溴氰菊酯對河川沙塘鱧的毒性效應研究

劉昊宇，鄭友，丁淑燕，劉國興，，史楊白*，孫龍生*

（1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017）

溴氰菊酯（Deltamethyrin,DM），別名敵殺死，化學式為CHBrNO，是一種II型擬除蟲菊酯殺蟲劑，為菊酯類殺蟲劑中毒力較高的一種，具有觸殺和胃毒作用，觸殺作用迅速，擊倒力強，其殺蟲毒力比其他擬除蟲菊酯大5～10倍。在水產養(yǎng)殖上，DM主要防治常見淡水魚類體表錨頭鳋、中華鳋、魚鲺等甲殼蟲類寄生蟲和控制有害水生昆蟲過度增殖，殺蟲持效期長達7～12 d。但在病害防治過程中，溴氰菊酯殘留率較高，對水產動物的毒性較大，使用不當極易中毒。

河川沙塘鱧（）是一種淡水底棲型魚類，廣泛分布在長江中下游及其沿江支流。近年來，隨著河川沙塘鱧人工苗種培育技術的突破，養(yǎng)殖規(guī)模顯著提升，其養(yǎng)殖模式主要以套養(yǎng)為主，是一種極具潛力的經濟養(yǎng)殖品種。河川沙塘鱧對生存環(huán)境要求較高，對外界環(huán)境改變較敏感。菊酯類藥物對水生動物危害性的是近年來的研究熱點之一，其對大型蚤以及蝦蟹類的危害均有報道，對魚類危害的研究主要集中在四大家魚以及海水魚等品種，對河川沙塘鱧的毒性方面的研究較少。于2021年10月開展了溴氰菊酯對河川沙塘鱧的毒性效應試驗，旨在為水生動物疾病的預防、診斷與治療和可持續(xù)型淡水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提供依據。

1 試驗方法

1.1 材料

試驗地位于江蘇省淡水水產研究所揚中基地，選擇經大規(guī)格苗種培育后放入塘口養(yǎng)殖3～4個月的沙塘鱧，均為同批次孵化，其體表光滑，體格健壯，平均體長（10.5±2.0）cm、平均體質量（30.0±5.0）g。馴養(yǎng)時間為1周。試驗前1 d停止投餌，對殘餌作吸污處理。

1.2 藥物

DM原藥購自拜耳作物科學有限公司，有效含量為25 g/L，劑型為乳油。

1.3 試驗條件

河川沙塘鱧在實驗室藍色塑料水箱（60 cm×44 cm×36 cm）內暫養(yǎng)3 d后，開始急性毒性試驗。室內溫度為（22.0±2.0）℃。水箱內分別注入30 L經曝氣7 d以上的自來水，溶解氧為（8.0±1.0）mg/L，pH值為（7.0±0.5），試驗期間不投餌。

1.4 方法與步驟

1.4.1 半致死濃度暴露

根據靜態(tài)測試法，試驗期間不更換試驗液，參照試驗藥物的常用劑量，先進行預試驗，設置5個濃度組，并進行空白對照。根據預試驗結果設置6個梯度組（0、2、4、6、8、10μg/L），每個水箱投放河川沙塘鱧10尾，每個濃度設置3個平行。在試驗開始后的24 h內，河川沙塘鱧藥物暴露后每4 h觀察一次其中毒癥狀。在24 h、48 h、72 h和96 h時記錄魚的死亡率。魚是否死亡的判斷標準是觀察其鰓蓋是否在活動，并用玻璃棒輕觸尾柄觀察是否有應激反應，經多次刺激其無反應，則判定為死亡。

1.4.2 組織病理學觀察

根據急性毒性試驗結果，依照上述同等試驗條件，設置3個濃度梯度（0、10、20μg/L）進行暴露處理。72 h之后，每個濃度處理組各取3尾魚，吸干體表水分，用乙醇輕輕擦拭體表進行消毒，并迅速解剖分離鰓和肝組織，用PBS磷酸緩沖液清洗，吸干表面液體后放入離心管中，加入Bouin’s固定液固定24 h，待石蠟切片制作。固定好的組織徑流水沖洗、脫水、二甲苯中透明2次后進行浸蠟2 h，包埋于石蠟中，用KD-1508A切片機切片，切片厚度為5μm，脫蠟復水，蘇木精-伊紅染色，最后用樹脂膠封片，在顯微鏡下觀察組織病理情況，并拍照分析。

1.4.3 組織生化指標測定

根據急性毒性試驗結果，依照上述同等試驗條件，設置4個濃度梯度（0、5、10、20μg/L）進行暴露處理。每個濃度組在24 h、48 h、72 h、96 h時各取3尾魚，快速將其撈出，避免外界環(huán)境因素影響，并用濕毛巾包裹，分離其鰓及肝臟，用PBS磷酸緩沖液洗濯，清除血跡，轉入到凍存管中，在-70℃冰箱中保存。從冰箱取出后轉入到離心管中，加入PBS勻漿，于3 000 r/min離心15 min，取上清液轉入離心管中，用于測定肝臟超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量以及鰓Na/K-三磷酸腺苷（ATP）酶活性，測定方法按照南京建成生物公司的檢測試劑盒說明書。

1.5 數據處理與統計分析

統計試驗魚在96 h的死亡數，并計算其死亡率。采用寇氏（Korbor）法計算DM對河川沙塘鱧的96 h的半致死濃度（LC和安全濃度，結果以“平均數±標準差”表示。用SPSS19.0進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用Duncan法進行多重比較，<0.05代表組間數據差異顯著，采用Excel2016作圖。

2 結果與分析

2.1 河川沙塘鱧的中毒癥狀

試驗期間，空白對照組未發(fā)現有中毒的沙塘鱧，而10μg/L濃度組的沙塘鱧在暴露2 h后反應激烈，出現狂躁以及撞壁現象。暴露8 h后，8μg/L濃度組的2條沙塘鱧開始出現反應遲緩、身體向一側傾斜、無法平衡的癥狀。12 h后，2個高濃度組（10和20μg/L）的沙塘鱧分別有1條失去行動能力，腹部朝上，躺臥在箱底，用玻璃棒輕觸之后，又重新開始緩慢游動，但1～2 min之后又慢慢沉入水底。18 h后，10μg/L組有2條魚鰓蓋活動緩慢，時而張開，時而閉合，尾部也在緩慢挪動，側躺臥在水底。24 h后，8和10μg/L組的沙塘鱧開始出現死亡現象，鰓蓋張開，魚頭朝下，用玻璃棒輕觸多次均無反應，查看死亡后的沙塘鱧，發(fā)現其眼球凸起。

2.2 急性毒性試驗

DM對河川沙塘鱧的急性毒性試驗結果見表1。由表1可見，96 hDM對河川沙塘鱧的LC為5.29μg/L，安全濃度為0.53μg/L。依據《危險化學品魚類急性毒性分級試驗方法》（GB 21281—2007）判斷，DM對河川沙塘鱧有劇毒。

表1 DM對河川沙塘鱧的急性毒性試驗結果

2.3 DM對河川沙塘鱧鰓Na+/K+-ATP酶活性及組織結構的影響

DM對河川沙塘鱧鰓Na/K-ATP酶活性的影響見圖1，圖中同組數據肩標無字母或字母相同表示差異不顯著（＞0.05），字母不同表示差異顯著（＜0.05）。由圖1可見，空白對照組隨著暴露時間增加，其Na/K-ATP酶活力趨于穩(wěn)定。低濃度組（5μg/L）Na/K-ATP酶活性與對照組（0μg/L）相比差異不顯著，而高濃度組（10和20μg/L）在72、96 h暴露下，Na/K-ATP酶活力比對照組顯著下降。

圖1 DM對河川沙塘鱧鰓Na+/K+-ATP酶活性的影響

20μg/L DM暴露72 h后河川沙塘鱧鰓的組織病理變化見圖2（a）（b）（c）（d）。由圖2可見，未受DM暴露正常沙塘鱧的鰓小片結構清晰，平緩嚴整，沒有出現扭曲、增生、脫落的現象，也沒有血管擴張導致淤血的現象。鰓絲中的上皮組織細胞有序排列，細胞核的結構形狀也較為完整[圖2（a）（b）]。20μg/L的藥物暴露72 h之后，魚鰓小片出現扭曲，鰓小片毛細血管擴張充血，鰓絲紊亂，上皮細胞和柱狀細胞脫落，一些細胞核破裂，黏液細胞增生甚至出現鰓絲斷裂、脫落現象[圖2（c）（d）]。

圖2 20μg/L DM暴露72 h后河川沙塘鱧鰓的組織病理變化

2.4 DM對河川沙塘鱧肝臟抗氧化能力及肝臟組織結構的影響

DM對河川沙塘鱧肝臟SOD和CAT活性、MDA含量的影響見圖3（a）（b）（c）。圖中同組數據肩標無字母或字母相同表示差異不顯著（＞0.05），字母不同表示差異顯著（＜0.05）。由圖3可見，與對照組相比，低濃度組（5μg/L）經96 h暴露，試驗魚肝臟SOD活性有了明顯提升，高濃度組（10和20μg/L）經72 h和96 h暴露，SOD活性均呈顯著下降。低濃度組（5μg/L）暴露24 h時CAT活性迅速上升，高濃度組（10和20μg/L）CAT活性則顯著降低（<0.05），10μg/L組暴露48 h后CAT活性顯著上升，20μg/L組CAT活性則先降低后恢復正常。低濃度組（5μg/L）魚肝臟MDA含量呈現先升高后降低趨勢，而中高濃度組MDA含量隨暴露時間延長總體呈現明顯增高。

圖3 DM對河川沙塘鱧肝臟SOD和CAT活性、MDA含量的影響

20μg/L DM暴露72 h后河川沙塘鱧肝臟的組織病理變化見圖4（a）（b）（c）（d）。由圖4（a）（b）可見，病理組織學觀察結果表明，未受過DM急性暴露正常沙塘鱧肝臟組織細胞形態(tài)呈現多角形，結構完整，細胞核為圓形，大小一致，細胞間界限清晰，細胞質較豐富。由圖4（c）（d）可見，20μg/L的處理組暴露72 h之后，肝細胞間隙增大，肝臟肝竇有出血擴張現象，肝細胞體積縮小，細胞間界限變得模糊，細胞核退化甚至消失，細胞質經伊紅染色表現深紅色，上皮細胞排列疏松呈現空泡樣。

圖4 20μg/L DM暴露72 h后河川沙塘鱧肝臟的組織病理變化

3 討論

總體來看，DM對一般水生動物都有劇毒，不同水生動物對DM的毒性效應存在一定差異。Prusty等報道DM對翠鱧（）96 h LC是0.75μg/L。周兵等通過研究后得出DM對孔雀魚和月光魚的96 h LC分別為0.23 mg/L、0.35 mg/L。本研究中，DM對河川沙塘鱧的96 h LC是5.29μg/L，與相關報道差異較大，原因可能與試驗動物種類、年齡、體質量存在聯系。另外，藥物對魚類毒性的影響因素還與諸如氣溫、氣壓、濕度、季節(jié)等環(huán)境因素的差異等均有關系，故評價藥物的毒性還需要根據其他毒理生化指標進行綜合評價。

DM屬于高親脂性殺蟲劑，不易溶于水，但魚類的吸收率較高，DM特別容易被鰓吸收，影響鰓的功能，導致鰓形態(tài)和結構受到不同程度的損傷，甚至細胞破裂凋亡。本研究中，沙塘鱧受高濃度DM（10、20μg/L）暴露72 h以上，鰓Na/K-ATP酶活性顯著下降。有研究用甲氰菊酯急性暴露于鰱，結果顯示鰓組織中Na/K-ATP酶的活性也呈下降趨勢，鰓組織中的氯細胞被破壞可能造成了Na/K-ATP酶活性的降低。除菊酯類農藥外，也有研究表明其他成分如微量元素也有類似的抑制作用，張清雯等用微量元素鑭和硒作用于條紋鋸鮨，Na/K-ATP酶活性隨時間呈極顯著抑制。Na/K-ATP存在于鰓組織的氯細胞中，而氯細胞存在于鰓小葉基部，在高濃度藥物的脅迫下，Na/K-ATP酶系統被破壞，鰓組織Na/K-ATP酶活性下降，魚體的離子代謝和滲透平衡功能喪失，細胞發(fā)生變性甚至壞死。

鰓組織細胞的病變和功能喪失是DM導致沙塘鱧致死的關鍵原因之一。組織病理學觀察顯示，DM對沙塘鱧的鰓組織造成了明顯的組織損傷，鰓的呼吸、轉化、代謝等生理功能減弱或喪失，進而魚類呼吸以及排泄等功能受阻，出現缺氧現象。有研究表明類似缺氧現象會影響機體其他組織器官的正常生理功能，嚴重時則會導致魚類死亡。藥物急性暴露下，鰓結構的紊亂，鰓小片細胞的增生，減少了吸收氧的有效面積，呼吸系統遭到破壞，肝臟和腎臟失調，魚體內大量有害氣體不能及時排出，魚體會“間接中毒”。

魚類的肝臟是維持魚體穩(wěn)定內循環(huán)和新陳代謝的關鍵器官，是調節(jié)、排泄外來有害物質的主要場所，肝臟脂質氧化損傷是環(huán)境污染物導致生物死亡的一個重要原因。MDA是脂質過氧化過程的最終代謝產物，所以MDA含量的變化能夠反映膜脂質氧化損傷的程度。本研究中，DM對MDA含量的變化呈現明顯的劑量效應和時間效應，高濃度長時間接觸DM，沙塘鱧肝臟出現了氧化損傷。肝臟MDA含量的增加可能與SOD酶活性的顯著抑制存在關聯。毒物脅迫暴露的早期，生物機體組織中相關酶活性增強，出現“毒物興奮效應”。這種生物酶的增益現象，是機體應對環(huán)境變化產生的一種應激反應。隨著暴露濃度的增大和暴露時間的延長，機體自身器官內的組織受到破壞，脂質則會嚴重過氧化導致魚類損傷，導致酶活力的降低。

本研究組織病理學觀察結果顯示，急性暴露后，肝細胞間隙增大，肝臟肝竇有出血擴張現象，上皮細胞排列疏松呈現空泡樣。肝細胞的空泡化現象是魚類肝臟對一些藥物暴露的常見反應，肝細胞中空泡增加表明肝細胞中的糖脂代謝能力降低。蔣彌對鯽的研究中也發(fā)現，被病原菌感染的鯽，其肝臟細胞核不規(guī)則，出現細胞空泡化的癥狀。一些關于尼羅河羅非魚毒性效應研究發(fā)現，藥物在魚體積累和代謝的過程中產生了病理損傷，進而導致組織結構發(fā)生變化和肝臟的損壞。因此急性暴露下，肝細胞變性壞死導致魚類肝臟藥物代謝解毒功能下降甚至喪失，肝組織結構大量發(fā)生病理變化，加速魚類死亡。

4 結論

DM對河川沙塘鱧具有劇毒作用，其96 h LC為5.29μg/L，安全濃度為0.53μg/L。毒理機制可能與DM嚴重干擾了沙塘鱧鰓組織Na/K-ATP酶活性及肝臟細胞的抗氧化機制，進而干擾了正常的生理功能，最終導致組織結構病變，引發(fā)毒性效應有關。