(biāo)，BMD及LRP5基因Q89R、A1330V位點(diǎn)基因型分布情況進(jìn)行比較。分析D組LRP5基因A1330V位點(diǎn)多態(tài)性與糖代謝及骨代謝指標(biāo)的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1糖代謝、骨代謝指標(biāo)及BMD比較 C組、D組股骨頸BMD、腰椎L2～4 BMD均低于A組(P<0.05)，而B組與A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；B組、D組FINS、HbA1c水平均高于A組(P<0.05)，而C組與A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組間B-ALP、TRACP-5b比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組糖代謝、骨代謝指標(biāo)及BMD比較

2.2各組患者LRP5基因Q89R位點(diǎn)、A1330V位點(diǎn)基因型分布 B、C、D組LRP5基因Q89R位點(diǎn)RR型、QR型、QQ型分布與A組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；B、C、D組LRP5基因A1330V位點(diǎn)VV型、AV型、AA型分布與A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組LRP5基因Q89R位點(diǎn)、A1330V位點(diǎn)基因型分布[n(%)]

2.3D組患者LRP5基因A1330V位點(diǎn)基因型與糖代謝、骨代謝指標(biāo)及BMD的關(guān)系 D組LRP5基因A1330V位點(diǎn)VV型、AV型、AA型患者股骨頸BMD、腰椎L2～4 BMD、HbA1c比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.590、3.234、3.320，P<0.05)，而FINS、B-ALP、TRACP-5比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.116、0.031、0.361，P>0.05)。見表4。

表4 D組患者LRP5基因A1330V多態(tài)性與糖代謝及骨代謝指標(biāo)的關(guān)系

3 討 論

OP屬于T2DM患者的一種慢性并發(fā)癥，較為常見，而絕經(jīng)后女性因機(jī)體內(nèi)雌激素水平降低，更容易發(fā)生OP，增加骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[7]。有研究表明，絕經(jīng)后OP女性HbA1c水平高于健康女性，HbA1c水平升高對骨細(xì)胞分化有抑制作用，可能有助于破骨細(xì)胞增殖[8]。本研究結(jié)果亦證實(shí)，OP女性HbA1c水平高于絕經(jīng)后健康女性(P<0.05)。上述研究結(jié)論均提示，對絕經(jīng)后T2DM女性患者應(yīng)進(jìn)行OP早期篩查及防治。

目前，關(guān)于絕經(jīng)后女性T2DM與BMD是否存在相關(guān)性尚無統(tǒng)一結(jié)論。趙會榮等[9]的研究指出，絕經(jīng)后女性T2DM患者BMD與患者血糖控制有關(guān)，首發(fā)T2DM患者的BMD往往較為正常，而血糖控制不理想的T2DM患者BMD較低；該研究還指出，絕經(jīng)后女性T2DM并發(fā)OP患者骨代謝位于高轉(zhuǎn)換狀態(tài)。但另有研究表明，絕經(jīng)后女性T2DM患者的股骨頸及腰椎BMD與健康者沒有明顯差異[10]。徐慶博等[11]的研究則表明，絕經(jīng)后T2DM患者的股骨頸及腰椎BMD與健康人相比明顯升高。除此之外，趙會榮等[12]的研究提示，絕經(jīng)后女性T2DM患者的BMD高于健康絕經(jīng)女性；絕經(jīng)后女性T2DM并發(fā)OP患者BMD與絕經(jīng)后女性單純OP患者一致。本研究中，絕經(jīng)后女性T2DM并發(fā)OP患者的股骨頸BMD、腰椎L2～4 BMD均低于健康絕經(jīng)女性(P<0.05)；另有研究亦證實(shí)，絕經(jīng)后女性T2DM并發(fā)OP患者股骨頸BMD、腰椎L2～4 BMD低于健康體檢女性[13]。

OP屬于多基因疾病，該疾病的發(fā)生80%與遺傳因素有關(guān)，對骨量有一定的影響，而基因又能夠調(diào)節(jié)骨量的獲得[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，低BMD與LRP5基因A1330V位點(diǎn)的多態(tài)性密切相關(guān)。LRP5基因存在有7個(gè)位點(diǎn)的核苷酸改變,其中2個(gè)會使LRP5蛋白上的氨基酸被替換(Q89R、A1330V)。現(xiàn)階段已有眾多研究表明，BMD的變化與特定基因的多態(tài)性關(guān)系密切[15-16]。有研究表明LRP5基因與T2DM、OP有一定的關(guān)系[17]，另有研究指出LRP5能夠參與Wnt信號通路進(jìn)而對骨代謝產(chǎn)生影響[18]。因此，對于LRP5基因的多態(tài)性與骨代謝及T2DM間的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注。

LRP5屬于Wnt配體輔助受體，是一種跨膜受體蛋白，基因定位于染色體11q12-13上，臨床研究表明LRP5廣泛存在于機(jī)體組織器官中[19]。LRP5基因有利于胰島素的產(chǎn)生，具有積極傳導(dǎo)胰島信號的作用，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成?；蚨鄳B(tài)性為某種生物體中存在≥2種不連續(xù)的基因型或變異型。有研究表明，LRP5基因Q89R位點(diǎn)多態(tài)性能夠影響絕經(jīng)后女性BMD，是影響B(tài)MD的一種候選基因[20]。陳福宇等[21]對絕經(jīng)后女性LRP5基因多態(tài)性與BMD的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BMD與Q89R位點(diǎn)多態(tài)性存在一定的關(guān)系，但與A1330V位點(diǎn)多態(tài)性是否相關(guān)尚無定論。有研究指出，LRP5基因多態(tài)性與絕經(jīng)后女性T2DM并發(fā)OP患者胰島素水平相關(guān)，是發(fā)生OP的易感基因[22]。另外，有研究對LRP5基因位點(diǎn)多態(tài)性與糖代謝、BMD間的關(guān)系進(jìn)行了深入探討，結(jié)果證實(shí)絕經(jīng)后LRP5基因可能為T2DM和OP患者的易感基因[23]，A1330V位點(diǎn)多態(tài)性與該疾病的發(fā)生有關(guān)，而Q89R位點(diǎn)多態(tài)性與骨代謝及糖代謝關(guān)系不大。本研究表明，T2DM并發(fā)OP患者LRP5基因A1330V位點(diǎn)多態(tài)性與骨代謝、糖代謝有關(guān)，而Q89R位點(diǎn)多態(tài)性與骨代謝、糖代謝無關(guān)，與已有的研究結(jié)論相一致。但仍需加大樣本量，進(jìn)行多中心的研究以證實(shí)該結(jié)論。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后女性T2DM并發(fā)OP患者股骨頸及腰椎L2～4 BMD明顯降低，而且患者LRP5基因A1330V位點(diǎn)各基因型分布有明顯差異；絕經(jīng)后女性T2DM并發(fā)OP患者中，LRP5基因A1330V位點(diǎn)VV、AV、AA型患者間股骨頸及腰椎L2～4 BMD，HbA1c水平具有明顯差異。LRP5基因多態(tài)性可能是絕經(jīng)后女性T2DM患者并發(fā)OP的影響因素。