HPLC法測(cè)定復(fù)方絞股藍(lán)袋泡茶中槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量

李燕思，劉 梅，許桂麗，尹瓊玉，魯 毅

（東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院藥學(xué)部,江蘇 南京 210002）

復(fù)方絞股藍(lán)袋泡茶為東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院院內(nèi)制劑［制字（2016）F516004］，由絞股藍(lán)、決明子、三七花三種中藥材組成，處方中三種藥材比例為3∶5∶2。該制劑具有清熱平肝、化瘀祛濕的功效，可用于高血脂、高血壓的輔助治療。方中絞股藍(lán)為葫蘆科植物絞股藍(lán)Gynostemma pentaphyllumMakino 的干燥地上部分，具有清熱解毒、止咳祛痰、生津安神等作用，廣泛應(yīng)用于心腦血管、腫瘤等疾病的治療［1-2］。研究表明，絞股藍(lán)中含有多種皂苷、黃酮、多糖等化學(xué)成分，目前對(duì)其有效成分的研究多集中在皂苷成分，而對(duì)另一類活性成分黃酮關(guān)注較少［3-4］。研究表明，黃酮類化合物具有顯著的生理活性，如抗氧化、清除氧自由基、改善心腦血管循環(huán)和調(diào)節(jié)血壓等［5-6］?；诖耍驹囼?yàn)采用HPLC 法測(cè)定復(fù)方絞股藍(lán)袋泡茶中黃酮類成分槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量，為全面有效控制該制劑的質(zhì)量提供參考和依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器 SPD10A 高效液相色譜儀（日本島津公司）；FA-2004N 電子天平（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；CPA225D電子天平（德國(guó)賽多利斯股份公司）。

1.2試藥 槲皮素（批號(hào)：100081-200406）、山柰素（批號(hào)：110861-201611）、異鼠李素對(duì)照品（批號(hào)：110860-200608），均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品研究所；復(fù)方絞股藍(lán)袋泡茶（每袋3.0 g，本院制劑室自制）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方 法

2.1色譜條件 色譜柱：InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；進(jìn)樣量：10 μl。理論塔板數(shù)按槲皮素、山柰素、異鼠李素峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 取槲皮素、山柰素、異鼠李素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成槲皮素、山柰素、異鼠李素濃度分別為28.3 μg/ml、31.6 μg/ml、22.4 μg/ml 的混合溶液，微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取本品裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，混合均勻，研細(xì)，精密稱定3.0 g，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇20 ml、25%鹽酸溶液5 ml，搖勻，置水浴中加熱回流30 min，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例制備缺絞股藍(lán)藥材的陰性制劑，按“2.2.2”供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10μl，按以上色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果待測(cè)的三種成分與相鄰色譜峰的分離度均＞2，能達(dá)到較佳的分離效果，且陰性對(duì)照溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品（A）、供試品（B）、陰性對(duì)照（C）HPLC色譜圖

2.4線性關(guān)系考察 分別取槲皮素、山柰素、異鼠李素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成含槲皮素、山柰素、異鼠李素分別為71.26 μg/ml、79.37 μg/ml、48.40 μg/ml 的混合對(duì)照品貯備液。精密吸取上述混合對(duì)照品貯備液各1 ml、2 ml、4 ml、6 ml、8 ml，置10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。精密稱取系列溶液各10μl，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)Y，以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。槲皮素、山柰素、異鼠李素的回歸方程分別為：Y=4.2×106X-37 975（r=0.999 8）、Y=4.3×106X-68 611（r=0.999 5）、Y=4.1×106X-19 226（r=0.999 7），結(jié)果表明槲皮素在0.071～0.570μg、山柰素在0.079～0.635 μg、異鼠李素在0.048～0.387 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液10μl，按“2.1”項(xiàng)下方法檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)出槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD 分別為1.26%、1.08%、1.31%（均n=6），結(jié)果表明精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)為170213），分別于0 h、8 h、16 h、24 h、48 h進(jìn)樣10μl，按上述條件測(cè)定峰面積，結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素RSD 分別為1.72%、1.06%、0.98%（均n=6），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一供試品（批號(hào)為170213），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法依次測(cè)定，計(jì)算得出槲皮素、山柰素、異鼠李素含量，RSD 分別為1.54%、1.16%、1.63%（均n=6），結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)為170213）1.5 g，精密加入一定濃度的槲皮素、山柰素、異鼠李素混合對(duì)照品溶液各1 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下方法檢測(cè)，計(jì)算樣品含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=5）

2.9樣品含量測(cè)定 取3 批復(fù)方絞股藍(lán)袋泡茶樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算得槲皮素、山柰素、異鼠李素含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果 （n=3，mg/g）

3 討 論

3.1定量物質(zhì)的選擇 絞股藍(lán)是復(fù)方絞股藍(lán)袋泡茶的主要藥物，其黃酮成分含量為2%～5%［4］。黃酮作為植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物之一，其主要功能為調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)素的運(yùn)輸，且具有多種生物活性［5-7］。本研究選擇以絞股藍(lán)中黃酮類成分槲皮素、山柰素、異鼠李素為定量成分，能對(duì)復(fù)方絞股藍(lán)袋泡茶的質(zhì)量進(jìn)行有效控制。

3.2供試品提取方法的選擇 參考相關(guān)文獻(xiàn)［8］及《中華人民共和國(guó)藥典》中槲皮素等黃酮醇苷的提取方法［9］，選擇以甲醇∶鹽酸（體積比4∶1）為溶劑，鹽酸濃度分別設(shè)為15%、25%、35%，采用加熱回流提取供試品。結(jié)果顯示，提取率隨鹽酸濃度增高而增高，但鹽酸濃度不宜過(guò)高，否則將對(duì)高效液相進(jìn)樣閥和色譜柱有腐蝕，最終采用甲醇∶25%鹽酸（體積比4∶1）為溶劑對(duì)供試品進(jìn)行提取。

3.3流動(dòng)相的選擇 參考文獻(xiàn)［10］中流動(dòng)相的選擇，槲皮素、山柰素、異鼠李素與其他成分分離效果不佳。后根據(jù)待測(cè)成分的特點(diǎn)，并參考文獻(xiàn)［11-12］，適當(dāng)提高磷酸水溶液比例，選用甲醇-0.4%磷酸（50∶50）作為流動(dòng)相，待測(cè)的三種成分與相鄰色譜峰的分離度均＞2，能達(dá)到較佳的分離效果。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法測(cè)定復(fù)方絞股藍(lán)袋泡茶中槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量，方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于復(fù)方絞股藍(lán)袋泡茶的含量測(cè)定和質(zhì)量控制。