化學(xué)分散劑對(duì)深圳大鵬灣海水石油降解及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

顏辰瑤，彭 超，吳一超，李 順，劉 丹，錢永明，路 璐

（西華師范大學(xué)1.生命科學(xué)學(xué)院/2.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637009；3.中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所，福建 廈門 361021）

化學(xué)分散劑可以降低石油在海面上的累積及遷移速度，減少大片油污遷移至海岸帶的機(jī)率[1]。其中，美國環(huán)境保護(hù)署核準(zhǔn)的化學(xué)分散劑Corexit是目前國際上應(yīng)對(duì)海洋石油污染常用的分散劑之一。然而，化學(xué)分散劑作為一種有機(jī)混合液，對(duì)海洋環(huán)境也存在潛在危害。已有研究表明，Corexit 對(duì)浮游植物[2]、海洋動(dòng)物[3]及微生物[4]可產(chǎn)生毒性。微生物降解石油則是更為清潔高效的溢油清除途徑，也被認(rèn)為是徹底消除海洋溢油的唯一途徑[5]。在墨西哥灣溢油事件中，超過50%的溢油是通過微生物降解途徑移除[6]。然而在海洋原位環(huán)境中，石油組分疏水性強(qiáng)、生物利用性低等特點(diǎn)成為限制微生物降解污染溢油效率的主要因素[7]。加入化學(xué)分散劑大大提高了石油在海水中的溶解度和生物可利用性，大量前期研究也證實(shí)投加分散劑可顯著促進(jìn)石油的微生物降解過程[8-11]。但是，很多研究也發(fā)現(xiàn)化學(xué)分散劑對(duì)石油微生物降解存在抑制作用[12,13]。因此，化學(xué)分散劑對(duì)石油降解微生物的影響效應(yīng)在國際學(xué)術(shù)界一直頗具爭(zhēng)議[14]。在我國，投加化學(xué)分散劑對(duì)石油降解微生物及其降解過程的效應(yīng)研究尚處于起步階段?；瘜W(xué)分散劑如何影響海洋微生物的群落組成及主導(dǎo)石油降解菌群仍知之甚少[15]。

大鵬灣位于深圳市東南部，港口集裝箱運(yùn)輸產(chǎn)業(yè)和航運(yùn)業(yè)發(fā)達(dá)，是溢油事件發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域。本研究以深圳大鵬灣為例，旨在揭示Corexit對(duì)海水中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、石油降解菌相對(duì)豐度及石油降解速率的影響，為評(píng)估分散劑的施用效果及其對(duì)環(huán)境微生物生態(tài)的影響提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本研究的海水樣品采自于深圳市東南部大鵬灣（22°33′20″N，114°21′41″E）。樣品使用卡蓋式采水器采集深度0～2 m 的表層海水60 L，置于冷藏箱中，溫度保持在4～6 ℃，24 h 內(nèi)開展室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。海水的pH 為7.90±0.02，溶解有機(jī)碳為（6.40±0.05）mg/L，溶解氧為9.11 μmol/L，鹽度為32±1。

1.2 主要儀器與試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV10，IKA，德國），氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀GC-MS（7890A-240MS，Agilent,美國），烷烴標(biāo)準(zhǔn)品（C7-C40）和16種多環(huán)芳烴（PAHs，Polycyclic Aromatic Hydrocarbons）標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma-Aldrich公司，系列濃度用色譜純正己烷配置。原油產(chǎn)自渤海灣的綏中原油，密度為0.962 g/mL。

1.3 室內(nèi)模擬海水石油污染實(shí)驗(yàn)的設(shè)置

1.3.1 污染物儲(chǔ)備液的制備 實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1 個(gè)對(duì)照組，分別為石油可溶性組分（Water accommodated fraction，WAF）、石油和化學(xué)分散劑Corexit 混合物可溶性組分（Chemically enhanced water-accommodated fraction，CEWAF）、化學(xué)分散劑（Dispersant-only）及生物對(duì)照組（Biotic）。WAF、CEWAF 和Dispersant-only 的制備參考Kleindienst等[12]方法。步驟：1）用0.22 μm的濾膜過濾新鮮海水，將濾液置于65 ℃水浴鍋中進(jìn)行巴氏滅菌2～3 h，重復(fù)3次，獲得滅菌海水。2）WAF：將850 mL滅菌海水置于1 L 玻璃瓶中，再加入150 mL 石油。CEWAF：向850 mL 滅菌海水中先加入150 mL 石油，再加入15 mL 的Corexit。Dispersant-only：取850 mL 滅菌海水，向其加入15 mL 的Corexit。3 個(gè)處理組以恒定轉(zhuǎn)速（500 r/min）避光磁力攪拌48 h后，置于分液漏斗中靜置，直至油水兩相分離。將下層液相收集至玻璃瓶中，即分別獲得WAF、CEWAF和Dispersant-only的儲(chǔ)備液。

1.3.2 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)置 將新鮮海水分裝于1 L 無菌玻璃瓶中，每瓶750 mL；向玻璃瓶中分別加入WAF、CEWAF 和Dispersant-only 儲(chǔ)備液，每個(gè)處理組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。Ziervogel 等[16]研究表明，當(dāng)石油污染發(fā)生時(shí)，表層水體中的可溶有機(jī)碳（Dissolved Organic Carbon，DOC）在前21 d平均增加2倍，即約增加200～300 μmol/L。因此，為模擬海洋表層海水的石油污染，在各實(shí)驗(yàn)組中分別加入相當(dāng)于300 μmol/L DOC 的石油/分散劑污染物，Biotic 處理組為相應(yīng)體積的滅菌海水。樣品瓶在25 ℃，轉(zhuǎn)速50 r/min 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中定時(shí)每隔3 d 開瓶通氣，保證培養(yǎng)瓶中有氧環(huán)境。分別在0、3、7和21 d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣。每個(gè)樣品瓶中250 mL 海水用于測(cè)定石油烴組分總烷烴和總多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs）；400 mL 海水過濾于0.22 μm 微孔濾膜（Millipore,USA）上，用于總微生物DNA提取。

1.4 烷烴和PAHs的萃取和分析

對(duì)于待測(cè)石油組分的樣品，向250 mL海水中加入15 mL二氯甲烷液液萃取，震蕩10 min，靜止10 min，收集有機(jī)相，并重復(fù)3 次；向萃取液中加入1 g 無水硫酸鈉去除水分，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至2 mL，濃縮液經(jīng)硅鎂吸附柱純化后，濃縮并定容至1 mL待測(cè)。

石油烷烴和PAHs 組分采用外標(biāo)法在GC-MS上定量測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)品烷烴（C7-C40）和PAHs（16種）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，用色譜純正己烷配置梯度濃度為1、5、10、20、30、40、50、100 μg/mL，各化合物的相關(guān)性均在0.998 以上。載氣（He）流速1 mL/min；不分流進(jìn)樣。色譜柱為DB-5 石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃?？偼闊N測(cè)定升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?5 ℃，以10 ℃/min溫度升溫至250 ℃保持2 min，以20 ℃/min 升至320 ℃，保持23 min。PAHs測(cè)定升溫程序?yàn)椋?0 ℃保持2 min，以80 ℃/min溫度升至180 ℃保持5 min，以4 ℃/min 升到290 ℃保持5 min。石油組分判定根據(jù)不同碳數(shù)烷烴和不同PAHs 的保留時(shí)間進(jìn)行檢索，并同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)物比對(duì)進(jìn)行定性。

1.5 總烷烴和總PAHs降解率的計(jì)算

不同處理組中的總烷烴和總PAHs 隨時(shí)間的降解率計(jì)算公式：

Y：不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)上海洋樣品中總烷烴和總PAHs的降解率（%）；ρt：培養(yǎng)td 后樣品中總烷烴和總PAHs 的質(zhì)量濃度（μg/L）；ρ0：0 h 時(shí)樣品中總烷烴和總PAHs的質(zhì)量濃度（μg/L）。

1.6 海水樣品微生物群落的分析

1.6.1 微生物總DNA 提取 將濾膜在無菌環(huán)境下剪切為碎片，采用FastDNA? Spin Kit for Soil (MP Biomedicals company)試劑盒提取海水總DNA。DNA 濃度和質(zhì)量在NanoDrop 分光光度計(jì)（Nano‐drop Technologies Inc.,德國）上測(cè)定和評(píng)估，OD260/OD280在1.8～2.0 之間，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量，主條帶明亮，無彌散現(xiàn)象，提取的DNA保存于-20 ℃以備后續(xù)分析。

1.6.2 Ilumina Miseq 測(cè)序分析及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 高通量測(cè)序分析采用barcode 序列等修飾后的細(xì)菌通用引物515F和907R，擴(kuò)增微生物V4-V5區(qū)的16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增[17]，50 μL PCR體系包括：25 μL 2XPCRMaster Mix，前、后引物各5 μL，2 μL DNA 模板，剩余用無菌水補(bǔ)齊。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，37 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，純化后的PCR 產(chǎn)物等摩爾數(shù)混合，在Illumina Miseq平臺(tái)測(cè)序。序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，序列號(hào)為PRJNA810723。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)擴(kuò)增使用在寶生物工程（大連）有限公司的SYBR? Premix EX TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒，在CFX96 Optical Real-Time PCR System (Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)熒光定量?jī)x上進(jìn)行分析。qPCR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線采用向載體質(zhì)粒中導(dǎo)入含有細(xì)菌16S rRNA 基因的克隆子制備，將含有目標(biāo)基因的克隆子在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，使用MiniBEST Plasmid Purification Kit（Takara）試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取和純化，使用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)測(cè)定DNA 的濃度結(jié)合其分子質(zhì)量計(jì)算標(biāo)線的原始拷貝數(shù)。對(duì)質(zhì)粒標(biāo)線按10 倍梯度稀釋，得到7 個(gè)數(shù)量級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。定量PCR 的反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL SYBR?Premix EX TaqTM（Tli RNaseH Plus），1 μL DNA模板，正向、反向引物分別為0.1 μl(10 μmol·L-1)和7.8 μL的滅菌雙蒸水。陰性對(duì)照采用滅菌雙蒸水代替樣品DNA。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)分析采用Excel 2010 和SPSS 27.0 進(jìn)行處理分析，處理之間的平均值差異采用one-way ANOVA 單因素方差分析，顯著性水平α=0.05 表示差異，Origin 2018 作微生物群落結(jié)構(gòu)組成圖，cytoscape作網(wǎng)絡(luò)分析圖。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)分散劑Corexit對(duì)海水中烷烴和PAHs降解率的影響

圖1 可知，添加Corexit 對(duì)總烷烴和總PAHs 降解的影響有所差異。對(duì)總烷烴的降解分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)3 d，添加Corexit 沒有顯著提高總烷烴的降解率（P>0.05）；培養(yǎng)7 d 時(shí)，WAF 處理組中總烷烴的降解率顯著高于CEWAF處理組（P<0.05）。培養(yǎng)21 d時(shí)，CEWAF 處理組的總烷烴降解率顯著高于WAF處理組（P<0.05），CEWAF 處理組的烷烴降解率（57.3%±0.06%）比WAF 處理組（42.8%±0.04%）高1.34 倍，添加Corexit顯示出促進(jìn)作用。對(duì)PAHs降解的數(shù)據(jù)分析表明，在培養(yǎng)的前7 d，WAF和CEWAF處理組的PAHs降解率無顯著差異（P>0.05）；培養(yǎng)21 d時(shí)，CEWAF 處理組中總PAHs 的降解率（48.5%±0.02%）才顯著高于WAF 處理組（39.8%±0.02%）（P<0.05），是WAF處理組降解率的1.22倍，表明添加Corexit在培養(yǎng)后期促進(jìn)了總PAHs的降解。

圖1 WAF和CEWAF處理組中降解率隨時(shí)間的變化Fig.1 Degradation rates of in WAF and CEWAF treatments across the incubation time

2.2 細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)分析

從圖2 看出，與Biotic 比較，在WAF 處理組中，從3 d 至21 d，其微生物拷貝數(shù)都顯著高于對(duì)照組，且在7 d 時(shí)豐度最高。CEWAF 處理組在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，微生物豐度均顯著高于WAF 處理組（P<0.05）。在僅添加分散劑的處理組中微生物豐度與0 h時(shí)相比也顯著增加。

圖2 細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)Fig.2 Copy numbers of bacterial 16S rRNA genes

2.3 化學(xué)分散劑Corexit 對(duì)海水中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

16S rRNA 基因Miseq 高通量測(cè)序結(jié)果揭示不同處理組中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化（圖3）。與Biotic處理組相比，WAF、CEWAF、Dispersant-Only 三個(gè)處理組中，主導(dǎo)細(xì)菌菌群發(fā)生了改變，不同實(shí)驗(yàn)組中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)顯著差異（P<0.01），且不同培養(yǎng)時(shí)間菌群結(jié)構(gòu)有所差異。添加WAF 促進(jìn)了海水原位石油降解菌的增加，培養(yǎng)3 d 時(shí)，Neptuniibacter、Aestuariibacter、Lutimaribacter、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Aquibacter（水桿菌屬）和Planctomyces的相對(duì)豐度相比于WAF 處理組的0 h 時(shí)增加388、34.3、11.0、7.6、5.7 和4.7 倍。其中，Lutimaribacter增加的相對(duì)豐度最高，增加了10.47%。培養(yǎng)7 d 時(shí)，WAF 處理組中主導(dǎo)菌群為L(zhǎng)utimaribacter（31.3%）、Acinetobacter（24.3%），占總菌群群落的55.6%。而培養(yǎng)21 d 時(shí)，主導(dǎo)菌群變?yōu)镻lanctomyces（35.4%），此外，相比于0 h，Haliea和Winogradskyella也有顯著增加，分別增加了28.2和21.6倍。

圖3 不同處理組中屬水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨培養(yǎng)時(shí)間的變化情況Fig.3 Changes in the bacterial community structure at the genus level across the incubation time in different treatments

添加分散劑的CEWAF 處理組的主導(dǎo)菌群組成與WAF 處理組不同，表明添加分散劑Corexit 改變了石油降解菌群。CEWAF 處理組3 d 時(shí)，Neptunii‐bacter（36.3%）和Alteromonas（10.6%）為主導(dǎo)菌群，相對(duì)豐度相比于0 h 增加了36 636 和13.4 倍。其中，Neptuniibacter的相對(duì)豐度比WAF 處理組3 d 時(shí)高91.2 倍。而在培養(yǎng)7 和21 d 后，主導(dǎo)菌群均為Planctomyces，相對(duì)豐度分別達(dá)到40.1%和26.0%，相比于0 h 增加了294.3 和190.3 倍。其中，7 d 時(shí)，Planctomyces在CEWAF 處理組中相對(duì)豐度比WAF處理中高出37.4%，是WAF 處理中的13.5 倍。CEWAF 處理中Haliea和Pseudomona增加的相對(duì)豐度也高于WAF處理組。在僅添加Corexit的dispersantonly 處理組中，培養(yǎng)3 d，主導(dǎo)菌群為Alteromonas（41.9%）、Neptuniibacter（16.8%），Aestuariibacter（14.6%），其中Alteromonas和Aestuariibacter的豐度比CEWAF處理組3 d時(shí)高3.0和7.5倍。在dispersantonly處理組培養(yǎng)7和21 d 時(shí)，Lutimaribacter、Oleiphilus、Haliea、Pseudomonas等菌都有顯著富集。21 d 時(shí)，Dispersant-only 處理組中主導(dǎo)菌群為L(zhǎng)utimaribacter（21.5%）、Polycyclovorans（16.8%）和Pseudomonas（9.4%），其中Polycyclovorans相比于0 h增加16 848 倍，且比WAF 處理組21 d 時(shí)Polycyclov‐orans的相對(duì)豐度高28.2倍。

2.4 海水菌群相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)分析

基于不同處理組以及不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)菌群落OTU 組成，分析所有樣品中OTU 相對(duì)豐度變化的相關(guān)性，將顯著相關(guān)(P<0.01)的OTU呈現(xiàn)于網(wǎng)絡(luò)圖中（圖4）。此網(wǎng)絡(luò)顯示有強(qiáng)相關(guān)性的OTU 有273個(gè)，它們之間存在586 種聯(lián)系。網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系中負(fù)相關(guān)的連線占比為53.1%，正相關(guān)比例為46.9%。通過對(duì)不同微生物類群節(jié)點(diǎn)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)此網(wǎng)絡(luò)中α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）的節(jié)點(diǎn)數(shù)最多，占總節(jié)點(diǎn)數(shù)的24.1%和23.9%，其次是黃桿菌綱（Flavobacteriia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）和浮霉菌綱（Planctomycetota），比例分別為9.3%、6.6%和4.4%；網(wǎng)絡(luò)中連通度相對(duì)較高的關(guān)鍵OTU 有13 個(gè)（表1）。其中有石油降解菌Thalassotalea、Planctomyces、Oleibacter 等。Planctomyces 在不同處理組中都隨時(shí)間顯著富集，為海洋中常見石油降解菌[18]。

表1 基于OTU的細(xì)菌群落網(wǎng)絡(luò)分析中的關(guān)鍵OTUsTable 1 The key OTUs of the bacterial network based on the microbial OTU composition

圖4 基于不同處理組中的細(xì)菌群落OTU組成的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Network analysis depicting the co-occurrence pattern among the OTU compositions of bacterial communities for different treatments

3 討論

3.1 分散劑Corexit對(duì)石油不同組分的降解率影響

加入分散劑的CEWAF 處理組中，Corexit 顯著提高了石油組分的降解率，這一結(jié)果與在墨西哥灣[8]、挪威海峽[19]及北冰洋[20]等海域的研究結(jié)果一致。然而，在該培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前7 d，Corexit 對(duì)總烷烴和總PAHs 的降解并未有促進(jìn)作用，甚至3 d 時(shí)對(duì)總烷烴的降解呈抑制作用，該現(xiàn)象在對(duì)美國基普拉德霍灣的海水研究中也有發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oght等[21]在對(duì)美國基普拉德霍灣的海水研究發(fā)現(xiàn)Corexit 成分中的磺基琥珀酸鈉二辛酯能抑制烷烴的微生物降解。純菌水平也發(fā)現(xiàn)Corexit 中的表面活性劑成分（如Span 20、Tween 80 和Tween85 等）能顯著抑制Acinetobacter calcoaceticus和Rhodococcussp.str.094 降解烷烴的能力[22]。此外，在該實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)初期，Corexit 未促進(jìn)石油組分降解還可能是由于Corexit 本身優(yōu)先于石油被微生物所降解，間接對(duì)石油降解過程產(chǎn)生影響。Lindstrom 等[23]研究發(fā)現(xiàn)海洋微生物群落降解Corexit 的速率顯著高于降解原油的速率，同時(shí)Corexit 的加入可能促使海洋微生物選擇性地降解特定碳?xì)浠衔铩Ｒ灿醒芯堪l(fā)現(xiàn)很多有機(jī)物降解微生物能同時(shí)降解石油和分散劑[24-25]，最終也促進(jìn)石油組分降解。此外，在WAF 處理組培養(yǎng)初期，總烷烴的降解率高于總PAHs 的降解率，這與海水中石油降解微生物有選擇性地降解不同碳?xì)浠衔镉嘘P(guān)。石油降解微生物菌群會(huì)偏好性地優(yōu)先降解直鏈烷烴及低分子質(zhì)量碳?xì)浠衔铮–2-C5），隨后對(duì)PAHs 及高分子質(zhì)量碳?xì)浠衔铮–5-C20）等進(jìn)行降解[26]。綜上，在深圳大鵬灣海水中，投加Corexit 能促進(jìn)石油組分的降解，且在不同時(shí)間尺度上對(duì)石油不同組分的降解率影響也有差異。

3.2 深圳大鵬灣海水中的石油降解菌群落結(jié)構(gòu)

石油進(jìn)入海洋，海洋環(huán)境中的石油降解微生物能迅速通過提高代謝速率和繁殖速度來分解石油組分[27]。石油組分的添加顯著促進(jìn)海水中石油降解菌增加，主導(dǎo)的石油降解菌隨著培養(yǎng)時(shí)間變化顯著。在WAF處理組中，培養(yǎng)3 d時(shí)，多種石油降解菌相對(duì)豐度增加3.39～388 倍，其中，Neptuniibater[28]、Pseudomonas[29]、Aquibacter[30]等都為海水中常見的石油烴降解菌。7d時(shí)的主導(dǎo)石油降解菌為L(zhǎng)u‐timaribacter和Acinetobacter，在波斯灣溢油污染后，發(fā)現(xiàn)Lutimaribacter顯著增加，為海水中天然石油降解菌[31]。Acinetobacter的不同菌屬能高效降解烷烴和多環(huán)芳烴[32-33]，在渤海灣的石油污染水域也有大量富集[34]。Lutimaribacter和Acinetobacter在培養(yǎng)中期顯著富集，也與該時(shí)刻總烷烴和總PAHs 的高降解率相耦合。WAF 處理組培養(yǎng)后期，Planctomy‐ces成為主導(dǎo)石油降解菌，該菌在深海石油泄漏區(qū)域的海水也被發(fā)現(xiàn)有顯著富集[35]。同時(shí)，該菌在海洋溢油的PAHs降解中有很多報(bào)道，在墨西哥灣及Exxon Valdez 溢油海域，均發(fā)現(xiàn)其參與PAHs 的降解[36]，說明該菌為降解海水中持久性的石油組分有貢獻(xiàn)。

此外，綜合分析石油烴降解率和細(xì)菌群落變化的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，雖然石油烴的降解主要發(fā)生在前7 d，但培養(yǎng)21 d時(shí)，海水中的主導(dǎo)石油降解菌卻與前7 d的菌群有差異顯著。該現(xiàn)象可能與隨著培養(yǎng)時(shí)間推進(jìn)，海水中營養(yǎng)成分（如氮和磷）被迅速消耗，造成微生物豐度減少和石油降解效率降低有關(guān)[12]；其次，培養(yǎng)后期選擇出的石油降解菌，如Planctomyces，可能參與了降解高分子量的石油烴或降解醇類等石油降解中間產(chǎn)物[37]。

3.3 投加分散劑Corexit 改變海水原位石油降解菌群落結(jié)構(gòu)

分散劑作為外源有機(jī)物，對(duì)海水中微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生影響[15]。本研究CEWAF 處理組中，石油降解菌菌群變化與WAF 處理組有顯著差異，Kleindienst 等[12]、Stephen 等[8]對(duì)墨西哥灣海水中微生物對(duì)Corexit 的響應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，Corexit 促進(jìn)了能同時(shí)降解分散劑和石油的碳?xì)浠衔锝到饩鶦olwellia的生長(zhǎng)，而抑制原位天然石油降解菌Marinobacter的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響石油烴的降解規(guī)律。值得注意的是，WAF 和CEWAF 處理組中的微生物群落結(jié)構(gòu)雖然有顯著差異，但是在培養(yǎng)21 d 時(shí)，CEWAF處理組中石油烴降解率才顯著高于WAF處理組。該結(jié)果可能由于CEWAF 組增溶的石油烴組分促進(jìn)了微生物的生長(zhǎng)（圖1），也促進(jìn)了多樣性更高和降解效率各異的石油降解菌群，進(jìn)而提高CEWAF 處理組中降解率[27]。其次，CEWAF 處理組中的一些石油降解菌也可能同時(shí)參與分散劑降解，進(jìn)而影響培養(yǎng)初期石油烴的降解效率[12]。

在添加Corexit 后，主導(dǎo)的石油降解菌由WAF中的Lutimaribacter、Acinetobacter，Planctomyces變?yōu)镹eptuniibacter、Planctomyces、Alteromonas。培養(yǎng)的第3 d，CEWAF相比于WAF處理組Neptuniibacter顯著富集，抑制了Lutimaribacter的生長(zhǎng)。Doyle等[38]在美國加爾維斯頓港附近海水中也發(fā)現(xiàn)在同時(shí)加入石油和Corexit 的處理組中，Neptuniibacter在海水微生物群落中的相對(duì)豐度顯著升高。在Dispersant-only 處理組中，Neptuniibacter也有富集，表明該菌可能同時(shí)參與了石油和分散劑的降解。在培養(yǎng)7 d 和21 d 后，CEWAF 的主導(dǎo)菌均為Planctomyces，在僅加入分散劑的Dispersant-only 處理組中Planctomyces相比于0 h 也富集了294.3 和190.3 倍。Planctomyces作為海洋中常見的石油降解菌[18]，在Couto 等[39]對(duì)巴西格米亞海灘附近海水的研究中發(fā)現(xiàn)，石油污染時(shí)，加入分散劑促進(jìn)了Planctomyces生長(zhǎng)，表明Planctomyces可能同時(shí)參與石油和分散劑降解。該菌在網(wǎng)絡(luò)分析中為關(guān)鍵菌屬，與菌群中多種微生物互作關(guān)系緊密，在不同處理組中，可能均參與多種有機(jī)物降解。此外，CEWAF 處理組中，加入Corexit 促進(jìn)了Haliea和Pseudomonas等石油降解微生物的富集，這些菌在海洋石油的微生物降解過程中都起重要作用[40]。

相比于WAF 處理組，CEWAF 處理組中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的顯著變化可能有如下幾個(gè)原因：1）某些石油降解菌因?yàn)槠渥陨碛H水親油性，易吸附在油/水界面上，Corexit 的加入乳化浮油形成油滴溶于水，為這些菌提供更多吸附界面，定向促進(jìn)一些石油降解菌生長(zhǎng)。如海洋中隸屬于Alteromonaldaceae的菌群更易聚集于各種界面環(huán)境（海水表面、可溶性顆粒物等）[41]。2）CEWAF 處理組中，由于加入分散劑，促進(jìn)石油中不可溶組分的水溶性，雖然本實(shí)驗(yàn)中WAF 和CEWAF 處理組中加入同等量的DOC，但其中的石油組分組成不同[12]。溢油污染發(fā)生后，海水中石油降解菌的菌群結(jié)構(gòu)的變化很大程度上取決于石油組分的組成[28]。3）分散劑可能對(duì)某些微生物有較強(qiáng)毒性，或可作為一些微生物的底物進(jìn)行降解行為，進(jìn)而導(dǎo)致微生物豐度增加和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化。如Campo 等[42]研究發(fā)現(xiàn)從海水中分離的兩株石油降解菌可高效降解Corexit。在Dispersant-only 處理組中，石油降解菌Alteromonas、Neptuniibacter、Pseudomonas等均顯著富集，表明這些菌可能參與Corexit 的降解。

4 結(jié)論

化學(xué)分散劑對(duì)海洋溢油降解過程和海洋細(xì)菌群落的影響隨分散劑類型、石油種類及環(huán)境條件的不同而有所差異。因此，研究不同海域分散劑對(duì)石油降解及微生物的影響能為分散劑的選擇和使用提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)：1）加入Corexit促進(jìn)海水中微生物的生長(zhǎng)，培養(yǎng)21 d 時(shí)促進(jìn)了石油降解效率；2）加入石油和Corexit 改變了海水原位的石油降解微生物菌群，由主導(dǎo)的石油降解Lutimaribacter、Acinetobacter和Planctomyces轉(zhuǎn)變?yōu)镹eptuniibacter、Planctomyces和Alteromonas；（3）在僅加入Corexit的處理中，Alteromonas和Lutimaribacter的富集表明了其可能同時(shí)具有降解石油和分散劑的能力?；诒狙芯?，未來可針對(duì)不同海域進(jìn)一步開展化學(xué)分散劑對(duì)海洋微生物石油降解效率和代謝機(jī)制的研究，為海洋溢油事故中化學(xué)分散劑的使用提供指導(dǎo)依據(jù)。