基于阿爾茨海默病模型小鼠研究不同炮制程度制首烏長(zhǎng)期用藥對(duì)肝腎的影響

池鑫宇，楊 柯，段云天，曹子茵，周觀琳，李紹燕，曾春暉＊

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

何首烏為蓼科多年生草本植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根，是一味典型的“生熟異用”藥材，生何首烏味苦性平，具有解毒、消癰、截瘧、潤(rùn)腸通便的功效；制何首烏味甘性溫，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨的功效［1］。傳統(tǒng)認(rèn)為，何首烏通過(guò)“九蒸九曬”炮制后，可以改變藥物的藥性，增強(qiáng)滋補(bǔ)功效，降低清瀉之功［2］。

阿爾茨海默?。╝lzheimer’s disease，AD）是一種以認(rèn)知功能障礙、記憶缺失為外在特征的神經(jīng)退行性疾病。何首烏是中醫(yī)治療AD 的常用藥物［3］，臨床多用生品。近年國(guó)內(nèi)外對(duì)何首烏肝毒性的不良反應(yīng)報(bào)道增多，其用藥安全性受到質(zhì)疑［4-6］。有研究報(bào)道，炮制能夠減輕生何首烏所致肝組織病變，降低對(duì)人正常肝細(xì)胞L02 的損傷，減弱何首烏肝毒性［7-8］。筆者在另一實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，與何首烏生品比較，炮制后何首烏可增強(qiáng)淀粉樣前體蛋白/早老素-1（APP/PS1）阿爾茨海默病模型小鼠的認(rèn)知能力，何首烏“六蒸六曬”炮制品對(duì)小鼠工作記憶與陳述性記憶水平有顯著改善作用（將另文發(fā)表）。為探究何種炮制程度的何首烏既能較好地改善AD 癥狀，又能降低毒性，本研究針對(duì)APP/PS1阿爾茨海默病模型小鼠長(zhǎng)期給予不同炮制程度的何首烏水煎液，觀察長(zhǎng)期用藥對(duì)小鼠肝腎的影響，旨為何首烏的炮制減毒理論提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物 野生型（wild type，WT）C57BL/6J 小鼠8只，雄性，16 周齡，體質(zhì)量（25±2）g；淀粉樣前體蛋白/早老素-1（APP/PS1）雙轉(zhuǎn)基因小鼠72 只，雄性，16 周齡，體質(zhì)量（27±2）g；均購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0010。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于相對(duì)濕度（60±15）%、溫度（23±2）℃、自然節(jié)律光照的SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，不限制飲食。

1.2藥物與試劑 何首烏生品飲片購(gòu)買于廣東德慶藥材批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)郭敏副教授鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根；蘇木素染液（批號(hào)：CR2102133）與伊紅染液（批號(hào)：CR2101094）購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司；生化指標(biāo)試劑盒：谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST，批號(hào)：C010-2-1）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批號(hào)：C009-2-1）、堿性磷酸酶（ALP，批號(hào)：C007-2-1）、乳酸脫氫酶（LDH，批號(hào)：A020-2-2）、尿素氮（BUN，批號(hào)：C013-2-1）和肌酐（CRE，批號(hào)：C011-2-1）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3儀器 2245型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（Leica公司）；JT-12S型自動(dòng)組織脫水機(jī)（俊杰電子有限公司）；BMJ-A 型組織包埋機(jī)（中威電子儀器廠）；LRH-250-S恒溫培育箱（泰宏醫(yī)療器械有限公司）；Synergy H1 型全功能酶標(biāo)儀（BioTek公司）。

2 方 法

2.1何首烏炮制品的制備 按照傳統(tǒng)黑豆汁制“九蒸九曬”炮制方法對(duì)何首烏進(jìn)行炮制［9-10］。稱取適量黑豆，加8 倍量水，煎煮4 h，濃縮熬汁，黑豆渣再加水煮3 h，濃縮熬汁，合并黑豆汁。每10 kg何首烏片用以黑豆1 kg 制備好的黑豆汁浸潤(rùn)1 h，放入常壓蒸箱，96 ℃蒸制4 h，取出，攤平置于日光下曝曬6 h，大約曬至七成干，如此為“一蒸一曬”。重復(fù)蒸曬工藝，分別制備得到“三蒸三曬”制何首烏（Process-3，P3）、“六蒸六曬”制何首烏（Process-6，P6）、“九蒸九曬”制何首烏（Process-9，P9），均按比例留樣備用。

2.2何首烏生品及不同炮制品水煎液的制備 取何首烏生品（Raw-0，R0）、三蒸三曬品（P3）、六蒸六曬品（P6）與九蒸九曬品（P9）各10 kg，加入8 倍量水，浸潤(rùn)1 h，煮制1.5 h，過(guò)濾藥液；藥渣再加入8 倍量水煎煮1.5 h，合并藥液，減壓濃縮至約1.5 g（生藥）/g 的流浸膏，稱重，準(zhǔn)確計(jì)算生藥重量與流浸膏重量比值，低溫保存待用。

2.3動(dòng)物分組與給藥 取野生型C57BL/6J 小鼠8 只作為野生型組（WT）；再將APP/PS1 小鼠隨機(jī)分為9組：轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M（Transgenic，TG），何首烏生品高、低劑量組（R0-H、R0-L），“三蒸三曬”制何首烏高、低劑量組（P3-H、P3-L），“六蒸六曬”制何首烏高、低劑量組（P6-H、P6-L），“九蒸九曬”制何首烏高、低劑量組（P9-H、P9-L），每組8只。WT組和TG組灌胃給予生理鹽水，R0-H、R0-L、P3-H、P3-L、P6-H、P6-L、P9-H、P9-L組分別灌胃給予生品及不同炮制程度的何首烏水煎液，高劑量均為10 g（生藥）/kg，低劑量均為5 g（生藥）/kg，灌胃容積為10 ml/kg，1次/天，連續(xù)180 d。灌胃給藥期間觀察每只動(dòng)物狀態(tài)變化，稱量并記錄每日體重。

2.4取材與指標(biāo)檢測(cè) 小鼠末次給藥后禁食18 h，采血，處死，解剖并檢查臟器形態(tài)學(xué)變化；摘取小鼠附睪旁脂肪、腸系膜周圍脂肪、腋下脂肪和肩胛周圍脂肪，稱量總重，計(jì)算體脂率；剪取肝臟、腎臟、脾臟、睪丸、胸腺、腸系膜淋巴結(jié)，分別稱重，計(jì)算臟器系數(shù)；采集的血液于室溫靜置1 h，3 000 r/min 離心5 min，分離得到血清，檢測(cè)各組小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、乳酸脫氫酶（LDH）、尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）的水平［11］。

2.5病理學(xué)觀察 統(tǒng)一剪取小鼠肝左葉部分組織做病理切片并經(jīng)“蘇木精-伊紅染色法”HE 染色。使用數(shù)字切片掃描儀進(jìn)行圖像采集，切片先于40倍物鏡下觀察整體組織，采集圖像，觀察具體病變，統(tǒng)計(jì)肝臟病變率。此外，將動(dòng)物肝臟病理?yè)p傷的具體癥狀進(jìn)行評(píng)分，按肝細(xì)胞空泡變性、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞壞死的嚴(yán)重程度計(jì)分（無(wú)損傷計(jì)為0分，“+”計(jì)為1分，“++”計(jì)為2 分，“+++”計(jì)為3 分），再將3 項(xiàng)評(píng)分取合計(jì)總分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.6數(shù)據(jù)處理 使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，其中多樣本計(jì)量資料采用單因素方差分析（one way ANOVA）。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1動(dòng)物狀態(tài)及體重、體脂率變化 TG 組小鼠在灌胃90 d 左右發(fā)現(xiàn)有部分小鼠出現(xiàn)早衰的現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為小鼠皮毛光澤黯淡，出現(xiàn)較多白色毛發(fā)，在籠中的活動(dòng)減少。與TG組相比，P3-H、P6-H、P9-H組小鼠狀態(tài)較好，自主活動(dòng)多，僅有個(gè)別小鼠出現(xiàn)少量白色毛發(fā)。此外，在灌胃前30 d 內(nèi)，發(fā)現(xiàn)多只R0 組小鼠出現(xiàn)溏便癥狀。

在180 d給藥過(guò)程中，各組小鼠體重變化如圖1所示。WT 組小鼠的體重始終低于其他組別小鼠。TG組曲線大多時(shí)間都處于其他組別曲線上方，而灌胃生品及不同炮制程度何首烏水煎液的組別體重變化曲線均低于TG 組。TG 組體重增長(zhǎng)率、體脂率相比WT組顯著增加（P＜0.05）。與TG 組比較，R0-H 和R0-L組的體重增長(zhǎng)率、體脂率有一定的下降，但無(wú)顯著性差異；各炮制品組的體重增長(zhǎng)率較TG 組無(wú)顯著性差異，而體脂率均顯著下降（均P＜0.05）。如表1所示。

圖1 給藥過(guò)程中各組小鼠體重變化折線圖

表1 各組小鼠給藥后體重增長(zhǎng)率與體脂率比較（±s，n=8）

表1 各組小鼠給藥后體重增長(zhǎng)率與體脂率比較（±s，n=8）

注：與WT組比較，①P＜0.05；與TG組比較，②P＜0.05

?

3.2解剖檢查與臟器系數(shù) 在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)解剖檢查小鼠各重要臟器病變情況。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)R0-H 與R0-L 組各有5 只小鼠肝臟出現(xiàn)較明顯瘀血，為“檳榔肝”樣表現(xiàn)；此外，R0-H組有1只小鼠（雙側(cè)睪丸總重與系數(shù)僅有0.035 g、0.11%），明顯小于TG 組（0.189 g、0.55%）；其余組別小鼠臟器無(wú)肉眼可見(jiàn)病變。

連續(xù)灌胃180 d 后小鼠的肝、腎、脾等臟器系數(shù)的結(jié)果見(jiàn)表2。各組小鼠肝臟系數(shù)相近，無(wú)顯著差異。TG 組小鼠的腎臟系數(shù)顯著低于WT 組（P＜0.05），其余給藥組系數(shù)有所回升，R0-H 組顯著高于TG 組（P＜0.05）。TG 組與WT 組小鼠脾臟系數(shù)相近，無(wú)顯著差異，與TG 組相比，R0-H、P9-H 和P9-L 組脾臟系數(shù)顯著升高（P＜0.05）。在胸腺、淋巴和睪丸的臟器系數(shù)方面，TG 組顯著低于WT 組（P＜0.05），其他給藥組與TG 組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。此外，R0 組小鼠睪丸系數(shù)與TG 組相比有較明顯的下降。

表2 各組小鼠臟器系數(shù)比較 （±s，n=8，%）

表2 各組小鼠臟器系數(shù)比較 （±s，n=8，%）

注：與WT組比較，①P＜0.05；與TG組比較，②P＜0.05

?

3.3血清生化指標(biāo) 各組小鼠血清指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。WT 組與TG 組小鼠的各項(xiàng)血清生化指標(biāo)不存在顯著差異。與TG 組比較，R0-H 組AST、ALT、LDH 水平顯著升高（P＜0.05），R0-L 組AST、LDH、BUN 水平顯著升高（P＜0.05）；與R0-L 組比較，P3-L、P6-L、P9-L組的AST、BUN 均明顯降低，P9-L 組 的AKP 顯 著 升高，P6-L 組的LDH 顯著降低（均P＜0.05）；與R0-H組比較，P6-H 和P9-H 組的AST、BUN 水平顯著降低（P＜0.05）。各組小鼠CRE水平無(wú)明顯差異。

表3 各組小鼠生化指標(biāo)比較 （±s，n=8）

表3 各組小鼠生化指標(biāo)比較 （±s，n=8）

注：與TG組比較，①P＜0.05；與R0-H比較，②P＜0.05；與R0-L比較，③P＜0.05

?

3.4小鼠肝臟組織病變及評(píng)分 各組小鼠肝臟組織HE 染色切片圖見(jiàn)圖2。WT 組與TG 組小鼠肝臟病理無(wú)明顯差異。各組小鼠肝臟病變及病理評(píng)分見(jiàn)表4。R0-H 和R0-L 組各見(jiàn)5 只小鼠（5/8）部分肝細(xì)胞空泡變性，2 只小鼠（2/8）肝細(xì)胞壞死，壞死區(qū)域伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。不同炮制程度何首烏組病變率明顯降低，P3-H 組中有3 只小鼠（3/8）部分肝細(xì)胞輕微空泡變性，2 只小鼠（2/8）肝細(xì)胞壞死；P6-H 組僅見(jiàn)1 只小鼠（1/8）肝細(xì)胞空泡變性；P9-H 組中有2 只小鼠（2/8）部分肝細(xì)胞空泡變性。對(duì)動(dòng)物肝組織進(jìn)行病理評(píng)分，WT 組與TG 組的病理評(píng)分總分接近，R0 組顯著高于TG組（P＜0.05）；與R0組比較，不同炮制程度何首烏組的病理評(píng)分隨著炮制程度加深而降低，其中P6-H組的病理?yè)p傷評(píng)分最低。

表4 各組小鼠肝臟病變及病理評(píng)分比較 （只，n=8）

圖2 各組小鼠肝臟組織HE染色切片（×400）

4 討 論

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，何首烏經(jīng)過(guò)炮制后其毒性明顯降低，且低于生何首烏［12-13］。本研究基于“六蒸六曬”何首烏能較好地改善阿爾茨海默病模型小鼠AD 癥狀的實(shí)驗(yàn)，在有效劑量下探究何種炮制程度何首烏長(zhǎng)期給藥對(duì)模型小鼠的毒性較小，可為何首烏的炮制提供科學(xué)依據(jù)。

與相同月齡的WT 組小鼠相比，TG 組小鼠體重明顯升高，與其他學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)一致，這可能與小鼠轉(zhuǎn)入AD相關(guān)基因后代謝異常有關(guān)［14］。本實(shí)驗(yàn)中灌胃給予何首烏后轉(zhuǎn)基因小鼠體重增長(zhǎng)率與體脂率均降低，這可能與何首烏調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用有關(guān)［15］。TG 組小鼠與WT 組小鼠血清生化指標(biāo)和病理均無(wú)顯著差異，說(shuō)明外源轉(zhuǎn)入的與阿爾茨海默病有關(guān)的基因（APPswe，PS1ΔE9）對(duì)小鼠肝臟無(wú)明顯影響，故本研究將TG 組和其余轉(zhuǎn)基因小鼠用藥組進(jìn)行對(duì)比，保持控制變量的準(zhǔn)則。研究發(fā)現(xiàn)，與TG 組比較，R0-H 組AST、ALT 和LDH 水平顯著升高，R0-L 組AST、LDH、BUN 水平顯著升高；而P3、P6和P9制何首烏組水平有一定升高趨勢(shì)但均低于生品何首烏組。該變化規(guī)律也在病理切片檢查中得到驗(yàn)證，生品何首烏組（R0-H/L）病變率最高，均達(dá)到75%，而P6-H 組病變率最低，僅為12.5%，肝臟病理評(píng)分呈現(xiàn)類似變化趨勢(shì)。綜合生化指標(biāo)和病理檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，何首烏的毒性隨著炮制程度的加深呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。研究表明，生品何首烏具有一定毒性，經(jīng)炮制后何首烏長(zhǎng)期用藥無(wú)明顯毒性，“九蒸九曬”炮制法可以明顯降低何首烏毒性，其中P6與P9炮制程度的何首烏無(wú)明顯毒性。