黃芩素對膿毒癥大鼠的治療作用及機制

楊麗， 陳衛(wèi)， 華麗， 呂秀華

（濟南市人民醫(yī)院，山東濟南 271100）

膿毒癥（sepsis）是指因感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致全身多臟器功能障礙的臨床綜合征[1]。膿毒癥是嚴重的燒（創(chuàng)）傷、感染、休克或者大手術(shù)后常見的并發(fā)癥，其發(fā)病機制十分復(fù)雜，主要涉及炎癥反應(yīng)失衡、免疫功能紊亂、凝血功能障礙等多方面病理生理過程[2]。膿毒癥病情兇險，死亡率高，一直是重癥醫(yī)學研究領(lǐng)域的熱點。臨床常用的膿毒癥治療方法主要有液體治療與復(fù)蘇，抗感染治療和血流動力學支持[3]。中藥治療膿毒癥具有較好療效[4]，未來中藥及其活性成分治療可能成為膿毒癥治療的新方向。分析《太平圣惠方》治療膿毒癥的用藥規(guī)律，發(fā)現(xiàn)治療膿毒癥藥物使用頻次位于前5位的是大黃、黃芩、甘草、梔子、麥冬等[5]。黃芩為唇形科（Labiatae）黃芩屬（Scutellaria）多年生草本中藥植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，味苦，性寒，歸肺、膽、脾胃、大腸、小腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效。黃芩素（Baicalein），又名黃芩苷元、黃芩黃素，是從黃芩中提取的有效成分，其在生藥中占5.41%，是黃芩的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，具有抗病毒、抗菌、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[6-7]。探討黃芩素對膿毒癥的治療作用具有重要的研究意義，但目前相關(guān)黃芩素抗膿毒癥的研究較少，因此，本研究構(gòu)建膿毒癥大鼠模型，觀察黃芩素的治療機制，以期為臨床膿毒癥治療提供參考依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物40只SD大鼠（雌雄各半），體質(zhì)量190 ～210 g，購自南京君科生物工程公司，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（蘇）2016-0007。在山東大學動物實驗中心按照實驗動物管理條例進行飼養(yǎng)管理。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（24 ± 1）℃，濕度45%～50%，大鼠活動飲水自由。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物、試劑與儀器黃芩，購自成都嘉葉生物科技有限公司；注射用烏司他丁，購自廣東天普生化醫(yī)藥公司（批號：國藥準字H19990133）。內(nèi)毒素，購自上海澤葉生物科技公司；活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）及血漿纖維蛋白原（FIB）檢測試劑盒，購自上海圻明生物科技有限公司；異硫氰酸熒光素標記CD3（FITCCD3+）、藻紅蛋白標記CD4（PE-CD4+）、PE-Cy5-CD8+單克隆抗體，購自上海酶研生物科技有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1 抗體、Caspase-11抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗，購自上海嘉恒生物科技公司；白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒，購自上海恒斐生物科技公司；凝血分析儀，購自武漢科爾達醫(yī)療科技有限公司；Attune NxT流式細胞儀，購自北京昊諾斯科技公司。

1.3 黃芩素的提取[8]取黃芩20 kg 粉碎成粗粉，用乙醇回流提取3 次。減壓回收乙醇至無乙醇蒸出，殘余物加入85%乙醇，加熱使大部分溶解，過濾，濾液用柱層析用硅膠，以柱層析法進行分離，用石油醚與氯仿按照體積分數(shù)1∶3 的比例洗脫。收取第2條黃色帶，即得漢黃芩素（約100 g），經(jīng)純度檢查，主要為黃芩素，含量大于90%。

1.4 分組與建模將40只大鼠隨機分為正常組、模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組、烏司他丁組，每組8只。除正常組外，其余3組大鼠建立膿毒癥模型[7]：根據(jù)大鼠體質(zhì)量準備內(nèi)毒素（10 mg/kg），加生理鹽水溶解為10 mL，經(jīng)大鼠尾部靜脈注射（0.45 mL/kg）。建模后0.5 h，大鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動減少、毛色雜亂無光澤、呼吸稍促、喜飲水和解稀便等膿毒癥表現(xiàn)。將術(shù)后24 h作為時間觀察截點，結(jié)果顯示建模成功[9]。

1.5 干預(yù)方法黃芩素低、高劑量組大鼠分別給予黃芩素（生理鹽水溶解）100、200 mg·kg-1·d-1腹腔注射，烏司他丁組大鼠給予注射用烏司他?。ㄉ睇}水溶解）20萬U/kg腹腔注射，正常組大鼠腹腔注射等體積的生理鹽水，每日1次，共干預(yù)3 d。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 凝血分析儀檢測大鼠凝血指標 經(jīng)大鼠尾部取血2 mL，應(yīng)用凝血分析儀檢測血漿APTT、PT及FIB 水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6.2 ELISA法檢測大鼠血清TNF-α、IL-6水平 經(jīng)大鼠尾部取血2 mL，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6.3 流式細胞術(shù)檢測大鼠外周血T淋巴細胞亞群CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴細胞百分比和CD4+T細胞/CD8+T細胞（CD4+/CD8+）比值及輔助性T 淋巴細胞（Th）1/Th2 比值 取大鼠靜脈血2 mL，根據(jù)試劑盒操作說明書充分標記，采用流式細胞儀檢測T 淋巴細胞亞群，計數(shù)CD3+T、CD4+T、CD8+T 細胞的百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2比值。

1.6.4 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察大鼠肺部病理損傷情況 建模成功后將大鼠用戊巴比妥麻醉處死，取肺組織，常規(guī)脫水后，浸蠟，石蠟包埋，制備4 μm 切片，脫蠟，水合，透明封片，染色。光鏡下觀察肺泡、肺間質(zhì)水腫情況變化等。

1.6.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測大鼠肺組織Caspase-1、Caspase-11 蛋白表達水平 取大鼠肺組織，剪碎后加入裂解液，取上清液，通過蛋白定量分析，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，膜封閉，Caspase-1、Caspase-11 一抗（稀釋比例1∶1000）4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG 二抗（稀釋比例1∶4000）孵育2 h，顯色等步驟，應(yīng)用成像系統(tǒng)對電泳條帶的光密度進行分析。

1.7 統(tǒng)計方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)± 標準差（±s）表示，多組間比較行單因素方差分析或重復(fù)測量方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血漿APTT、PT、FIB水平比較表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血漿APTT、PT、FIB 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩素低、高劑量組和烏司他丁組血漿APTT、PT、FIB 水平均有所下降（P＜0.05）；黃芩素高劑量組與烏司他丁組各指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血漿APTT、PT、FIB水平比較Table 1 Comparison of plasma APTT，PT and FIB levels among various groups of rats （±s）

表1 各組大鼠血漿APTT、PT、FIB水平比較Table 1 Comparison of plasma APTT，PT and FIB levels among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與黃芩素低劑量組比較

組別正常組模型組黃芩素低劑量組黃芩素高劑量組烏司他丁組F值P值鼠數(shù)/只88888 APTT/s 14.25±2.9418.26±2.03①16.26±2.37①②15.02±1.56①②③15.65±2.18①②③3.621＜0.001 PT/s 11.21±0.7617.68±2.68①16.43±1.83①②15.31±1.16①②③15.36±1.94①②③14.560＜0.001 FIB/（g·L-1）2.12±1.613.59±2.65①2.46±1.66①②2.12±1.01①②③2.13±1.05①②③3.421＜0.05

2.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平比較表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩素低、高劑量組和烏司他丁組血清TNF-α、IL-6 水平均有所下降（P＜0.05）；而黃芩素高劑量組與烏司他丁組血清TNF-α、IL-6 水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較Table 2 Comparison of serum TNF-α and IL-6 levels among various groups of rats （±s，pg·mL-1）

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較Table 2 Comparison of serum TNF-α and IL-6 levels among various groups of rats （±s，pg·mL-1）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與黃芩素低劑量組比較

組別正常組模型組黃芩素低劑量組黃芩素高劑量組烏司他丁組F值P值鼠數(shù)/只88888 TNF-α 20.26±1.2142.35±2.34①35.26±2.45①②24.23±1.52①②③25.35±1.68①②③181.800＜0.001 IL-621.02±1.0267.56±2.35①43.57±3.22①②38.26±2.11①②③39.44±1.13①②③492.700＜0.001

2.3 各組大鼠外周血中CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2 比值比較表3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠外周血中CD3+T、CD4+T 淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2 比值降低（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩素低、高劑量組和烏司他丁組外周血中CD3+T、CD4+T 淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2 比值均有所升高（P＜0.05）；黃芩素高劑量組與烏司他丁組各指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組大鼠外周血CD8+T 淋巴細胞百分比比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠外周血中CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2比值比較Table 3 Comparison of CD3+T，CD4+T，CD8+T lymphocyte percentages and CD4+/CD8+ratio and Th1/Th2 ratio in peripheral blood among various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠外周血中CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2比值比較Table 3 Comparison of CD3+T，CD4+T，CD8+T lymphocyte percentages and CD4+/CD8+ratio and Th1/Th2 ratio in peripheral blood among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與黃芩素低劑量組比較

組別正常組模型組黃芩素低劑量組黃芩素高劑量組烏司他丁組F值P值鼠數(shù)/只88888 CD3+T淋巴細胞/%42.21±6.4938.65±5.43①43.46±3.21①②44.12±2.54①②③45.26±4.52①②③11.050＜0.001 CD4+T淋巴細胞/%25.32±1.8920.26±1.03①46.26±1.01①②40.05±1.04①②③40.35±0.98①②③758.500＜0.001 CD8+T淋巴細胞/%22.32±4.2121.65±2.7622.32±2.2322.31±1.9823.21±2.240.3140.866 CD4+/CD8+比值1.34±0.291.31±0.13①2.01±0.23①②1.65±0.16①②③1.68±0.21①②③14.700＜0.001 Th1/Th2比值0.579±0.0450.315±0.059①0.545±0.068①②0.622±0.053①②③0.631±0.037①②③46.940＜0.001

2.4 各組大鼠肺組織病理表現(xiàn)比較圖1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肺組織肺泡腔縮小，肺間質(zhì)水腫及肺實質(zhì)變小，伴有大量炎性細胞浸潤與出血；與模型組比較，黃芩素低劑量組肺組織病理損傷程度無明顯差異，黃芩素高劑量組和烏司他丁組肺組織損傷范圍較小，部分肺泡腔內(nèi)僅僅出現(xiàn)少量出血與炎性細胞浸潤，肺實變與肺間質(zhì)水腫較輕。

圖1 各組大鼠肺組織病理表現(xiàn)比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the histopathological manifestations of the lung tissue among various groups of rats（by HE staining，×200）

2.5 各組大鼠肺組織Caspase-1、Caspase-11蛋白表達水平比較表4、圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肺組織中Caspase-1、Caspase-11蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩素低、高劑量組和烏司他丁組Caspase-1、Caspase-11 蛋白表達水平均有所降低（P＜0.05），黃芩素高劑量組與烏司他丁組各指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠肺組織Caspase-1、Caspase-11的Western Blot電泳條帶圖Figure 2 Western Blot electrophoresis bands of Caspase-1 and Caspase-11 proteins in lung tissues in various groups of rats

表4 各組大鼠肺組織Caspase-1、Caspase-11蛋白表達水平比較Table 4 Comparison of protein expression levels of Caspase-1 and Caspase-11 in lung tissues among various groups of rats

3 討論

膿毒癥患者體內(nèi)存在炎性反應(yīng)狀態(tài)與免疫紊亂，兩者可相互影響[10]。膿毒癥是一種失控的、持久性炎癥反應(yīng)，是由感染因素誘發(fā)的全身性炎性反應(yīng)綜合征（SIRS）。臨床中與膿毒癥相關(guān)的研究眾多，而感染及其所導(dǎo)致的機體變化是臨床研究的重點[11]。IL-6 是公認的促炎因子，主要由單核-巨噬細胞、T淋巴細胞和纖維母細胞合成分泌，是急性相反應(yīng)的始發(fā)因子和主要物質(zhì)，也是促進肝臟合成急相蛋白的主要細胞因子[12]。TNF-α是具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子，在膿毒癥初期表達升高可以導(dǎo)致局部免疫炎癥反應(yīng)，并可隨著疾病發(fā)展升高誘導(dǎo)器官損傷[13]。T淋巴細胞亞群在一定程度上能夠反映機體的細胞免疫狀態(tài)。CD3+T 為T 淋巴細胞總數(shù)，CD4+T 及CD8+T 為其亞型。CD4+T 為輔助/誘導(dǎo)T 淋巴細胞（Th），且有輔助淋巴細胞產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)T淋巴細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)細胞等功能，CD8+T 為抑制/殺傷T 淋巴細胞（Ts），具有介導(dǎo)對病原體感染的自身細胞殺傷和溶解作用，此兩種細胞均為特異性細胞免疫的主要效應(yīng)細胞[14]。在正常情況下，CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴細胞和CD4+T/CD8+T值在正常范圍，CD4+T、CD8+T 淋巴細胞通常處于動態(tài)平衡及相互反饋調(diào)節(jié)狀態(tài)。CD3+T、CD4+T、CD8+T 淋巴細胞和CD4+/CD8+比值的改變代表機體免疫功能的改變[15]。膿毒癥患者可以出現(xiàn)免疫失衡，表現(xiàn)為CD3+T、CD4+T 淋巴細胞和CD4+/CD8+比值的下降，且其與疾病嚴重程度存在一定相關(guān)性。CD3+T、CD4+T 淋巴細胞和CD4+/CD8+比值可以作為膿毒癥治療過程中疾病嚴重程度的檢測指標[15]。Th1/Th2的平衡對維持正常免疫應(yīng)答起重要的作用。正常情況下，Th1/Th2處于相對平衡的狀態(tài)。探討膿毒癥患者Th1/Th2細胞失衡與疾病嚴重程度、肺損傷的關(guān)系顯示，Th1/Th2值的降低預(yù)示著疾病嚴重程度的加大，預(yù)后不良，同時膿毒癥合并肺損傷患者促炎Th1 細胞增高，Th1/Th2 平衡向Th1 方向漂移[16]。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)黃芩素干預(yù)后，膿毒癥大鼠血清升高的TNF-α、IL-6 水平均有所下降，降低的外周血CD3+T、CD4+T 淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2比值有所升高，黃芩素高劑量組各指標與烏司他丁組比較，差異不明顯。表明黃芩素可下調(diào)膿毒癥大鼠的炎性因子水平、改善免疫紊亂。

作為膿毒癥的核心機制，過于強烈的免疫反應(yīng)常常伴隨大量炎癥細胞因子的釋放，包括IL-6、TNF-α 等。對Caspase-11 介導(dǎo)的非經(jīng)典炎性體通路在膿毒癥中介導(dǎo)著多種炎癥介質(zhì)的釋放。細胞焦亡在膿毒癥過于強烈的免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用，被病原體入侵的細胞通過細胞焦亡釋放出大量促炎信號和病原體，并引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，關(guān)于細胞焦亡的研究揭示了Caspase 家族在其中所扮演的重要角色。細胞焦亡存在2種途徑，分別為依賴Caspase-11的非經(jīng)典途徑和依賴Caspase-1 的經(jīng)典途徑。其中，Caspase-11與細胞焦亡關(guān)系最為密切。Caspase-11被認為可調(diào)節(jié)細胞焦亡的發(fā)生，敲除Caspase-11 可以明顯改善膿毒癥小鼠的生存率[17]。膿毒癥可引起小鼠海馬神經(jīng)元損傷及Caspase-1 介導(dǎo)的焦亡的激活，抑制Caspase-1 介導(dǎo)的焦亡具有神經(jīng)元保護和認知保護作用[18]。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織Caspase-11、Caspase-1 蛋白表達水平較正常組下降，干預(yù)后，黃芩素低、高劑量組和烏司他丁組Caspase-11、Caspase-1 蛋白表達水平較模型組升高，黃芩素高劑量組各指標與烏司他丁組比較，差異無統(tǒng)計學意義。表明黃芩素可能通過抑制膿毒癥大鼠肺組織Caspase-11、Caspase-1 蛋白表達，抑制細胞焦亡，進而減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕膿毒癥器官損害。

凝血系統(tǒng)與炎癥反應(yīng)共同參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。膿毒癥患者多數(shù)具有凝血功能障礙，膿毒癥凝血功能障礙是一個動態(tài)連續(xù)的病理過程，其發(fā)病機制是由促凝機制上調(diào)、天然抗凝機制下調(diào)及纖溶系統(tǒng)受抑制共同驅(qū)動的，導(dǎo)致微循環(huán)障礙，以至發(fā)生多臟器功能的障礙[19]。膿毒癥嚴重時還會發(fā)生血栓形成和彌漫性出血的暴發(fā)性彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）。APTT、PT、FIB是能夠反映凝血功能的指標，APTT 主要反映機體內(nèi)源性凝血程度，PT 是反映凝血因子水平的外源性指標，并隨著膿毒癥疾病程度的升高而升高[20]。FIB 為干細胞合成及分泌的纖維蛋白，其表達水平升高可增加血栓發(fā)生的風險[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過黃芩素干預(yù)后，膿毒癥組大鼠APTT、PT、FIB 的水平均有所降低，其中，黃芩素高劑量組降低作用明顯，與烏司他丁組比較，差異無統(tǒng)計學意義，表明黃芩素能有效改善膿毒癥大鼠的凝血紊亂情況，阻斷凝血-炎癥間相互促發(fā)的惡性循環(huán)。

綜上所述，黃芩素可改善膿毒癥大鼠靶器官肺損傷，其機制可能與抑制肺組織Caspase-1、Caspase-11蛋白表達，抑制細胞焦亡，進而減輕炎癥反應(yīng)，并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及凝血功能有關(guān)。