血清miR-21、miR-135a對(duì)胃癌患者化療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值

梁春芳，朱康寧，張 琦

（河南省人民醫(yī)院 省直第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000）

胃癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)生率和病死率均較高。我國(guó)胃癌發(fā)病率較高，因胃癌患者初期無(wú)明顯特征，早期篩查的診斷率較低，待確診時(shí)大多已處于中晚期[1]。目前，胃癌的主要治療方法為化療，但有超過(guò)50%的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2]。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，與一些原癌基因和抑癌基因異常表達(dá)密切相關(guān)[3]。因此，尋找異常表達(dá)的小分子，對(duì)胃癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后評(píng)估有重要的意義。miRNA是由22～24個(gè)核苷酸構(gòu)成的單鏈非編碼RNA分子，廣泛分布于真核生物中，調(diào)控哺乳動(dòng)物1/3的基因表達(dá)[4]。miRNA的異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，主要作用為調(diào)控癌基因或抑癌基因[5]。有研究結(jié)果顯示，miR-21在肝癌[6]、胃癌[7]和乳腺癌[8]等腫瘤中呈異常表達(dá)，主要通過(guò)與目的基因的特異性結(jié)合，阻斷其轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)。miR-135a與消化系統(tǒng)腫瘤，如胃癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌密切相關(guān)，主要通過(guò)抑制抑癌基因的活化來(lái)調(diào)控消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9-11]。這提示miR-21和miR-135a與胃癌有密切聯(lián)系，化療后檢測(cè)患者miR-21和miR-135a的表達(dá)或可用于評(píng)估胃癌患者的早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。為此，本研究擬探討胃癌患者血清miR-21、miR-135a表達(dá)與化療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年1月—2018年1月河南省人民醫(yī)院行化療的胃癌患者100例（胃癌組），其中男62例、女38例，年齡38~77歲。腫瘤部位包括賁門(mén)（22例）、胃體（34例）、胃竇（31例）、全胃（13例）；病理類(lèi)型包括單純腺癌（55例）、印戒細(xì)胞癌（10例）、黏液腺癌（6例）、混合型（29例）；參考國(guó)際抗癌聯(lián)盟及美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)發(fā)布的胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[12]進(jìn)行TNM分期：ⅠB期8例、Ⅱ期15例、ⅢA期28例、ⅢB期22例、ⅢC期27例。另選取同期河南省人民醫(yī)院健康體檢者50名（正常對(duì)照組），其中男29名、女21名，年齡38～77歲。2個(gè)組之間年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）以病理學(xué)檢查結(jié)果為診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）入組前未經(jīng)過(guò)放療或化療等治療；（3）臨床資料和隨訪資料齊全，且簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前曾接受手術(shù)、輔助化療或放療；（2）腫瘤類(lèi)型為肉瘤、間質(zhì)瘤或淋巴瘤；（3）化療過(guò)程中死亡；（4）患可經(jīng)血液傳播的傳染性疾病。

1.3 隨訪

在化療后1個(gè)月開(kāi)始對(duì)患者進(jìn)行隨訪，每個(gè)月采用電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）復(fù)查1次，如出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移征象，則通過(guò)磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、正電子發(fā)射斷層顯像（positron emission tomography，PET）/CT和淋巴結(jié)穿刺等方法確診。從2016年2月開(kāi)始，對(duì)患者進(jìn)行24個(gè)月的隨訪。隨訪第12個(gè)月、第14個(gè)月和第18個(gè)月各失訪1例。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

采集所有患者化療前和化療后第3、8、13、18、24個(gè)月的空腹靜脈血10 mL，采集正常對(duì)照者體檢當(dāng)日的空腹靜脈血10 mL，4 ℃1 000×g離心15 min后，分離血清，置于-80 ℃保存待檢。采用Trizol LS試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）提取血清總RNA，采用NanoDrop 2000分光光度計(jì)（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）檢測(cè)總RNA的純度和濃度。將胃癌組與正常對(duì)照組的RNA濃度調(diào)至一致，再使用miRNA 第一鏈 cDNA 合成（加尾法）試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄（37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min）為cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-21和miR-135a表達(dá)。引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-21和miR-135a的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件和Graphpad 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)價(jià)miR-21和miR-135a判斷胃癌預(yù)后的效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組與正常對(duì)照組血清miR-21和miR-135a相對(duì)表達(dá)量比較

與正常對(duì)照組比較，胃癌組化療前血清miR-21相對(duì)表達(dá)量升高（P<0.05），miR-135a相對(duì)表達(dá)量降低（P<0.05），見(jiàn)表2。胃癌組中有79例（79%）miR-21表達(dá)升高，有68例（68%）miR-135a表達(dá)降低。

表2 胃癌組與正常對(duì)照組血清miR-21和miR-135a相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 血清miR-21和miR-135a相對(duì)表達(dá)量與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

胃癌組化療前血清miR-21和miR-135a相對(duì)表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、浸潤(rùn)深度有關(guān)（P<0.05），與年齡、性別、TNM分期、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P>0.05）。見(jiàn)表3。

表3 胃癌組血清中miR-21和miR-135表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系

2.3 胃癌組化療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者血清miR-21和miR-135a相對(duì)表達(dá)量

100例胃癌患者化療后隨訪24個(gè)月，失訪3例。97例完成隨訪的患者中有66例（68%）出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移（復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組），其中25例為局部復(fù)發(fā)、41例為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，有33例死亡。未出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者歸入無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組。

復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組化療后3、8、13、18和24個(gè)月的血清miR-21相對(duì)表達(dá)量高于無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組（P<0.05），miR-135a相對(duì)表達(dá)量低于無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組（P<0.05）。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組化療后血清miR-21相對(duì)表達(dá)量隨隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)而升高（P<0.05），血清miR-135a相對(duì)表達(dá)量隨隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)而降低（P<0.05）。無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組血清miR-21相對(duì)表達(dá)量隨隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)而降低（P<0.05），血清miR-135a相對(duì)表達(dá)量各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表4、表5。

表4 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組各隨訪時(shí)間點(diǎn)血清miR-21相對(duì)表達(dá)量比較

表5 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組各隨訪時(shí)間點(diǎn)血清miR-135a相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 miR-21和miR-135a單項(xiàng)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)判斷胃癌化療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的效能

以患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移作為陽(yáng)性（預(yù)后不良，66例），無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移作為陰性（31例），采用ROC曲線分析隨訪24個(gè)月時(shí)的miR-21和miR-135a檢測(cè)結(jié)果判斷胃癌預(yù)后的效能。結(jié)果顯示，miR-21和miR-135a判斷胃癌預(yù)后的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.789、0.826，最佳臨界值分別為1.27、1.88。以隨訪24個(gè)月時(shí)的miR-21和miR-135a檢測(cè)結(jié)果均陽(yáng)性為聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性，均陰性為聯(lián)合檢測(cè)陰性，miR-21+miR-135a聯(lián)合檢測(cè)判斷胃癌預(yù)后的敏感性和特異性分別為91.2%和67.8%。見(jiàn)表6、圖1。

圖1 隨訪24個(gè)月時(shí)的miR-21和miR-135a判斷胃癌化療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

表6 隨訪24個(gè)月時(shí)的miR-21和miR-135a單項(xiàng)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)判斷胃癌化療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的效能

3 討論

胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，好發(fā)于50歲以上人群，但近年來(lái)有逐漸年輕化的趨勢(shì)，男女性發(fā)病比例約為2∶1[3]。由于胃癌早期癥狀不明顯，易被忽視，當(dāng)患者被確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳的治療時(shí)期，故大部分胃癌患者預(yù)后不良，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高[13]。有研究結(jié)果顯示，miRNA主要參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲、遷移等過(guò)程，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-181、miR-145等參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，可作為胃癌的生物標(biāo)志物[15-16]。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組化療前血清miR-21相對(duì)表達(dá)量高于正常對(duì)照組（P<0.05），miR-135 a相對(duì)表達(dá)量低于正常對(duì)照組（P<0.05）；高表達(dá)miR-21和低表達(dá)miR-135a與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中高分化、浸潤(rùn)程度（漿膜層）密切相關(guān)，但與年齡、性別、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期無(wú)關(guān)，說(shuō)明miR-21和miR-135可能參與了胃癌的發(fā)病過(guò)程。miR-21和miR-135a與消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在消化系統(tǒng)腫瘤，如胃癌中，miR-21表達(dá)上調(diào)，miR-135a表達(dá)下調(diào)[9，17]。miR-21可通過(guò)抑制磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）的表達(dá)，阻礙磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB；又稱(chēng)Akt）信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[18]；還可通過(guò)下調(diào)程序性細(xì)胞死亡因子4（programmed cell death 4，Pdcd4）的表達(dá)，誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移[19]。miR-135a與驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員C1（kinesin family member C1，KIFC1）結(jié)合后可下調(diào)KIFCI的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡[20]。在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，miR-135a可抑制瞬時(shí)受體電位通道1的表達(dá)，從而抑制胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，減緩胃癌的發(fā)展[21]。

miR-21和miR-135a與胃癌的進(jìn)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在24個(gè)月的隨訪期中，化療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的血清miR-21相對(duì)表達(dá)量隨隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)而升高（P<0.05），血清miR-135a相對(duì)表達(dá)量隨隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)而降低（P<0.05）。提示miR-21和miR-135a與胃癌化療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，隨訪24個(gè)月時(shí)的miR-21和miR-135a單項(xiàng)檢測(cè)判斷胃癌預(yù)后的AUC分別為0.789、0.826，敏感性和特異性均>70%，兩者聯(lián)合檢測(cè)可在特異性稍降低（67.8%）的基礎(chǔ)上將敏感性提高至91.2%。這說(shuō)明miR-21和miR-135a聯(lián)合檢測(cè)判斷胃癌患者化療后2年內(nèi)是否會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移具有較好的價(jià)值。

綜上所述，胃癌患者血清miR-21和miR-135a表達(dá)異常，且表達(dá)水平與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、浸潤(rùn)程度密切相關(guān)。血清miR-21和miR-135a聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌化療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的判斷具有較好的價(jià)值。