一株微藻附生菌的分離鑒定及藻菌體系的氮吸收特性

陳永志，黃翔鵠，朱春華，莫 峰，溫其交，張玉蕾

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088;2.廉江市養(yǎng)蝦集團(tuán)有限公司，廣東 湛江 524499）

水產(chǎn)養(yǎng)殖水體往往殘留大量的氮，主要以氨氮（NH4+-N）、亞硝酸鹽氮（NO2–-N）、硝酸鹽氮（NO3–-N）和有機(jī)氮的形式存在[1]。微藻在利用CO2進(jìn)行光合作用的同時(shí)可從環(huán)境中吸收利用N、P 等物質(zhì)[2]，對水質(zhì)有一定調(diào)控作用。藻細(xì)胞生存環(huán)境中存在大量微生物，藻菌相互作用形成藻際環(huán)境：藻光合作用可向環(huán)境釋放碳源等有機(jī)物，細(xì)菌吸收這些物質(zhì)進(jìn)行自身生長繁殖，產(chǎn)生的無機(jī)鹽等物質(zhì)釋放到環(huán)境中又可被藻吸收利用[3-5]，微藻為細(xì)菌提供可附著棲息地，并通過釋放胞外產(chǎn)物促進(jìn)細(xì)菌生長，確保細(xì)菌的生長環(huán)境有利且穩(wěn)定；細(xì)菌對氧氣的消耗可緩解氧氣對微藻的抑制作用，增強(qiáng)藻類生命活動(dòng)，促進(jìn)對水環(huán)境中氮磷等營養(yǎng)鹽的吸收[6-8]。由微藻與細(xì)菌組成的體系可更有效吸收水中的氮、磷等污染物，比單一微藻在水環(huán)境調(diào)控方面效果更佳[9]，有效率高、成本低、二次污染小的特點(diǎn)，有較好的應(yīng)用前景。利用小球藻（Chlorellasp.）、隱藻（Cryp‐tophytasp.）與污水細(xì)菌的藻菌體系比純藻體系對氮磷去除效果更佳，藻生物量更大[10]；在高溫、高鹽和強(qiáng)光環(huán)境中，側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus lat‐erosporus）和威氏海鏈藻（Thalassiosira weissflogii）構(gòu)建的藻菌體系可有效吸收對蝦池塘中過量的氨氮[11]；固定化的蛋白核小球藻（Chlorella pyre‐noidosa）和光合細(xì)菌對PO43–-P 和NH4+-N 的去處效果顯著高于二者單獨(dú)培養(yǎng)體系[12]。但是，Kato 等[13]從沿海海水分離的一株單胞菌會(huì)分泌物質(zhì)抑制骨條藻（Skeletonemasp.）的生長；當(dāng)某些細(xì)菌增多時(shí)，會(huì)與藻類在營養(yǎng)物質(zhì)上形成競爭[14]。因此，利用藻菌互利共生關(guān)系，構(gòu)建合理并有特定功能的藻菌體系，是生物法調(diào)控養(yǎng)殖水環(huán)境的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。波吉卵囊藻（Oocystis borgei）是廣泛分布于對蝦養(yǎng)殖池塘、河口等水域的綠藻，有廣溫廣鹽性，其種群增長穩(wěn)定，在對蝦養(yǎng)殖池塘的中后期可成為優(yōu)勢種，能穩(wěn)定池塘水質(zhì)，已廣泛應(yīng)用于對蝦養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)控[15-16]。本研究擬從波吉卵囊藻藻際環(huán)境中分離、鑒定附生細(xì)菌，構(gòu)建分離細(xì)菌與波吉卵囊藻的藻菌體系，研究該體系的氮吸收特性，為藻菌體系在水生態(tài)環(huán)境調(diào)控上的應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

波吉卵囊藻由廣東海洋大學(xué)藻類資源開發(fā)與養(yǎng)殖環(huán)境生態(tài)修復(fù)實(shí)驗(yàn)室提供，培養(yǎng)于改良的f/2海水培養(yǎng)基；使用2216E 固體培養(yǎng)基進(jìn)行菌株分離純化和菌落形態(tài)觀察，使用2216E 液體培養(yǎng)基進(jìn)行菌株的活化及培養(yǎng)。

收集培養(yǎng)7 d 的波吉卵囊藻藻細(xì)胞，用無菌海水適當(dāng)稀釋，采用涂布平板法將藻液接種于2216E固體培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃無光倒置培養(yǎng)，挑出優(yōu)勢單菌落培養(yǎng)，經(jīng)多次平板劃線純化，獲得菌株OA-1。

1.2 菌株OA-1的生長及鑒定

1.2.1 菌落形態(tài)觀察、生長曲線 將菌株OA-1 劃線接種于2216E固體培養(yǎng)基，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 d，觀察菌落形態(tài)。該菌株接種于2216E 液體培養(yǎng)基，于30 ℃搖床培養(yǎng)，每3 h 取樣測定600 nm 處的光密度值D，直至進(jìn)入衰亡期，繪制生長曲線。

1.2.2 菌株OA-1 的生化鑒定 根據(jù)杭州微生物試劑有限公司的細(xì)菌微量生化反應(yīng)管說明書進(jìn)行，包括革蘭染色、尿素、甘露糖、ONPG（β-半乳糖）、蔗糖、水楊酸、山梨醇、山梨糖、葡萄糖胺、半乳糖、葡萄糖、木糖、乳糖、丙二酸鹽、七葉苷、硝酸鹽還原、接觸酶、MR-VP試驗(yàn)。

1.2.3 16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析 取對數(shù)生長期的菌液，離心，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技(北京)有限公司）提取基因組DNA，用細(xì)菌通用引物（27F 和1492R）擴(kuò)增OA-1 的16S rDNA 基因。PCR 產(chǎn)物送至廣州生物工程股份有限公司測序，將測序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行BLAST 同源性比對，選取相似度較高的基因序列，用MEGA10.0的鄰近法構(gòu)建OA-1 系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstraps 重復(fù)檢驗(yàn)1000次，將OA-1鑒定至種。

1.3 菌株OA-1與波吉卵囊藻藻菌體系的氮吸收特性分析

1.3.1 藻菌體系對微藻生長的影響 設(shè)置純藻對照組和藻菌聯(lián)合組，檢測各組葉綠素a 含量變化。培養(yǎng)體系為200 mL，對照組接入初始藻細(xì)胞密度為106mL-1的波吉卵囊藻，藻菌聯(lián)合組按藻菌比例1∶1（藻細(xì)胞密濃度為106mL-1，細(xì)菌濃度為106cfu·mL-1）接入波吉卵囊藻和所分離細(xì)菌[17]，連續(xù)培養(yǎng)10 d，每2 d 測定各組的葉綠素含量。采用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇萃取藻細(xì)胞中的色素，取5 mL藻液，以5 000 r/min離心10 min，棄上清，加入5 mL 體積分?jǐn)?shù)95%乙醇重懸，于黑暗環(huán)境常溫萃取24 h，離心，以體積分?jǐn)?shù)95%乙醇為參比，使用分光光度計(jì)測定萃取液上清在波長630、647 和664 nm 處的光密度（D），計(jì)算藻細(xì)胞葉綠素a含量[18]：

1.3.2 不同氮源條件下藻菌體系的氮吸收速率 配制鹽度為30的人工海水[19。以f/2培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配制無氮海水培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)前將波吉卵囊藻和OA-1用無氮培養(yǎng)基進(jìn)行氮饑餓處理24 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)置藻菌體系、純藻體系和純菌體系，分別以硝酸鈉、亞硝酸鈉、氯化銨和尿素為氮源，參照f/2 培養(yǎng)基的氮濃度設(shè)置（氮元素起始濃度為0.88 mmol/L），共12 個(gè)處理組，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。將饑餓處理后的微藻和細(xì)菌按106mL-1或cfu/mL 分別接入純藻體系組和純菌體系組，藻菌體系按照藻菌1∶1構(gòu)建，培養(yǎng)水體為100 mL 的f/2 海水培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱中恒溫恒光（25 ℃，2 000 lx）培養(yǎng)4 h[20]。培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液過0.22 μm 濾膜，用Multi N/C 2100 測定濾液中的氮濃度。氮吸收速率計(jì)算公式[21]：

式中，P為氮吸收速率（μmol·h-1·g-1），c0、ct分別為實(shí)驗(yàn)前后水體中氮營養(yǎng)鹽濃度（μmol/L），V為水體體積（L），m為生物的干質(zhì)量（g），t為時(shí)間（h）。

1.3.3 不同氮濃度條件下藻菌體系的氮吸收速率在f/2 無氮海水培養(yǎng)基（同1.3.2）中分別以硝酸鈉、亞硝酸鈉、氯化銨和尿素為氮源，配制初始氮濃度為1、3、5、7 mmol/L 的四種培養(yǎng)基。氮饑餓處理同1.4.2，將饑餓處理后的微藻和細(xì)菌按106mL-1或cfu/mL 接入100 mL 上述不同氮濃度的培養(yǎng)基中，構(gòu)建1∶1 藻菌體系，置于光照培養(yǎng)箱中恒溫恒光（25 ℃，2 000 lx）培養(yǎng)4 h，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。氮吸收速率測定及計(jì)算同1.3.2。

2 結(jié)果

2.1 菌株OA-1的形態(tài)和生長特征

菌株OA-1 橘紅色，圓形，隆起，邊緣整齊，略透明，表面光滑，濕潤；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌落顏色逐漸加深（圖1）。OA-1 的生長曲線見圖2，在0～3 h處于延滯期，3～18 h處于指數(shù)生長期，18 h后達(dá)到穩(wěn)定期，33 h時(shí)進(jìn)入衰亡期。

圖1 OA-1菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of OA-1 strain

圖2 菌株OA-1的生長曲線Fig.2 Growth curve of strain OA-I

2.2 菌株0A-1的生理生化特性

OA-1的生理生化鑒定結(jié)果如表1所示。該菌革蘭染色呈陰性，尿素、ONPG、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖胺、硝酸鹽還原和MR-VP反應(yīng)陽性，甘露糖、半乳糖、木糖、乳糖、丙二酸鹽、水楊酸、山梨醇、山梨糖、七葉苷和接觸酶反應(yīng)陰性。可見，該細(xì)菌可利用有機(jī)氮源尿素,對硝酸鹽有還原作用，可應(yīng)用于構(gòu)建藻菌體系，處理水體中的氮。

表1 OA-1菌株生理生化鑒定Table 1 Physiological and biochemical identification results of OA-1 strain

2.3 16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴(kuò)增獲得片段大小為1 410 bp的16S rDNA序列，NCBI GeneBank 數(shù)據(jù)庫序列號OM276863，序列為

經(jīng)Blast 比對，所構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。圖3顯示，該菌株與多株居海噬冷菌（Algoriphagusmarincola）聚為一支，同源性達(dá)99%，結(jié)合形態(tài)特征及生化鑒定，將該菌株確定為居海噬冷菌。

圖3 基于16S rDNA基因序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence homology

2.4 藻菌體系對微藻生長的影響

居海噬冷菌與波吉卵囊藻共培養(yǎng)10 d 后，葉綠素a含量均高于純藻培養(yǎng)對照組（圖4），藻菌體系組的葉綠素a 質(zhì)量濃度最高達(dá)2.74 mg/L，對照組僅為1.88 mg/L，增加45.74%，表明居海噬冷菌促進(jìn)了波吉卵囊藻葉綠素a 的積累，在該藻菌體系的條件培養(yǎng)下，微藻生長更快，該菌株可用于構(gòu)建與波吉卵囊藻的藻菌體系。

圖4 藻菌體系對波吉卵囊藻葉綠素a含量的影響Fig.4 Effects of algae-bacteria system on chlorophyll a content of Oocystis borgei

2.5 不同氮源條件下藻菌體系的氮吸收速率

在4種氮源條件下，藻菌體系、純藻體系和純菌體系之間氮吸收速率差異均顯著（P<0.05）（圖5），藻菌體系組均顯著高于單獨(dú)培養(yǎng)的微藻或細(xì)菌。以亞硝酸鈉和氯化銨為氮源時(shí)，藻菌體系組氮吸收速率高于純藻和純菌體系之和，說明在對這兩種氮源的利用過程中，居海噬冷菌和波吉卵囊藻存在協(xié)同作用。

圖5 不同培養(yǎng)體系對氮的吸收速率Fig.5 Nitrogen absorption rates in different culture systems

2.6 不同氮源及氮濃度條件下藻菌體系的氮吸收速率

圖6表明，在4 種不同的氮源中，藻菌體系氮濃度水平對氮吸收速率顯著影響（P<0.05）。在以硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基中，在7 mmol·L-1的最高氮濃度時(shí)，藻菌體系吸收速率達(dá)36.93 μmol·h-1·g-1。在以亞硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基中，在3 mmol·L-1氮濃度時(shí)的吸收速率最高，為6.28 μmol·h-1·g-1。在以氯化銨為氮源的培養(yǎng)基中，在氮濃度3 mmol·L-1時(shí)有吸收速率平均值最高，為20.09 μmol·h-1·g-1，與5 mmol·L-1氮濃度時(shí)差異不顯著，但氮濃度達(dá)7 mmol·L-1時(shí)，吸收速率顯著下降（P<0.05）。在以尿素為氮源的培養(yǎng)基中，隨著氮濃度的升高吸收速率先升后降，在5 mmol·L-1氮濃度時(shí)最高，為63.58 μmol·h-1·g-1，隨后下降?？芍噍^于其他三種氮源，該藻菌體系在以亞硝酸鈉為氮源時(shí)，對氮的吸收速率明顯偏低，說明此藻菌體系對亞硝態(tài)氮的吸收效果不明顯；該藻菌體系對硝酸鈉的耐受性較高，以硝酸鈉為氮源時(shí)，隨著氮濃度的升高，吸收速率也升高。

圖6 藻菌體系在不同氮源及氮濃度中的氮吸收速率Fig.6 Nitrogen absorption rate of algae-bacteria system in different nitrogen sources and concentrations

3 討論

3.1 藻菌體系構(gòu)建及其功能

微藻為水生環(huán)境中最重要的初級生產(chǎn)者，對水體的穩(wěn)定有不可替代的地位。微藻細(xì)胞向環(huán)境中釋放營養(yǎng)物質(zhì)，吸引眾多細(xì)菌在其周圍生活，形成以藻細(xì)胞為核心的富營養(yǎng)區(qū)域——藻際環(huán)境。不同的微藻向環(huán)境釋放的物質(zhì)不同，形成的藻際環(huán)境存在差異。細(xì)菌的數(shù)量和種類對微藻的影響較大。假單胞菌（Pseudomonassp.）BB1-a 可促進(jìn)普通小球藻的生長[22]；固氮螺菌（Azospirillum brasilense）會(huì)接受小球藻釋放的信號物質(zhì)誘導(dǎo)分泌吲哚乙酸（IAA），促進(jìn)小球藻的生長[23]；從黃化的螺旋藻（Spirulinasp.）體內(nèi)分離的一株鹽單胞菌（Halomonassp.）則會(huì)明顯抑制螺旋藻的生長[24]。在養(yǎng)殖環(huán)境中存在多種細(xì)菌，一些細(xì)菌的硝化和反硝化作用等可有效利用水體中的無機(jī)氮，而有害細(xì)菌則會(huì)危害養(yǎng)殖動(dòng)物，造成經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立和維持穩(wěn)定的藻菌群落結(jié)構(gòu)是生態(tài)健康養(yǎng)殖的基礎(chǔ)，合理利用水體中微藻和細(xì)菌的互利、共生關(guān)系，增加水中元素利用率可減少養(yǎng)殖過程中的污染，是提高養(yǎng)殖成活率和經(jīng)濟(jì)效益的有效途徑。

同一種微藻會(huì)隨所處環(huán)境的改變而影響藻際微生物的群落結(jié)構(gòu)[25]，不同微藻和細(xì)菌對不同水質(zhì)環(huán)境的適應(yīng)性有較大差別，其生長和對水體營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力亦有不同[26]，因此，在養(yǎng)殖環(huán)境中構(gòu)建藻菌體系時(shí)，宜優(yōu)先選用本土分離的微藻和細(xì)菌種類。試驗(yàn)用波吉卵囊藻分離自對蝦養(yǎng)殖池塘[27]，在實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定環(huán)境中長時(shí)間培養(yǎng)，其藻際微生群落結(jié)構(gòu)相對固定，分離的居海噬冷菌長期附生于波吉卵囊藻。通過分離藻際菌群中的促生菌，可構(gòu)建有價(jià)值的藻菌體系，探究藻菌相互作用機(jī)制等。段露露等[28]發(fā)現(xiàn)，在分離自杜氏鹽藻（Dunaliella salina）的鹽單胞菌與杜氏鹽藻的藻菌體系中，杜氏鹽藻葉綠素a 含量相比對照組提高36.3%，β-胡蘿卜素增加56.4%。王書亞等[29]將微小桿菌（Exiguobacterium collins）、假單胞菌（Pseudomonadaceaesp.）和枯草芽孢桿菌分別與小球藻構(gòu)建藻菌體系，發(fā)現(xiàn)葉綠素a 含量比純培養(yǎng)的小球藻提高了1.79 倍、1.49 倍和1.58 倍。在本研究構(gòu)建的藻菌體系中，波吉卵囊藻的葉綠素a 含量達(dá)到2.74 mg/L，比對照組增加45.74%。微藻和細(xì)菌之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，藻菌的種類、所處環(huán)境、自身生長狀況等因素均影響微藻和細(xì)菌的相互作用效果，所以藻菌間相互作用并非一致，可能存在著互利共生、偏利共生、競爭或拮抗的關(guān)系，營養(yǎng)環(huán)境與營養(yǎng)交換對二者間相互作用似起重要作用[30-31]。本研究中，在不同溶解態(tài)氮環(huán)境中，藻菌體系的氮吸收速率均高于純藻或純菌體系，本研究表明，居海噬冷菌可利用有機(jī)氮源尿素，對硝酸鹽有還原作用，所以在以尿素或硝酸鈉為氮源時(shí)，藻與菌對這兩種氮的利用均較高，藻菌體系協(xié)同效果不如在以亞硝酸鈉或氯化銨為氮源時(shí)明顯。綜上，居海噬冷菌OA-1 可顯著促進(jìn)波吉卵囊藻的生長，且二者的藻菌體系對氮的吸收速率顯著高于單獨(dú)培養(yǎng)體系，其作用機(jī)制、具體功能及應(yīng)用需進(jìn)一步探索。

3.2 藻菌體系對氮的吸收規(guī)律

氮影響生物體細(xì)胞的分裂和生長，是生物生長的必需元素之一。微藻和細(xì)菌通過主動(dòng)運(yùn)輸吸收水體中的溶解態(tài)氮，在氮吸收上存在“飽和效應(yīng)”[32]。假微型海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）在尿素處理組的生長較好，但高濃度的銨鹽會(huì)對其產(chǎn)生抑制[33]。孟鴿等[34]研究發(fā)現(xiàn)，銨鹽會(huì)對藻產(chǎn)生抑制。本研究也有高濃度的銨態(tài)氮、尿素氮和亞硝銨態(tài)氮對藻菌體系的氮吸收速率產(chǎn)生抑制的結(jié)果。以硝酸鈉為氮源時(shí)，隨氮濃度的升高，吸收速率隨之增高，但在其他三種氮源中均出現(xiàn)拐點(diǎn)，亞硝酸鈉為氮源時(shí)拐點(diǎn)在氮濃度3 mmol·L-1，氯化銨和尿素為氮源時(shí)，拐點(diǎn)出現(xiàn)在氮濃度5 mmol·L-1。因此亞硝酸鹽氮對氮的吸收抑制早于其他2種氮源。

水體微生物對不同形式的溶解態(tài)氮有選擇性利用的特征，所以不同的氮源會(huì)對藻菌體系的氮吸收能力產(chǎn)生影響。在本研究所設(shè)氮濃度梯度下，藻菌體系對4 種氮源的氮吸收速率均有顯著差異。4種氮源間，對尿素氮的吸收速率普遍較高，其次是銨態(tài)氮，亞硝態(tài)氮的吸收速率較低。劉燕[35]研究發(fā)現(xiàn)，小球藻與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）的藻菌體系對銨態(tài)氮的利用效果最好，高于硝態(tài)氮。本研究中，銨態(tài)氮的吸收速率較高，其原因是細(xì)菌通過硝化過程直接利用銨態(tài)氮，藻菌體系中藻和菌的協(xié)同作用提高了對銨鹽的利用效果[36-37]。微藻不僅可利用水體中溶解性無機(jī)氮，亦可利用尿素等有機(jī)氮[38]，異養(yǎng)菌的引入提高了對有機(jī)氮的利用效率，可能是本研究中藻菌體系對尿素氮吸收速率較高的原因。

藻和菌之間通過交換代謝產(chǎn)物形成互利共生關(guān)系，增強(qiáng)了對養(yǎng)殖水體營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率[39]。隨著集約化、高密度養(yǎng)殖的推廣，養(yǎng)殖水體中的氮磷等元素更易堆積，將藻菌體系運(yùn)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水調(diào)控，符合生態(tài)學(xué)原理，生態(tài)環(huán)保，有能耗小、成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)[40]。但現(xiàn)實(shí)環(huán)境的養(yǎng)殖水環(huán)境中變量因素較多，不同微藻和細(xì)菌的組合及藻菌比例的差異都表現(xiàn)出特異性，對藻菌體系還應(yīng)深入研究。

4 結(jié)論

1）從室內(nèi)培養(yǎng)的波吉卵囊藻藻際微生物群落中分離出1株促生菌，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化鑒定和16S rDNA序列比對，鑒定為居海噬冷菌（A.marincola）。

2）菌株OA-1 與波吉卵囊藻共培養(yǎng)可促進(jìn)藻的生長，藻的葉綠素a含量比對照組增加45.74%。

3）波吉卵囊藻與居海噬冷菌的藻菌體系對氮的吸收速率顯著高于純藻體系和純菌體系，在以亞硝酸鈉和氯化銨為氮源時(shí)，藻菌間存在明顯的協(xié)同作用。

4）藻菌體系對氮的吸收速率存在“飽和效應(yīng)”，以尿素或氯化銨為氮源時(shí)，在氮濃度5 mmol·L-1出現(xiàn)吸收拐點(diǎn)，以亞硝酸鈉為氮源時(shí)，在3 mmol·L-1出現(xiàn)吸收拐點(diǎn)，過高的氮濃度會(huì)抑制藻菌體系對氮的吸收。