泌尿清丸對慢性非細(xì)菌性前列腺炎模型大鼠的影響及作用機(jī)制探討

李 斌，黃德亮，鄭慧瀾，蔡 強(qiáng)，吳 鵬，李睿舒

（荊州市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 荊州 434000）

慢性前列腺炎（chronic prostatitis，CP）為中青年男性常見的生殖系統(tǒng)疾病，約50%的成年男性一生中某個階段會受到該病的困擾［1］，其中慢性非細(xì)菌性前列腺炎（chronic nonbacterial prostatitis，CNP）約占前列腺炎的90%以上［2］。CNP 發(fā)病緩慢，病情反復(fù)，纏綿難愈，主要癥狀表現(xiàn)為下腹部、會陰部疼痛或盆腔不適，伴隨尿頻、尿急、尿痛、下尿路激惹或阻塞、性功能障礙、抑郁等［3］，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。臨床治療主要以α-受體阻滯劑、非甾體類抗炎藥等緩解癥狀，但療效不甚理想，且復(fù)發(fā)率較高［4］。中醫(yī)藥治療慢性非細(xì)菌性前列腺炎具有明顯特色及優(yōu)勢。本研究探討泌尿清丸對慢性非細(xì)菌性前列腺炎模型大鼠的影響及其作用機(jī)制，旨為中醫(yī)藥治療慢性非細(xì)菌性前列腺炎提供新思路。

1 實驗材料

1.1動物 SD 品系大白鼠，雄性，SPF 級，體質(zhì)量180～220 g，購于長江大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于長江大學(xué)實驗動物中心清潔級動物房，動物合格證號：SCXK（鄂）2017-0012。動物自由飲水，予固體飼料飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：室溫18～20 ℃，相對濕度60%～70%，12 h/12 h 光照黑暗循環(huán)。實驗動物管理均遵守《中華人民共和國衛(wèi)生部動物實驗管理條例》。

1.2試藥與試劑 泌尿清丸為我院院內(nèi)制劑（批文號：JZY1034），由桂枝、茯苓、澤蘭、赤芍、桃仁、紅花、金錢草、黃柏、石葦、豬殃殃、蒲公英、萆薢、菟絲子、三棱、莪術(shù)、王不留行、山茱萸、山藥、川芎、白芍等組成。上述藥材經(jīng)檢驗均符合2020年版《中華人民共和國藥典》一部各藥材項下的規(guī)定。取上述藥材，由我院中藥室以一定比例按提取工藝進(jìn)行提取、分離、濃縮、干燥，制備成丸劑，每8丸含生藥3 g。IL-8（白細(xì)胞介素8，批號：AF7245）、TNF-α（腫瘤壞死因子α，批號：AF7873）、IL-1β（白細(xì)胞介素1β，批號：AF7210）、IL-4（白細(xì)胞介素4，批號：AF7230）、IL-6（白細(xì)胞介素6，批 號：AF7237）、IL-10（白 細(xì) 胞 介 素10，批 號：AF7249）、β-actin（β-肌動蛋白，批號：AF5001）單抗均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3儀器 熒光倒置顯微鏡（德國Leica 公司產(chǎn)品）；550型酶標(biāo)儀（美國Bio Rad公司產(chǎn)品）。

2 實驗方法

2.1動物分組與造模 取65 只大鼠，隨機(jī)抽取10 只作為空白組，余55 只按文獻(xiàn)［5］進(jìn)行造模。大鼠腹腔注射0.6%戊巴比妥鈉麻醉（30 mg/kg），剪除下腹被毛，于無菌條件下在下腹部正中切口，直達(dá)腹腔，提起膀胱及兩側(cè)精囊，暴露附于精囊內(nèi)側(cè)的前列腺背葉，緩慢注射0.1 ml 完全弗氏佐劑至前列腺組織（空白組大鼠注入0.1 ml 生理鹽水），送復(fù)臟器，逐層縫合肌肉皮膚。術(shù)后每只大鼠肌注慶大霉素0.1 ml 預(yù)防感染。飼養(yǎng)2 周后，隨機(jī)選取5 只造模大鼠，行前列腺組織病理切片后確認(rèn)模型成功。造模成功后，再隨機(jī)分為模型組、陽性對照組（普樂安片）和泌尿清丸低、中、高劑量組，每組10只。

2.2給藥 造模成功后第7 d 各組大鼠開始給藥，根據(jù)動物與人體表面積換算法計算出給藥劑量?？瞻捉M和模型組灌胃給予蒸餾水；陽性對照組灌胃給予普樂安片，給藥劑量為2 g/kg（相當(dāng)于成人日用量的20倍），臨用前用生理鹽水制備成0.2 g/ml 的混懸液；泌尿清丸高、中、低劑量組灌胃給予泌尿清丸，給藥劑量分別為16 g/kg、8 g/kg、4 g/kg（分別相當(dāng)于成人日用量的20、10、5 倍），臨用前用生理鹽水分別制備成1.6 g/ml、0.8 g/ml、0.4 g/ml的混懸液。各組大鼠灌胃容積均為10 ml/kg，1次/日，連續(xù)45 d。

2.3取材方法 末次給藥后禁食24 h，稱大鼠體質(zhì)量后以3 ml/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉，開腹后腹主動脈取血，置于抗凝真空采血管中，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ〕銮傲邢俜Q定其濕重，肉眼觀察前列腺體顏色變化、有無灰白色結(jié)節(jié)及腺體與周圍組織粘連等。然后將前列腺迅速橫向分為2 份，一份放入10%中性甲醛中固定48 h，逐級乙醇脫水，透明、浸蠟、石蠟包埋，常規(guī)4μm 切片，HE 染色，在高倍鏡（HP）下觀察前列腺間質(zhì)充血、水腫和間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤情況。另一份放入液氮，凍存，備用。

2.4觀察指標(biāo)

2.4.1一般檢查 觀察大鼠狀態(tài)、行為、體征。于給藥前和給藥后每3 天記錄各組大鼠體質(zhì)量，給藥結(jié)束后稱重前列腺質(zhì)量，計算前列腺指數(shù)。

2.4.2光鏡檢查 組織切片：HE 染色大鼠前列腺組織，高倍鏡下觀察切片標(biāo)本，隨機(jī)選取切片標(biāo)本的10個視野，在高倍鏡（HP）下觀察前列腺間質(zhì)充血、水腫和間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤情況。前列腺組織間質(zhì)充血、水腫判斷標(biāo)準(zhǔn)：無為“-”，輕度為“±”，較明顯為“+”，顯著為“++”；前列腺組織間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤判斷標(biāo)準(zhǔn)：0個細(xì)胞/HP為“-”，1～9個細(xì)胞/HP為“±”，10～19個細(xì)胞/HP 為“+”，≥20 個細(xì)胞/HP 為“++”。白細(xì)胞和卵磷脂小體計數(shù)：用天平稱定前列腺濕重后取50 mg，將前列腺組織放入試管內(nèi)，加人200μl 白細(xì)胞稀釋液和200 μl 生理鹽水中，充分混勻，取部分組織勻漿光鏡下觀察白細(xì)胞（WBC）和卵磷脂小體（DLCC）并計數(shù)。

2.4.3免疫組化檢測 檢測IL-8、TNF-α、IL-1β 和IL-4、IL-6、IL-10 在大鼠前列腺組織中的表達(dá)。前列腺組織用10%中性甲醛固定后，常規(guī)包埋切片。用顯微鏡對切片進(jìn)行觀察、拍照。高倍鏡下觀察切片標(biāo)本，隨機(jī)選取每個切片標(biāo)本的10 個視野，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)（Image Pro Plus 6.0）測定每個視野陽性信號平均光密度值（OD），取均值，作為陽性染色的表達(dá)量。

2.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料如符合正態(tài)分布，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用One-Way ANOVA 或t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1泌尿清丸對大鼠體質(zhì)量、前列腺的影響 見表1。各組大鼠體質(zhì)量比較無顯著性差異（P＜0.05）。與空白組比較，模型組前列腺濕重和前列腺指數(shù)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和泌尿清丸低、中、高劑量組前列腺濕重和前列腺指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；且泌尿清丸各劑量組隨著給藥劑量的增加，前列腺指數(shù)降低。

表1 泌尿清丸對大鼠體質(zhì)量和前列腺的影響 （±s）

表1 泌尿清丸對大鼠體質(zhì)量和前列腺的影響 （±s）

注：與空白組比較，①P＜0.05，與模型組比較，②P＜0.05

?

3.2泌尿清丸對大鼠前列腺組織的影響 各組大鼠前列腺組織HE 染色顯示：空白組大鼠的前列腺組織未有異常變化；模型組大鼠前列腺腔內(nèi)有分泌物，腺腔擴(kuò)張增大，血管擴(kuò)張充血，少見血管破裂，腺泡上皮細(xì)胞乳頭狀明顯增生，間質(zhì)明顯纖維化且有大量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤；泌尿清丸低、中、高劑量組前列腺間質(zhì)疏松水腫，血管周圍有淋巴細(xì)胞浸潤，導(dǎo)管擴(kuò)張充血，間質(zhì)內(nèi)大量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤，腺泡上皮細(xì)胞乳頭狀增生明顯，但與模型組比較間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞明顯減少，間質(zhì)內(nèi)可見散在的淋巴細(xì)胞，前列腺組織結(jié)構(gòu)清楚，部分腺腔內(nèi)有分泌物，腺體排列及分布基本正常，間質(zhì)有極少量炎癥細(xì)胞散在分布，炎癥現(xiàn)象較模型組明顯減輕；陽性對照組見腺腔增大，排列整齊，腔內(nèi)有少量分泌物，腺上皮細(xì)胞輕度增生，間質(zhì)有極少量炎癥細(xì)胞散在分布。見圖1。

圖1 各組大鼠前列腺組織變化（HE×100）

3.3泌尿清丸對大鼠前列腺白細(xì)胞和卵磷脂小體的影響 見表2。與空白組比較，模型組前列腺組織液中的白細(xì)胞數(shù)目明顯升高，卵磷脂小體密度明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和泌尿清丸低、中、高劑量組前列腺組織液中的白細(xì)胞數(shù)目均明顯減少，卵磷脂小體密度均明顯升高（P＜0.05）。

表2 泌尿清丸對大鼠前列腺白細(xì)胞和卵磷脂小體的影響 （±s）

表2 泌尿清丸對大鼠前列腺白細(xì)胞和卵磷脂小體的影響 （±s）

注：與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

?

3.4泌尿清丸對大鼠前列腺組織中炎癥因子和抗炎因子的影響 見表3。與空白組比較，模型組前列腺組織中各炎癥因子和抗炎因子水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和泌尿清丸低、中、高劑量組均可明顯降低前列腺組織中IL-8、TNF-α、IL-1β水平，明顯升高IL-4、IL-6、IL-10水平（P＜0.05）。

表3 泌尿清丸對大鼠前列腺組織中炎癥因子和抗炎因子的影響 （OD，±s）

表3 泌尿清丸對大鼠前列腺組織中炎癥因子和抗炎因子的影響 （OD，±s）

注：與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

?

4 討 論

慢性非細(xì)菌性前列腺炎，屬于中醫(yī)學(xué)“淋證”“精濁”“白淫”“白濁”等范疇。古代醫(yī)家對本病病機(jī)有較為深入的認(rèn)識，如《諸病源候論》記載：“酒性有毒，而復(fù)大熱，飲之過多，故毒熱氣滲溢經(jīng)絡(luò)，浸溢腑臟，而生諸病也?！薄端貑枴ゐ糇C》記載：“思想無窮，所愿不得，意淫于外，入房太甚，宗筋弛縱，發(fā)為筋痿，乃為白淫。”《證治準(zhǔn)繩·淋濁·遺精門》記載：“有人吸金石藥者，入房太甚，敗精流入胞中……則皆成淋?！惫湃苏J(rèn)為其病因與飲酒貪色、吸食毒藥等相關(guān)?！夺t(yī)學(xué)心悟·赤白濁》記載“濁之，有二種：一由腎虛敗精流注，二由濕熱滲入膀胱……”《壽世保元》記載：“精之主宰在心，精之藏制在腎，凡人酒色無度，思慮過情，心腎氣虛，不能管攝，往往小便頻數(shù)，便濁之所有生也。”指出其主要病機(jī)為腎虛，濕熱流注下焦。

目前中醫(yī)對慢性前列腺炎的治療主要以辨證論治為主。如周安方采用“多法聯(lián)治”分為三期辨證治療：初期以濕熱為主，肝郁為次，治法以清熱利濕、疏肝理氣為主；中期以血瘀氣滯為主，濕熱、肝郁、腎虛為次，治法以活血祛瘀、行氣止痛為主，兼清熱利濕、疏肝補(bǔ)腎；后期以腎虛為主，瘀血、濕熱、肝郁次之，治法以補(bǔ)腎為主，兼活血化瘀、清熱利濕、疏肝解郁［6］。

泌尿清丸為荊州市中醫(yī)醫(yī)院泌尿科院內(nèi)協(xié)定處方制劑，具有清熱利濕、活血通淋、行氣止痛兼補(bǔ)腎氣之功效。該方由桂枝、茯苓、澤蘭、赤芍、桃仁、紅花、金錢草、黃柏、石葦、豬殃殃、蒲公英、萆薢、菟絲子、三棱、莪術(shù)、王不留行、山茱萸、山藥、川芎、白芍共二十味藥物組成。方中金錢草、石葦清熱祛濕，利尿通淋，共為君藥。豬殃殃、蒲公英清熱解毒利濕；茯苓健脾祛濕；萆薢除陽明之濕而固下焦，祛濁分清，利濕通淋；黃柏苦寒，清熱燥濕，利尿通淋，主瀉下焦隱伏之火，具有清下焦?jié)駸?、通淋之效；此五藥共為臣藥。金錢草、石葦、豬殃殃、蒲公英、茯苓、萆薢、黃柏，君臣共入下焦以清熱利尿通淋。澤蘭、桃仁、赤芍、紅花同入肝經(jīng)，均具有活血化瘀之功效，其中澤蘭、紅花祛瘀，桃仁化瘀，赤芍既可活血散瘀，又可清熱，以散瘀久所化之熱；四藥合用共奏通經(jīng)化瘀之功，寒熱并用，無耗傷陰血之弊；桂枝辛甘而溫，溫通經(jīng)脈，以行瘀滯；川芎辛溫走竄，既能活血又能行氣，稱為血中之氣藥，具有通達(dá)氣血之功；王不留行苦平，通利血脈，行而不駐，走而不守，既活血通經(jīng)，又利水通淋，氣行則血行，以行氣化瘀而止痛；配合白芍緩急止痛。三棱苦平、莪術(shù)辛苦溫，善破老血，通經(jīng)利氣，具有破血祛瘀、行氣止痛之效，化瘀之力甚速而不傷正氣。菟絲子、山藥、山茱萸均入腎經(jīng)，為補(bǔ)腎固腎之要藥，菟絲子性溫不燥，補(bǔ)而不滯，補(bǔ)陽益陰而固腎；山藥滋養(yǎng)而不膩，養(yǎng)陰而固腎；山茱萸性溫不燥，補(bǔ)而不峻，平補(bǔ)陰陽而固腎，三藥合用，平補(bǔ)固腎，與清熱祛濕、活血化瘀藥相配，達(dá)到標(biāo)本兼治、攻補(bǔ)兼施之效，共為佐藥。全方配伍寒溫并用，氣血同調(diào)，攻補(bǔ)兼施，有祛邪不傷正、補(bǔ)益不留寇之特點(diǎn)。

本次研究表明，與模型組比較，泌尿清丸低、中、高劑量組前列腺濕重和指數(shù)均明顯減少，同時可減少前列腺組織中的白細(xì)胞數(shù)目，增加卵磷脂小體密度，對大鼠前列腺炎組織炎性病變有明顯改善。

研究表明，炎癥因子和抗炎因子在慢性前列腺炎發(fā)病中起著重要作用。在組織的炎癥反應(yīng)過程中，炎癥因子可促進(jìn)炎癥反應(yīng)；抗炎因子可抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)和再生［7］。炎癥在感染、損傷、毒素、免疫源等始動因素的作用下產(chǎn)生炎癥因子，通過增加趨化因子和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，引起局部或全身炎癥反應(yīng)。抗炎因子可通過抑制炎癥因子的活性，從而抑制炎癥發(fā)展。因此，炎癥因子與抗炎因子間的平衡將影響慢性非細(xì)菌性前列腺炎的發(fā)展過程及轉(zhuǎn)歸。

炎癥因子IL-8、TNF-α、IL-1β 具有促進(jìn)慢性前列腺炎的作用。IL-8 作為一種強(qiáng)效的炎癥因子，主要由內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞及多種上皮細(xì)胞產(chǎn)生，具有誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞向炎癥部位聚集及調(diào)節(jié)白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，誘導(dǎo)白細(xì)胞趨向活性，促使局部組織發(fā)生炎癥和損傷。對嗜堿性粒細(xì)胞和活化的T淋巴細(xì)胞亦有趨向活性，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。Hochreiter 等［8］研究表明，慢性前列腺炎、無癥狀型前列腺炎患者前列腺液中IL-8水平明顯升高。Schaeffer等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在慢性前列腺炎患者前列腺液、精漿中，IL-8 水平升高，且具有診斷和評價治療效果的意義。TNF-α 由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，作用于內(nèi)皮細(xì)胞，可增加黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞黏附、游走、浸潤，巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。IL-1β 可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)增多，促使前列腺內(nèi)皮細(xì)胞上的白細(xì)胞黏附增多，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。Alexander 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在慢性非細(xì)菌性前列腺炎患者的精漿中，TNF-α、IL-1β水平明顯升高且呈正相關(guān)，具有臨床診斷慢性前列腺炎意義。Nadler等［11］研究表明，在慢性非細(xì)菌性前列腺炎患者前列腺液中TNF-α、IL-1β水平明顯升高。本研究表明，泌尿清丸低、中、高劑量組均能降低血清中IL-8、TNF-α 及IL-1β的水平。

抗炎因子IL-4、IL-6、IL-10 具有抑制慢性前列腺炎的作用。IL-4 由活化的T 細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)T、B 淋巴細(xì)胞的發(fā)育，驅(qū)動體液免疫反應(yīng)。李樹平等［12］認(rèn)為測定血清中IL-4含量有助于CNP的分型診斷。同時，IL-6 可促進(jìn)B 細(xì)胞分化產(chǎn)生抗體，促進(jìn)T 細(xì)胞增殖和IL-2 的產(chǎn)生，是在炎癥反應(yīng)中具有重要作用的細(xì)胞因子。IL-6 還可抑制IL-1 和TNF-α 等炎癥因子的合成，促進(jìn)糖皮質(zhì)激素和可溶性TNF 受體釋放，抑制GS-CSF、INF-γ 等炎癥因子的產(chǎn)生。Stancik 等［13］研究表明，慢性前列腺炎患者精液中IL-6 升高，藥物干預(yù)后，IL-6 水平降低，是療效評價的重要指標(biāo)。IL-10由T細(xì)胞、活化的B細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞等產(chǎn)生，是已發(fā)現(xiàn)的重要的抗炎癥因子。Miller 等［14］研究IL-2、IL-10、TNF-α 和IFN-γ 間的相互關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在慢性前列腺炎患者的精漿中，IL-10、TNF-α和IL-2水平明顯高于健康對照組，并且前細(xì)胞因子IL-8水平與抗炎細(xì)胞因子IL-8 水平呈負(fù)相關(guān)；研究還發(fā)現(xiàn)患者IL-10 水平越高，患者疼痛癥狀越嚴(yán)重。研究提示，IL-10 水平是評價慢性前列腺炎療效的一個有效指標(biāo)。王洪展等［15］用苯甲酸雌二醇成功誘導(dǎo)SD 大鼠慢性非細(xì)菌性前列腺炎動物模型，并檢測了IL-10、TNF-α 和IFN-γ水平，發(fā)現(xiàn)慢性非細(xì)菌性前列腺炎組明顯高于對照組，認(rèn)為這些炎性因子參與了前列腺炎的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，自身免疫異?？赡苁锹苑羌?xì)菌性前列腺炎發(fā)病機(jī)制之一。本研究表明，泌尿清丸可升高慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠組織中IL-4、IL-6、IL-10 的水平。

綜上所述，泌尿清丸可改善慢性非細(xì)菌性前列腺炎，其作用機(jī)制可能是通過降低炎癥因子水平、升高抗炎因子水平而發(fā)揮抗炎作用。