槐定堿對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549順鉑敏感性及miR-216a-5p/ZEB1軸的影響

聶佳， 李方， 李延波

（1.河北省中醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北石家莊 050000；2.邯鄲市中心醫(yī)院腫瘤科，河北邯鄲 056000；3.邢臺(tái)市信都區(qū)人民醫(yī)院普通內(nèi)科，河北邢臺(tái) 054001）

肺癌分為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），其中，非小細(xì)胞肺癌占85%以上，主要包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌等。目前，臨床主要通過(guò)手術(shù)、放化療等多種手段治療，但患者總體生存率仍較低[1]。腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物不敏感或容易產(chǎn)生耐藥是腫瘤化療效果不佳的原因[2]。提高化療敏感性，對(duì)于改善NSCLC患者生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期、降低死亡率具有重要意義。中醫(yī)藥在治療肺癌方面具有潛在優(yōu)勢(shì)，對(duì)放化療及分子靶向治療具有一定的增效作用，可不同程度地影響患者預(yù)后[3-5]。苦豆子為豆科植物苦豆子Sophora alopecuroidesL.的種子，具有清熱燥濕、止痛殺蟲(chóng)等功效，槐定堿（sophoridine）是苦豆子中含量較高的生物堿之一，有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能、抗心律失常、抗腫瘤等[6-11]多種藥理學(xué)作用。本研究以肺腺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察槐定堿對(duì)A549 細(xì)胞化療敏感性的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，為槐定堿相關(guān)藥物開(kāi)發(fā)應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系人肺腺癌A549 細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞中心。

1.2 藥物、試劑與儀器槐定堿（分子式：C15H24N2O；分子量：248.36），純度≥96.5%，成都曼斯特生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：A0651；順鉑（cisplatin，合肥千盛生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：200822）。RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）；抑制劑（miR-216a-5p inhibitor）、抑制劑陰性對(duì)照（inhibitor-NC）、miR-216a-5p 擬似物（miR-216a-5p mimic）、擬似物陰性對(duì)照（mimic-NC）（廣州銳博生物科技有限公司生產(chǎn)）；LipofectamineTM2000（美國(guó)Invitrogen公司）；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔抗人鋅指E 盒結(jié)合蛋白1（ZEB1）、B 細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）等抗體及山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）-辣根過(guò)氧化物酶（HRP）（英國(guó)Abcam 公司）。ELX800 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek 公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)Thermofisher 公司）；FACSCalibu 流式細(xì)胞儀系統(tǒng)（美國(guó)BD公司）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基（100 U/mL 青霉素+100 mg/L 鏈霉素）中，5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁80%時(shí)進(jìn)行傳代，每2 ～3 d 傳代1次，選取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 槐定堿對(duì)A549細(xì)胞順鉑敏感性的影響

1.4.1 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)不同濃度槐定堿、順鉑處理后的細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549 細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，接種于96孔板，24 h后吸去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度槐定堿（10、20、40、80、160 μmol/L）、順鉑（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 nmol/L）的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白組（不加藥物）。24 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)孵育4 h，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，充分振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 波長(zhǎng)處吸光度（OD）值。計(jì)算不同濃度槐定堿、順鉑干預(yù)后的細(xì)胞增殖抑制率，增殖抑制率=（1-不同濃度藥物組OD值/空白組OD值）×100%。根據(jù)結(jié)果，選取接近于20%抑制濃度（20% inhibitory concentration，IC20）的槐定堿和順鉑濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 細(xì)胞分組與干預(yù) 取對(duì)數(shù)期A549 細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、槐定堿組、順鉑組和槐定堿+順鉑組。對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)；槐定堿組和順鉑組根據(jù)“1.4.1”項(xiàng)篩選的藥物濃度，分別加入40 μmol/L的槐定堿和2.0 nmol/L 的順鉑；槐定堿+順鉑組同時(shí)加入上述濃度的槐定堿和順鉑。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4.3 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)集落形成能力 取“1.4.2”項(xiàng)中各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL接種于6孔板，水平位置輕晃培養(yǎng)板，使細(xì)胞均勻分布，置于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。每3 d更換一次培養(yǎng)基。2 周后，吸去培養(yǎng)基，PBS 清洗，每孔中加入200 μL 結(jié)晶紫，染色20 min，沖洗晾干，觀察集落數(shù)。

1.4.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集“1.4.2”項(xiàng)中各組細(xì)胞，1000 r/min（離心半徑8 cm）離心5 min，棄上清，將細(xì)胞吹打均勻，制備單細(xì)胞懸液，再次離心，加入400 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin-FITC 混勻，避光室溫孵育15 min，加入10 μL PI，4 ℃避光孵育5 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算：細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 槐定堿對(duì)A549細(xì)胞miR-216a-5p/ZEB1 軸的影響

1.5.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取對(duì)數(shù)期A549 細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 d，調(diào)整密度為1 ×106/mL，接種于6孔板，待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，胰酶消化，收集細(xì)胞。隨機(jī)分為對(duì)照（control）組，抑制劑陰性對(duì)照（inhibitor-NC）組、抑制劑（inhibitor）組、槐定堿組、槐定堿+inhibitor-NC組、槐定堿+inhibitor組。control組常規(guī)培養(yǎng)，使用LipofectamineTM2000， 將miR- 216a- 5p inhibitor- NC 轉(zhuǎn) 染 至inhibitor-NC組和槐定堿+inhibitor-NC組細(xì)胞，將miR-216a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染至inhibitor組和槐定堿+inhibitor組細(xì)胞，24 h 后，槐定堿組、槐定堿+inhibitor-NC組和槐定堿+inhibitor組分別加入40 μmol/L的槐定堿，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）法檢測(cè)細(xì)胞中miR-216a-5p 和ZEB1 mRNA 表達(dá) 取“1.5.1”項(xiàng)中各組細(xì)胞，PBS 清洗，TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 260 nm和280 nm 處 光 密 度（OD）值，OD（260 nm）/OD（280 nm）為1.8 ～2.0 表示RNA 質(zhì)量較好。反轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系：2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 加至20 μL。按照95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s 的反應(yīng)程序，共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算miR-216a-5p mRNA 和ZEB1 mRNA 表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)所用引物由上海生工生物公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.5.3 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miR-216a-5p與ZEB1的靶向關(guān)系 利用TargetScan 7.2、miRanda等軟件預(yù)測(cè)miR-216a-5p 的下游靶基因，將ZEB1的3’UTR 區(qū)域野生型（wild type，wt）和突變型（mutant typ，mut）核苷酸序列分別構(gòu)建至pGL3-basic載體報(bào)告基因Luciferase，構(gòu)建熒光素酶質(zhì)粒。取對(duì)數(shù)期A549 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，接種于6 孔板，待細(xì)胞鋪滿約50%時(shí)，將wt ZEB1和mut ZEB1質(zhì)粒載體，分別與miR-216a-5p mimic和miR-216a-5p mimic-NC 共轉(zhuǎn)染，孵育48 h。棄去培養(yǎng)基，裂解細(xì)胞，檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性和內(nèi)參海腎熒光素酶活性，相對(duì)熒光素酶活性以二者比值表示。

1.5.4 Western Blot 法檢測(cè)細(xì)胞中ZEB1、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá) 收集“1.5.1”項(xiàng)中各組細(xì)胞，PBS清洗，加入200 μL蛋白提取液，冰上裂解30 min，12000 r/min（離心半徑8 cm）離心5 min，取上清，二喹啉甲酸（BCA）法檢測(cè)細(xì)胞蛋白濃度，制膠、上樣；進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜；TBST 溶液洗膜，加入5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h；TBST溶液洗膜，將膜放入稀釋后的ZEB1（1∶800）、Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）、GAPDH（1∶1000）一抗中，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST溶液洗膜，將膜放入稀釋后的HRP 標(biāo)記的二抗（1∶3000）中，室溫避光孵育2 h；TBST 溶液洗膜，加入電化學(xué)發(fā)光（ECL）發(fā)光液，室溫孵育1 min，進(jìn)行顯色分析。應(yīng)用ImageJ 軟件進(jìn)行灰度值分析，以ZEB1、Bcl-2、Bax 蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示其相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多樣本比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度槐定堿對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響各濃度槐定堿作用后，A549 細(xì)胞增殖抑制率均較空白組升高，且隨著槐定堿濃度增加，A549細(xì)胞增殖抑制率增加（P＜0.05），表明不同濃度槐定堿對(duì)A549 細(xì)胞均有增殖抑制作用。具體結(jié)果見(jiàn)圖1。槐定堿作用于A549 細(xì)胞的IC20為38.56 μmol/L，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取接近IC20的濃度：40 μmol/L。

圖1 不同濃度槐定堿對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響Figure 1 Effect of different concentrations of locustine on the proliferative capacity of A549 cells

2.2 不同濃度順鉑對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響各濃度順鉑作用后，A549 細(xì)胞增殖抑制率均較空白組升高，且隨著順鉑濃度增加，A549 細(xì)胞增殖抑制率增加（P＜0.05），表明不同濃度順鉑對(duì)A549細(xì)胞均有增殖抑制作用。具體結(jié)果見(jiàn)圖2。順鉑作用于A549 細(xì)胞的IC20為1.93 nmol/L，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取接近IC20的濃度：2.0 nmol/L。

圖2 不同濃度順鉑對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響Figure 2 Effect of different concentrations of cisplatin on the proliferative capacity of A549 cells

2.3 槐定堿對(duì)順鉑處理的A549 細(xì)胞集落形成的影響對(duì)照組、槐定堿組、順鉑組和槐定堿+順鉑組細(xì)胞集落數(shù)分別為（336.26 ± 23.15）、（172.15 ±18.19）、（162.57 ± 16.23）、（96.58 ± 13.64）個(gè)。與對(duì)照組比較，槐定堿組、順鉑組和槐定堿+順鉑組細(xì)胞集落數(shù)均減少（P＜0.05）；槐定堿+順鉑組細(xì)胞集落數(shù)少于槐定堿組和順鉑組（P＜0.05）。表明槐定堿可增強(qiáng)順鉑對(duì)A549 細(xì)胞集落形成的抑制作用。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 各組平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 3 Results of plate cloning experiments for each group

2.4 槐定堿對(duì)順鉑處理的A549 細(xì)胞凋亡的影響對(duì)照組、槐定堿組、順鉑組和槐定堿+順鉑組細(xì)胞凋亡率分別為：（2.34 ± 0.79）%、（12.15 ±1.26）%、（15.74±1.35）%、（22.68±1.57）%。與對(duì)照組比較，槐定堿組、順鉑組和槐定堿+順鉑組細(xì)胞凋亡率均升高（P＜0.05）；槐定堿+順鉑組細(xì)胞凋亡率高于槐定堿組和順鉑組（P＜0.05）。表明槐定堿可增強(qiáng)順鉑對(duì)A549 細(xì)胞的促凋亡作用。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 各組A549細(xì)胞凋亡的流式散點(diǎn)圖Figure 4 Flow cytometry scatter plot for A549 cell apoptosis in each group

2.5 槐定堿對(duì)A549 細(xì)胞中miR-216a-5p、ZEB1 mRNA 表達(dá)的影響與control組和inhibitor-NC組比較，inhibitor組miR-216a-5p 表達(dá)水平降低，ZEB1 mRNA表達(dá)水平升高（均P＜0.05）；與control組比較，槐定堿組miR-216a-5p 表達(dá)水平升高，ZEB1 mRNA表達(dá)水平降低（均P＜0.05）；與inhibitor組比較，槐定堿+inhibitor組miR-216a-5p 表達(dá)水平升高，ZEB1 mRNA 表達(dá)水平降低（均P＜0.05）；與槐定堿組、槐定堿+inhibitor-NC組比較，槐定堿+inhibitor組miR-216a-5p 表達(dá)水平降低，ZEB1 mRNA表達(dá)水平升高（均P＜0.05）。表明下調(diào)A549細(xì)胞中miR-216a-5p 可促進(jìn)ZEB1 mRNA 表達(dá)，而槐定堿可減弱下調(diào)miR-216a-5p 對(duì)ZEB1 mRNA 表達(dá)的促進(jìn)作用。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組A549細(xì)胞中miR-216a-5p、ZEB1 mRNA表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of expression levels of miR-216a-5p and ZEB1 mRNA among various groups of A549 cells （±s，n=5）

表2 各組A549細(xì)胞中miR-216a-5p、ZEB1 mRNA表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of expression levels of miR-216a-5p and ZEB1 mRNA among various groups of A549 cells （±s，n=5）

①P＜0.05，與對(duì)照（control）組比較；②P＜0.05，與抑制劑陽(yáng)性對(duì)照（inhibitor-NC）組比較；③P＜0.05，與抑制劑（inhibitor）組比較；④P＜0.05，與槐定堿組比較；⑤P＜0.05，與槐定堿+inhibitor-NC組比較

組別control組inhibitor-NC組inhibitor組槐定堿組槐定堿+inhibitor-NC組槐定堿+inhibitor組F值P值miR-216a-5p 1.01±0.121.02±0.100.13±0.05①②1.79±0.14①1.82±0.16②④1.18±0.11③④⑤172.459＜0.001 ZEB1 mRNA 1.02±0.111.01±0.122.59±0.18①②0.35±0.06①0.33±0.05②④1.76±0.15③④⑤335.621＜0.001

2.6 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染miR-216a-5p mimic可明顯降低ZEB1 wt 相對(duì)熒光素酶活性（P＜0.05），而對(duì)ZEB1 mut 相對(duì)熒光素酶無(wú)顯著性影響（P＞0.05），表明miR-216a-5p 可靶向調(diào)控ZEB1 的表達(dá)。具體結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 miR-216a-5p與ZEB1的靶向關(guān)系Figure 5 The targeting relationship between miR-216a-5p and ZEB1

2.7 槐定堿對(duì)A549 細(xì)胞ZEB1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響與control組和inhibitor-NC組比較，inhibitor組ZEB1、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平升高，Bax蛋白表達(dá)水平降低（均P＜0.05）；與control組比較，槐定堿組ZEB1、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低，Bax蛋白表達(dá)水平升高（均P＜0.05）；與inhibitor組比較，槐定堿+inhibitor組ZEB1、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低，Bax 蛋白表達(dá)水平升高（均P＜0.05）；與槐定堿組、槐定堿+inhibitor-NC組比較，槐定堿+inhibitor組ZEB1、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平升高，Bax 蛋白表達(dá)水平降低（均P＜0.05）。表明下調(diào)A549 細(xì)胞中miR-216a-5p 可促進(jìn)ZEB1 蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，而槐定堿可減弱miR-216a-5p 表達(dá)下調(diào)所致的抑凋亡作用。具體結(jié)果見(jiàn)表3、圖6。

圖6 各組A549細(xì)胞中ZEB1、Bcl-2、Bax的Western Blot電泳圖Figure 6 Western Blot electrophoretogram of ZEB1，Bcl-2 and Bax in various groups of cells

表3 各組細(xì)胞中ZEB1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of relative protein expression of ZEB1，Bcl-2 and Bax amongvarious groups of cells （±s，n=5）

表3 各組細(xì)胞中ZEB1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of relative protein expression of ZEB1，Bcl-2 and Bax amongvarious groups of cells （±s，n=5）

①P＜0.05，與對(duì)照（control）組比較；②P＜0.05，與抑制劑陽(yáng)性對(duì)照（inhibitor-NC）組比較；③P＜0.05，與抑制劑（inhibitor）組比較；④P＜0.05，與槐定堿組比較；⑤P＜0.05，與槐定堿+inhibitor-NC組比較

組別control組inhibitor-NC組inhibitor組槐定堿組槐定堿+inhibitor-NC組槐定堿+inhibitor組F值P值ZEB1蛋白相對(duì)表達(dá)量0.78±0.080.76±0.071.16±0.12①②0.15±0.04①0.17±0.04②④0.89±0.07③④⑤179.523＜0.001 Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量0.82±0.080.80±0.071.19±0.10①②0.21±0.06①0.23±0.05②④0.97±0.09③④⑤183.259＜0.001 Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量0.43±0.060.45±0.050.16±0.04①②1.07±0.09①1.05±0.05②④0.31±0.05③④⑤211.467＜0.001

3 討論

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與基因突變、細(xì)胞信號(hào)通路傳導(dǎo)改變及新生血管異常等多種因素有關(guān)，手術(shù)切除不能完全治愈，且術(shù)后腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，患者5年生存率仍較低[12]。通過(guò)化療輔助治療NSCLC，可在一定程度上減少腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。以順鉑為基礎(chǔ)的化療是延長(zhǎng)患者生存期的主要手段之一，順鉑可抑制腫瘤細(xì)胞DNA 復(fù)制和RNA 合成，阻止細(xì)胞有絲分裂，抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡；然而化學(xué)耐藥性已成為制約鉑類藥物充分發(fā)揮治療效果的主要原因[13]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始從天然產(chǎn)物及其衍生物中尋找有效的抗腫瘤方法。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，部分中藥單體聯(lián)合放化療可產(chǎn)生增效或減毒效應(yīng)[14-15]。本研究選擇中藥苦豆子主要生物堿成分槐定堿作用于順鉑處理的人肺腺癌A549 細(xì)胞株，探討其能否提高細(xì)胞的化療敏感性。結(jié)果表明，槐定堿可增強(qiáng)順鉑對(duì)A549 細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，提示其可提高肺腺癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性。

另外，有研究證實(shí)，miRNA 有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞耐藥性和敏感性的作用[16]。miR-216a-5p與多種腫瘤關(guān)系密切，在不同腫瘤中的作用不盡相同。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-216a-5p mimic 可促進(jìn)腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[17]，而miR-216a-5p抑制劑則發(fā)揮相反作用[18]。Zhang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-216a-5p 在胰腺癌組織和細(xì)胞系中明顯下調(diào)，低表達(dá)的miR-216a-5p 可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤進(jìn)展。國(guó)內(nèi)外研究均報(bào)道，下調(diào)miR-216a-5p表達(dá)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和侵襲[20-21]。為進(jìn)一步闡明槐定堿抗肺腺癌的作用機(jī)制，本研究轉(zhuǎn)染miR-216a-5p inhibitor 至A549 細(xì) 胞 后，A549 細(xì) 胞 中miR-216a-5p 表達(dá)較control組和inhibitor-NC組明顯下降，而槐定堿組miR-216a-5p 表達(dá)較control組和inhibitor-NC組明顯升高，表明槐定堿可上調(diào)miR-216a-5p 表達(dá)。轉(zhuǎn)染miR-216a-5p inhibitor 后繼續(xù)使用槐定堿處理A549 細(xì)胞，細(xì)胞中miR-216a-5p上調(diào)趨勢(shì)被抑制，表明槐定堿參與調(diào)控肺腺癌細(xì)胞miR-216a-5p的表達(dá)。miR-216a-5p可通過(guò)調(diào)控下游靶基因發(fā)揮相關(guān)生物學(xué)作用。本研究經(jīng)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZEB1 是miR-216a-5p 的下游靶基因，進(jìn)一步觀察槐定堿對(duì)A549 細(xì)胞ZEB1、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明，槐定堿上調(diào)miR-216a-5p表達(dá)時(shí)，使ZEB1、Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax蛋白表達(dá)升高，提示槐定堿可能通過(guò)上調(diào)miR-216a-5p 表達(dá)，靶向降低ZEB1 表達(dá)，調(diào)控A549 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，起到抑制肺腺癌的作用。

綜上所述，本研究初步證實(shí)槐定堿對(duì)A549 細(xì)胞具有一定的增殖抑制及促凋亡作用，并可提高A549 細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，還可通過(guò)上調(diào)miR-216a-5p 靶向下調(diào)ZEB1 表達(dá)，調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax 等表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗肺腺癌的作用。但本研究?jī)H采用體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)槐定堿的藥理學(xué)功效，今后有待進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其靶向抗腫瘤作用及安全性。