洋地黃毒苷候選參考方法的建立及評價

唐寧波，劉冠財，劉曉雨，楊豐繁，龔志梅，孫可其

（邁克生物股份有限公司參考系統(tǒng)部，四川 成都 611731）

洋地黃毒苷是強心苷類藥物，主要用于充血性心力衰竭的治療。由于洋地黃毒苷作用慢而持久，適用于慢性心功能不全患者長期服用，尤其適用于伴有腎功能損傷的充血性心力衰竭患者[1]。但洋地黃毒苷安全用藥范圍窄，治療量接近中毒劑量[2]，因此建立洋地黃毒苷的定量檢測方法，準確測定人體內(nèi)洋地黃毒苷的濃度，對臨床相關(guān)疾病的診治有重要作用。目前，臨床上常用的強心苷類藥物檢測方法主要有高效液相色譜法、化學發(fā)光免疫法、放射免疫法、均相免疫分析法、熒光分析法等[3-4]。在各種方法中，基于免疫學原理的方法具有快速、簡便等優(yōu)點，但易受藥物代謝物或與藥物結(jié)構(gòu)相似的化合物的影響，導(dǎo)致方法的特異性、準確度和重復(fù)性均存在一定的問題[5-6]。因此，為了保證血清洋地黃毒苷檢測結(jié)果的準確性和可比性，建立可靠的參考方法非常有必要。根據(jù)檢驗醫(yī)學溯源聯(lián)合委員會（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）推薦列表，目前國際上有2種測定洋地黃毒苷的參考方法，一種為德國臨床化學學會（German Society of Clinical Chemistry，DGKC）建立的同位素稀釋液相色譜-質(zhì)譜法，另一種為德國INSTAND實驗室建立的同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]。推薦方法中的前處理步驟較為繁瑣，需萃取吹干、復(fù)溶、再次吹干、復(fù)溶后進樣檢測，且樣本分析時間較長。本研究擬在推薦方法的基礎(chǔ)上，建立一種基于同位素稀釋超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（isotope dilution ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，IDUPLC-MS/MS）的操作簡便、分析時間更短的參考方法，并對所建立的方法進行方法學評價。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器 UPLC/XEVO TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司），ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm，美國Waters公司），十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司），微量移液器（德國Eppendorf公司），Milli-Q超純水系統(tǒng)（德國Millipore公司），D2012型離心機（北京大龍公司），TD5A-WS型離心機（湖南湘儀公司），YGC-24型氮吹儀（成都雅源科技公司）。

1.1.2 試劑 洋地黃毒苷標準物質(zhì)（純度99.0%）購自英國LGC公司，洋地黃毒苷同位素內(nèi)標（洋地黃毒苷-21，23，23-d3，純度99.3%）購自加拿大Toronto Research Chemicals公司；叔丁基甲基醚、七水硫酸鋅及甲酸銨購自美國Sigma-Aldrich公司，色譜級乙腈和甲酸均購自美國ThermoFisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 標準工作液制備 采用重量法配制標準工作液。精密稱取洋地黃毒苷標準物質(zhì)10 mg，用90%乙醇溶液溶解并混勻，配制成20 ng/g的標準工作液，-80 ℃避光保存。

1.2.2 內(nèi)標工作液制備 內(nèi)標工作液的制備方法與標準工作液相同。以洋地黃毒苷-21，23，23-d3為內(nèi)標，用90%乙醇將洋地黃毒苷-21，23，23-d3溶解并混勻，配制成20 ng/g的內(nèi)標工作液。所有溶液均采用重量法配制，-80 ℃避光保存。

1.2.3 標準曲線制備 取5個5 mL離心管，依次加入50、80、100、120、150 μL標準工作液，然后各加入100 μL內(nèi)標工作液，使標準品與內(nèi)標的質(zhì)量比分別為0.50、0.80、1.00、1.20、1.50。

1.2.4 樣本處理 用微量移液器吸取0.1 mL內(nèi)標溶液至5 mL離心管，精確稱得質(zhì)量，再分別稱取適量樣本加入內(nèi)標中混勻，使樣本與內(nèi)標的質(zhì)量比為1，加入適量水，使最終體積為0.8 mL，震蕩混勻，室溫下靜置平衡1 h，加入0.5 mol/L硫酸鋅溶液0.4 mL，沉淀蛋白，充分混勻10 min，2 810×g離心5 min，吸取上清液，加入2.4 mL叔丁基甲基醚溶液萃取，充分混勻10 min，2 810×g離心10 min，吸取上層有機相2.0 mL，45 ℃氮氣吹干，加入150 μL流動相復(fù)溶，15 100×g離心5 min，吸取上清100 μL，采用ID-UPLC-MS/MS檢測。標準溶液與血清樣本同時進行處理。

1.2.5 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜使用電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）正離子模式和多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，M R M）分析。去溶劑氣為氮氣，溫度為350 ℃，流速為700 L/h；碰撞氣為氬氣。質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜檢測參數(shù)

1.2.6 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，進樣體積為10 μL，柱溫35 ℃，流動相為10 mmol/L甲酸銨（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）（V∶V=40∶60），等度洗脫，流速為0.2 mL/min。

1.2.7 結(jié)果計算 所有樣本均按照前處理條件作相同處理，每份樣本或標準品重復(fù)測定3次，計算均值。

1.3 方法學評價

根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）C62-A文件[8]、CLSI EP15-A3文件[9]對建立的檢測洋地黃毒苷的ID-UPLC-MS/MS方法進行性能評價。

1.3.1 精密度 參考CLSI EP15-A3文件進行批內(nèi)精密度和批間精密度評價。選擇4種不同濃度（A、B、C、D）的冰凍人血清樣本，每天分析1批，每批次每個濃度重復(fù)測定5次，共測定5 d。根據(jù)結(jié)果計算出每個濃度的批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）和批間CV。

1.3.2 準確度 準確度驗證通過加標回收實驗和測定國際能力驗證樣本進行準確度評價[10]。（1）加標回收。取混合血清，加入適量洋地黃毒苷標準溶液混勻，得到一定質(zhì)量濃度的洋地黃毒苷混合基礎(chǔ)血清，將洋地黃毒苷混合血清分成4份，其中3份分別加入不同量的洋地黃毒苷標準溶液，配制成高、中、低濃度的洋地黃毒苷混合血清樣本，將4份血清樣本同時進行檢測，計算加標回收率。（2）室間比對。測定2020年國際臨床化學和檢驗醫(yī)學聯(lián)合會參考實驗室外部質(zhì)量評價計劃（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine External Quality Assessment Scheme for Reference Laboratories in Laboratory Medicine，RELA）比對樣本，每個批次測定2份RELA樣本，每份樣本重復(fù)測定3次，共分析3個批次，計算測量結(jié)果與靶值偏移。

1.3.3 檢測限與定量限 用0.9% NaCl溶液將已知濃度的高濃度（14.07 nmoL/L）血清樣本分別稀釋至0.108、0.117、0.141 nmoL/L，每個濃度樣本各分成5份，預(yù)處理后進行檢測，得到實測值。將同時滿足偏移≤15%、CV≤20%、信噪比（signal-to-noise ratio，RSN）≥10的濃度值定義為定量下限，將RSN=3時的濃度值定義為檢測限。

1.3.4 基質(zhì)效應(yīng) 采用基質(zhì)混合實驗的方法計算相對基質(zhì)效應(yīng)，即通過檢測空白血清基質(zhì)樣本、溶液基質(zhì)標準溶液、血清與溶液1︰1（V∶V）混合物、血清與溶液8︰2（V∶V）混合物、血清與溶液2︰8（V∶V）混合物這5種基質(zhì)樣本的最終濃度來計算相對基質(zhì)效應(yīng)。同時滿足偏移≤15%、CV≤15%，則判定為無相對基質(zhì)效應(yīng)。

1.3.5 攜帶污染 評估攜帶污染時，先重復(fù)進樣低濃度樣本（4.15 nmol/L），然后交替進樣高濃度樣本（92.00 nmol/L）和低濃度樣本。計算2種進樣方式下得到的低濃度樣本檢測結(jié)果的差異。若低于預(yù)定標準的20%，則認為在測定該高濃度及以下濃度樣本時不存在明顯的攜帶污染[11]。

1.3.6 稀釋一致性 取洋地黃毒苷濃度超出定量范圍的樣本（120 nmol/L），稀釋到93.30 nmol/L；取洋地黃毒苷定量范圍內(nèi)的樣本（10 nmol/L）分別稀釋到3.97 nmol/L和1.98 nmol/L。分別檢測定量范圍外的稀釋樣本和定量范圍內(nèi)的稀釋樣本，結(jié)果應(yīng)同時滿足回收率100%±15%，CV<15%。

1.3.7 特異性 用建立的ID-UPLC-MS/MS方法同時測定洋地黃毒苷及與其結(jié)構(gòu)相似的化合物地高辛，若地高辛與洋地黃毒苷達到色譜分離，且響應(yīng)值無明顯變化，則說明洋地黃毒苷檢測特異性好，不受結(jié)構(gòu)相似化合物的影響。

1.3.8 穩(wěn)定性 評估洋地黃毒苷在生物基質(zhì)中的穩(wěn)定性。取2份血清樣本，分別均分為4等份，一份在常溫放置4、8、12、24 h，另一份在2～8 ℃下放置1、2、3、4 d，然后進樣檢測，觀察樣本在常溫及2～8 ℃下的穩(wěn)定性；為了評估樣本處理后的穩(wěn)定性，將處理后的樣本在室溫和進樣器中分別放置4、8、12、24 h后進行檢測。若測定結(jié)果的均值在標示值±15%范圍內(nèi)，則判定為滿足穩(wěn)定性要求[12]。

1.4 不確定度評定

依據(jù)CNAS-GL006：2019文件[13]對血清樣本檢測結(jié)果不確定度的來源進行分析。參照《測量不確定度評定與表示指南》[14]（Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement，GUM）和《分析測量中不確定度的量化》[15]（Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement，QUAM）對結(jié)果進行不確定度評定。其中，A類不確定度主要來自樣本的重復(fù)測定；B類不確定度主要來自洋地黃毒苷標準物質(zhì)純度、洋地黃毒苷標準物質(zhì)稱量、移液器移液過程引入的不確定度。

B類不確定度合成公式為：

式中UP、Uv和Uw分別為標準物質(zhì)純度、樣本稱量以及移液器引入的不確定度。合成不確定度公式為：

擴展不確定度計算公式為：

Ue=k×UC

式中k為包含因子（k=2）。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線及色譜圖

以標準品與內(nèi)標的質(zhì)量比和對應(yīng)峰面積比值制作標準曲線，方程為Y=1.162 8X+0.014 4（r2=0.999 7），見圖1。洋地黃毒苷標準溶液和內(nèi)標的色譜圖見圖2。洋地黃毒苷的線性范圍為2.8～94.9 nmol/L。

圖1 洋地黃毒苷標準曲線

圖2 洋地黃毒苷和內(nèi)標色譜圖

2.2 方法學評價

2.2.1 精密度 ID-UPLC-MS/MS測定A、B、C、D 4個水平的洋地黃毒苷批內(nèi)精密度≤1.98%，批間精密度≤1.06%。見表2。

表2 ID-UPLC-MS/MS檢測血清洋地黃毒苷的精密度

2.2.2 準確度 ID-UPLC-MS/MS測定血清洋地黃毒苷的加標回收率為100.03%～100.48%。重復(fù)測定3次，CV≤1.80%，見表3。參加2020 RELA室間比對，本實驗室2020 RELA-A、2020 RELA-B樣本檢測結(jié)果與總均值的偏移分別為0.62%、0.29%。

表3 加標回收率測定結(jié)果

2.2.3 檢測限與定量限 采用ID-UPLC-MS/MS測定血清洋地黃毒苷，同時滿足偏移≤15%、CV≤20%、RSN≥10的濃度為0.095 nmol/L，將其定義為定量下限；檢測限為0.032 nmol/L。見表4。

表4 洋地黃毒苷的定量限評估結(jié)果

2.2.4 基質(zhì)效應(yīng) 5種基質(zhì)樣本測定值與理論值同時滿足偏移≤15%、CV≤15%，判定為無相對基質(zhì)效應(yīng)。見表5。

表5 洋地黃毒苷的基質(zhì)效應(yīng)評估結(jié)果

2.2.5 攜帶污染 ID-UPLC-MS/MS檢測洋地黃毒苷低濃度樣本重復(fù)進樣時的均值為4.15 nmol/L，交替進樣測得低濃度樣本的均值為4.19 nmol/L，計算得到攜帶污染率為0.88%。

2.2.6 稀釋一致性 2份定量范圍內(nèi)的樣本（樣本1、樣本2）和1份定量范圍外的樣本（樣本3）測定結(jié)果與靶值偏移均<2%。見表6。該方法滿足稀釋一致性要求。

表6 洋地黃毒苷的稀釋一致性估結(jié)果

2.2.7 特異性 洋地黃毒苷和地高辛可實現(xiàn)基線分離，并且響應(yīng)值與加入地高辛前比較，無明顯變化。見圖3。

圖3 洋地黃毒苷及地高辛檢測色譜圖

2.2.8 穩(wěn)定性 血清樣本在室溫下放置4、8、12、24 h及2～8 ℃下放置1、2、3、4 d的測定結(jié)果偏移在±1.91%以內(nèi)，見表7。血清樣本處理后在室溫下和自動進樣器中放置4、8、12、24 h的測定結(jié)果偏移在±1.56%以內(nèi)，見表8。所有測定結(jié)果均在標示值±15%以內(nèi)，滿足穩(wěn)定性要求。

表7 未作前處理的血清樣本在不同樣本保存條件下的穩(wěn)定性

表8 處理后的樣本的穩(wěn)定性

2.3 不確定度評定

以2020 RELA-A和2020 RELA-B樣本為例，對ID-LC-MS/MS檢測血清洋地黃毒苷的不確定度進行評定，不確定度評定結(jié)果見表9。根據(jù)表9中的相對不確定度分量計算2020 RELA-A和2020 RELA-B樣本的相對擴展不確定度（包含因子k=2）分別為2.47%、2.11%。2020 RELA-A和RELA-B樣本測定值分別為14.16、19.87 nmol/L，擴展不確定度分別為±0.35 nmol/L、±0.42 nmol/L（包含因子k=2）。

表9 不確定度評定結(jié)果

3 討論

JCTLM推薦了2種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測洋地黃毒苷的參考方法，其最大的亮點是使用Cs+作為加合離子。當使用Cs+作為加合離子時，可以提高該方法的特異性，不會受到生物來源樣本中其他物質(zhì)的干擾，但使用的化合物氯化銫有毒，不建議使用，且我國的研究中幾乎沒有關(guān)于Cs+的使用方法及濃度范圍。德國INSTAND實驗室建立的洋地黃毒苷參考方法，樣本前處理需先調(diào)節(jié)樣本的pH值，再使用叔丁基甲基醚-乙酸乙酯（V∶V=1∶1）進行萃取，氮氣吹干，采用甲醇復(fù)溶，再次進行氮氣吹干，使用流動相復(fù)溶進樣，前處理過程中的2次復(fù)溶吹干，有利于除去樣本中洋地黃毒苷的干擾物質(zhì)，對峰型圖有一定的改善作用，但是會增加樣本的前處理時間，使得樣本前處理變得繁瑣，且樣本分析時間為15 min，相對較長；同時，國內(nèi)外關(guān)于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法用于洋地黃毒苷檢測的研究很少。因此，本實驗室在基于以上因素和保證方法準確度以及精密度的前提下，嘗試建立一種ID-UPLC-MS/MS測定血清洋地黃毒苷的候選參考方法，通過對色譜、質(zhì)譜方法及樣本前處理進行摸索與優(yōu)化，經(jīng)蛋白沉淀、液液萃取、吹干、復(fù)溶即可進樣分析，大大縮短了樣本前處理時間，且樣本分析時間縮短至4 min，有效提高了該方法的實用性和可操作性，可用于常規(guī)檢測系統(tǒng)的量值溯源及準確度評價。

本研究在進行質(zhì)譜條件摸索時，發(fā)現(xiàn)[M+NH4]+在甲酸銨溶液體系中會形成信號更強的分子離子峰[16]。與JCTLM推薦方法中的母離子[M+Cs]+比較，[M+NH4]+中的NH4+為實驗室常用離子，其溶液濃度基本固定，對儀器管路影響較小，而Cs+很少有實驗室會用到，溶液配制濃度不確定，未知溶液濃度對儀器以及實驗結(jié)果有較大影響，故本研究流動相選擇甲酸銨溶液。在色譜條件中，本研究未采用推薦方法的梯度洗脫，而是選擇等度洗脫，在保證色譜峰型較好的前提下，減少了樣本分析時間。

洋地黃毒苷是屬于強心苷類藥物，與之相似的藥物還有地高辛，洋地黃毒苷與地高辛空間結(jié)構(gòu)相似，地高辛結(jié)構(gòu)的C14號位置比洋地黃毒苷多1個羥基，其他結(jié)構(gòu)均一致，在檢測洋地黃毒苷時，有可能會受到地高辛的干擾。本研究干擾實驗結(jié)果顯示，洋地黃毒苷和地高辛可實現(xiàn)基線分離，并且色譜峰響應(yīng)值在加入地高辛前后無明顯變化，說明建立的ID-UPLC-MS/MS方法檢測洋地黃毒苷不受結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)的干擾。

本研究方法學評價結(jié)果顯示，ID-UPLC-MS/M S檢測洋地黃毒苷的線性范圍為2.8～94.9 nmol/L，不同基質(zhì)樣本對檢測結(jié)果無明顯基質(zhì)效應(yīng)影響，定量限為0.095 nmol/L，檢測限為0.032 nmol/L，攜帶污染率為0.88%，批內(nèi)精密度≤1.98%，批間精密度≤1.06%，加標回收率為100.03%～100.48%。重復(fù)測定的CV≤1.80%，2020 RELA樣本檢測結(jié)果與總均值的偏移≤0.78%。

綜上所述，本研究建立的ID-UPLC-MS/MS候選參考方法的準確度高、精密度好、特異性強、操作簡便，不受其他生物來源的物質(zhì)干擾，且操作簡便，分析時間較短，可用于洋地黃毒苷常規(guī)方法的準確度評價。