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    “退熱六法”對(duì)不同月齡幼兔退熱效果及TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響

    2022-07-14 02:09:10劉志鳳于天源張英琦王厚融徐亞靜
    關(guān)鍵詞:肛溫下丘腦造模

    焦 誼,劉志鳳,于天源*,張英琦,劉 迪,2,王厚融,徐亞靜,官 乾

    (1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 102488;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院,北京 100078)

    發(fā)熱作為兒科常見(jiàn)的癥狀之一,發(fā)生率為25.7%,每人每年約0.8次[1]。長(zhǎng)期發(fā)熱或體溫過(guò)高則會(huì)損害機(jī)體調(diào)節(jié)功能,使病情惡化。小兒推拿退熱具有安全性和有效性[2],其中以開(kāi)天門[3]、推坎宮[3]、揉太陽(yáng)[3]、揉耳后高骨[4]、清天河水[5]、推脊[6]手法最為常用。但小兒推拿退熱的最適年齡、最適溫度、最適類型等標(biāo)準(zhǔn),研究不夠深入。故選取脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)模型模擬臨床細(xì)菌性發(fā)熱,選取不同月齡幼兔模擬不同年齡患兒,明確推拿退熱的最適年齡,并進(jìn)一步選取最適年齡幼兔探究推拿退熱的機(jī)理。

    視前區(qū)-下丘腦前部(POAH)是體溫調(diào)節(jié)的基本中樞,也是最重要的體溫調(diào)節(jié)中樞,LPS作為Toll樣受體4(TLR4)公認(rèn)的配體,能刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng),核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF-κB)參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、感染、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化及凋亡等[2],發(fā)熱過(guò)程以炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素IL-1β(interleukin-1β,IL-1β)最為重要,故以退熱六法為例,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。

    1 材料及方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

    清潔級(jí)1、3月齡新西蘭雄兔各16只,2月齡新西蘭雄兔24只,肛溫(39.00±0.50)℃,購(gòu)自北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心[合格證號(hào)為SCXK(京)2019-0006]。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,溫度(25±0.5)℃,相對(duì)濕度(65±5)%,12h/12h明暗周期,自由飲食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)3天,排除肛溫波動(dòng)大于0.4℃的新西蘭兔。隨機(jī)將1、3月齡幼兔分為模型組8只、推拿組8只,2月齡幼兔隨機(jī)分為正常組8只、模型組8只、推拿組8只。實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)批準(zhǔn),符合動(dòng)物福利與倫理原則。

    1.2 主要器材及試劑

    1.2.1 主要器材及儀器 MultiSkan3酶標(biāo)儀(美國(guó)THERMO公司);冷凍離心機(jī)(德國(guó)EPPENDORF公司);BL-420N(成都泰盟軟件有限公司);Bio Drop (Biochrom公 司);T100TM Thermal Cycler PCR儀、CFX ConnectTMReal-Time System定 量PCR儀、ChemiDoc MP成像儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。

    1.2.2 主要試劑 大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖(美國(guó)Sigma公司;批號(hào)055:B5 L2880);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、細(xì)胞核蛋白提取試劑盒、PMSF、RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司);TLR4抗體(批號(hào):bs-20594R)、NF-κB p65抗體(批號(hào):bs-0465R)、GAPDH抗體(批號(hào):bsm-0978M);HRP二抗(批號(hào):ZB-2301、ZB-2305);高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);HiPure Total RNA Micro Kit(批號(hào):R4114-02);RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(美國(guó)THERMO公司;批號(hào):K1622)。

    1.3 模型制備

    清醒狀態(tài)下,模型組和推拿組耳緣靜脈注射濃度為0.5 μg·mL-1LPS,注射量為1 mL·kg-1,注射后1h內(nèi)肛溫上升超過(guò)0.6℃為造模成功,正常組不予處理[3-4]。

    1.4 分組處理

    推拿組由推拿學(xué)科專業(yè)人員操作,且都為同一人干預(yù)。造模后1 h干預(yù)1次。1)開(kāi)天門。定位:兩眉骨內(nèi)側(cè)中點(diǎn)至神庭(前正中線,額頂骨縫交界處)[10],操作:用拇指自下而上交替直推200次,2 min[11];2)推坎宮。定位:睛明(內(nèi)眼角,上下眼瞼交界處)直上至絲竹空(眶上突外端)[10],操作:用兩拇指橈側(cè)自眉心向眉梢做分推200次,2 min[11];3)揉太陽(yáng)。定位:太陽(yáng)(外眼角后上方顳窩中)[10],操作:用兩拇指橈側(cè)推運(yùn)200次,2 min[11];4)揉耳后高骨。定位:寰椎翼前緣直上方凹陷處[10],操作:用兩拇指或中指端揉24次掐3下,2 min[11];5)清天河水。定位:腕橫紋至肘橫紋[10],操作:用食中指指面自腕推向肘,推500次,5 min[12]。6)推脊。定位:大椎(背中線上,第7頸椎與第1胸椎棘突間)至尾根[10],操作:用食中二指自上而下直推300次,作5 min[11]。正常組和模型組正常飼養(yǎng)。

    1.5 取材及指標(biāo)檢測(cè)

    1.5.1 肛溫監(jiān)測(cè) 采用BL-420N監(jiān)測(cè)肛溫變化。肛溫探頭涂上適量石蠟油,插入肛門固定為5 cm,待穩(wěn)定后讀數(shù),作為幼兔的肛溫,之后每隔20 min記錄1次肛溫,連續(xù)監(jiān)測(cè)6 h。

    1.5.2 ELISA檢測(cè)血漿、下丘腦TNF-α、IL-1β含量選取二月齡幼兔,于造模后3 h(即推拿后2 h)腹主動(dòng)脈取血5 mL,置于綠色真空采血管中,室內(nèi)保存20 min內(nèi)進(jìn)行離心,4℃ 3 000 r·m-1離心20 min,取上清置于EP管保存,按ELISA試劑盒方法測(cè)定血漿、下丘腦中TNF-α、IL-1β含量。

    1.5.3 Western Blot檢測(cè)下丘腦組織 TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá) 選取二月齡幼兔,于造模后3 h腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL·100 g-1),抽取腹主動(dòng)脈血后取出下丘腦組織約200 mg,將組織分成兩部分,一部分用于提取細(xì)胞核蛋白,另一部分提取細(xì)胞膜蛋白。BCA蛋白試劑盒進(jìn)行蛋白定量。配置10%分離膠和5%濃縮膠,上樣后穩(wěn)定電泳濃縮膠60V、分離膠80 V,冰上電轉(zhuǎn)100 V 70 min,10%脫脂奶粉封閉2 h,一抗(TLR4 1:2 000,NF-κB p65 1:2 000,GAPDH 1:2 000)室溫?fù)u床孵育1 h后4℃冰箱過(guò)夜,孵育二抗(羊抗兔IgG 1:10 000,羊抗小鼠 IgG 1:10 000),成像儀顯影,Image Lab圖像分析軟件分析目的條帶,定量分析各蛋白條帶灰度值。

    1.5.4 PCR檢測(cè)下丘腦組織TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)按 HiPure Total RNA Micro Kit試劑盒和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒操作步驟提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。GAPDH上游引物:ACTCTGGCAAAGT GGATGTTGTCG,下游引物:CCGTGGGTGG AATCATACTGGAAC;TLR4上游引物:GAGGAG GCTGTTGGTGGAAGTTG;下游引物:GCACACT GAATACTGACACGCTAATG,NF-κB上游引物:GCATCACAGCAGGCGAACTCTC;下游引物:TGCTTCTCGGCTACCACTGACTC,TNF-α上游引物:CGCCATGAGCACTGAGAGTATGATC; 下 游引物:CAGCCACGAGCAGGAAAGAGAAG;IL-1β上游引物:GGCAGGTCTTGTCAGTCGTTGTG,下游引物:GCAGAGGACGGGTTCTTCTTCAAAG。所有cDNA樣品擴(kuò)增,分別收集內(nèi)參GAPDH以及目的基因的Cq值,根據(jù)2-△△Cq公式計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    所有數(shù)據(jù)錄入SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布并且方差齊,以單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行組間比較,組間兩兩比較以LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 各月齡幼兔模型組肛溫基礎(chǔ)線比較

    見(jiàn)圖1、表1。

    圖1 各月齡模型組幼兔肛溫曲線圖(±s )(8只兔/組)

    表 1 各月齡模型組幼兔肛溫6 h變化表(±s,n = 8) ℃

    表 1 各月齡模型組幼兔肛溫6 h變化表(±s,n = 8) ℃

    注:與正常組比較,# P<0.05;與1月齡模型組比較,△P<0.05

    組別 造模前 造模后1 h 造模后2 h 造模后3 h 造模后4 h 造模后5 h 造模后6 h正常組 39.10±0.23 39.06±0.16 39.05±0.14 39.09±0.11 39.08±0.16 39.11±0.14 39.11±0.12 1 月齡模型組 39.14±0.33 40.05±0.12# 40.25±0.26# 40.48±0.37# 40.36±0.31# 39.86±0.45# 39.41±0.43 2月齡模型組 39.16±0.23 40.15±0.40# 40.43±0.50# 40.85±0.67# 40.85±0.56#△ 40.54±0.52#△ 39.98±0.49#△3月齡模型組 39.06±0.39 40.20±0.29# 40.35±0.29# 41.03±0.58#△ 40.93±0.57#△ 40.40±0.60#△ 39.89±0.39#△

    2.2 1月齡幼兔退熱情況

    見(jiàn)表2、圖2。

    圖2 1月齡幼兔肛溫變化曲線圖(±s )

    表 2 1月齡幼兔肛溫變化表(±s,n = 8) ℃

    表 2 1月齡幼兔肛溫變化表(±s,n = 8) ℃

    注:與正常組比較,# P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

    組別 造模前 造模后1 h 造模后2 h 造模后3 h 造模后4 h 造模后5 h 造模后6 h正常組 39.10±0.23 39.06±0.16 39.05±0.14 39.09±0.11 39.08±0.16 39.11±0.14 39.11±0.12模型組 39.14±0.33 40.05±0.12# 40.25±0.26# 40.48±0.37# 40.36±0.31# 39.86±0.45# 39.41±0.43推拿組 39.15±0.27 40.21±0.38# 39.23±0.54△ 39.97±0.66#△ 40.10±0.46# 39.60±0.29# 39.42±0.43

    2.3 2月齡幼兔退熱情況

    見(jiàn)表3、圖3。

    圖3 2月齡幼兔肛溫變化曲線圖(±s )

    表3 2月齡幼兔肛溫變化表(±s,n = 8) ℃

    表3 2月齡幼兔肛溫變化表(±s,n = 8) ℃

    注:與正常組比較,# P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

    組別 造模前 造模后1 h 造模后2 h 造模后3 h 造模后4 h 造模后5 h 造模后6 h正常組 39.10±0.23 39.06±0.16 39.05±0.14 39.09±0.11 39.08±0.16 39.11±0.14 39.11±0.12模型組 39.16±0.23 40.15±0.40# 40.43±0.50# 40.85±0.67# 40.85±0.56# 40.54±0.52# 39.98±0.49#推拿組 39.11±0.14 40.08±0.13# 39.54±0.49#△ 39.82±0.58#△ 40.14±0.59#△ 40.06±0.48#△ 39.87±0.42#

    2.4 3月齡幼兔退熱情況

    見(jiàn)表4、圖4。

    圖4 3月齡幼兔肛溫變化曲線圖(±s )

    表4 3月齡幼兔肛溫變化表(±s,n = 8) ℃

    表4 3月齡幼兔肛溫變化表(±s,n = 8) ℃

    注:與正常組比較,# P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

    組別 造模前 造模后1 h 造模后2 h 造模后3 h 造模后4 h 造模后5 h 造模后6 h正常組 39.10±0.23 39.06±0.16 39.05±0.14 39.09±0.11 39.08±0.16 39.11±0.14 39.11±0.12模型組 39.06±0.39 40.20±0.29# 40.35±0.29# 41.03±0.58# 40.93±0.57# 40.40±0.60# 39.89±0.39#推拿組 39.08±0.14 40.21±0.27# 39.69±0.81#△ 40.11±0.79#△ 40.36±0.58#△ 40.16±0.34# 39.94±0.28#

    2.5 3個(gè)不同月齡幼兔的退熱情況

    見(jiàn)表5。

    表5 3個(gè)不同月齡幼兔的退熱情況(±s,n= 8)

    表5 3個(gè)不同月齡幼兔的退熱情況(±s,n= 8)

    注:與1月齡比較,# P<0.05;與2月齡比較,△P<0.05

    不同月齡 造模1 h肛溫/℃ 推拿后最低肛溫/℃ 推拿降低肛溫最大幅度/℃ 推拿抑制發(fā)熱時(shí)程/min 1 月齡 40.21±0.38 38.88±0.58 1.33±0.5 57.50±29.15 2 月齡 40.08±0.13 39.28±0.54 0.80±0.51# 192.50±93.77#3 月齡 40.21±0.27 39.47±0.53# 0.74±0.43# 74.29±55.03△

    2.6 2月齡幼兔血漿和下丘腦中炎癥因子的表達(dá)情況

    見(jiàn)表6。

    表6 2月齡LPS致熱幼兔血漿和下丘腦中炎癥因子表達(dá)情況(±s,n = 8) ng·mL-1

    表6 2月齡LPS致熱幼兔血漿和下丘腦中炎癥因子表達(dá)情況(±s,n = 8) ng·mL-1

    注:與正常組比較,# P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

    組別 血漿下丘腦TNF-α IL-1β TNF-α IL-1β正常組 231.72±8.93 66.48±2.83 228.21±7.02 50.13±3.42模型組 268.00±15.57# 71.50±2.89# 256.13±12.35# 56.38±1.27#推拿組 242.17±6.30△ 66.87±1.83△ 233.24±6.95△ 51.21±2.30△

    2.7 2月齡幼兔下丘腦中TLR4/NF-κB p65 蛋白含量表達(dá)情況

    見(jiàn)圖5、表7。

    表7 2月齡LPS致熱幼兔下丘腦TLR4/NF-κB p65含量表達(dá)情況(±s,n= 8)

    表7 2月齡LPS致熱幼兔下丘腦TLR4/NF-κB p65含量表達(dá)情況(±s,n= 8)

    注:與正常組比較,# P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

    組別 相對(duì)灰度值TLR4/GAPDH 細(xì)胞核 NF-κB p65/GAPDH正常組 0.25±0.12 0.15±0.07模型組 0.47±0.08# 0.88±0.45#推拿組 0.34±0.13△ 0.29±0.20△

    圖5 2月齡LPS致熱幼兔下丘腦TLR4/NF-κB p65條帶圖

    2.8 2月齡幼兔下丘腦中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)情況

    造模后3 h,模型組下丘腦中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA高于正常組(P<0.05);推拿組下丘腦中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

    圖6 各組2月齡下丘腦相關(guān)mRNA表達(dá)情況

    3 討論

    3.1 “退熱六法”對(duì)不同月齡幼兔的退熱效果

    實(shí)驗(yàn)選取1月、2月、3月齡幼兔模擬臨床發(fā)熱易感的3個(gè)年齡段[13-14],即嬰兒期(28天~1歲)、幼兒期(1歲~3歲)、學(xué)齡前期(3歲~6歲),從而初步得出小兒推拿退熱的最適年齡。

    研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),“退熱六法”干預(yù)1月齡幼兔降溫幅度最大,2月齡次之;“退熱六法”干預(yù)2月齡幼兔降溫最穩(wěn)定,3月齡次之。所以,臨床上年齡越小的退熱效果可能短時(shí)間內(nèi)較好,長(zhǎng)時(shí)間可能會(huì)出現(xiàn)體溫反復(fù),可增加治療次數(shù),對(duì)于年齡較大的患兒,降溫效果比較穩(wěn)定,短期降溫效果雖不如1月齡,但體溫波動(dòng)較小,從整個(gè)退熱過(guò)程來(lái)看,推拿都起到了正向調(diào)節(jié)作用。根據(jù)結(jié)果顯示,選取2月齡幼兔作為后續(xù)研究退熱機(jī)制的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

    3.2 “退熱六法”對(duì)LPS致熱幼兔可能的退熱機(jī)制

    臨床上推拿退熱效果顯著,推拿能下調(diào)發(fā)熱患兒外周血清TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子水平[15]。因此,本研究探討了推拿對(duì)炎癥性發(fā)熱的影響,結(jié)果提示推拿能明顯抑制發(fā)熱體溫,抑制炎癥反應(yīng),可能是通過(guò)TLR4/NF-κB p65信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

    根據(jù)研究發(fā)現(xiàn),耳緣靜脈注射0.5 μg·kg-1的LPS,造模后1 h肛溫明顯升高,造模后3 h肛溫達(dá)最高峰,與基礎(chǔ)肛溫相比,約上升1.3~2.0℃,隨后肛溫逐漸下降,持續(xù)約6 h,與研究[9]相符。選取“退熱六法”作為干預(yù)方式,其中頭面四大手法屬于“和法”,可調(diào)節(jié)陰陽(yáng),天人相應(yīng),天河水倍受歷代醫(yī)者的推崇,均認(rèn)為清天河水是“清法”的重要代表,在各種熱證下均可施用,脊椎占督脈近三分之二的循行部位,推脊對(duì)督脈氣機(jī)有調(diào)節(jié)作用。

    發(fā)熱是體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)紊亂的表現(xiàn),是反應(yīng)炎癥性疾病的重要標(biāo)志,TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與了慢性和急性炎癥反應(yīng)[16],其中TLR4/NF-κB信號(hào)通路是引起發(fā)熱的重要傳導(dǎo)途徑[17]。炎性細(xì)胞因子能影響免疫反應(yīng),并對(duì)各種組織或器官造成損傷[18],TNF-α、IL-1β參與調(diào)節(jié)早期免疫反應(yīng)[19],是發(fā)熱的關(guān)鍵介質(zhì)。有研究[20]表明注射TNF-α血清抗體只能影響發(fā)熱的早期階段,這與推拿后能即刻降低體溫相似。脂多糖是一種典型內(nèi)毒素,作為配體可以激活細(xì)胞膜上的TLR4,通過(guò)一系列反應(yīng)誘導(dǎo)NF-κB p65入核,啟動(dòng)下游炎癥反應(yīng),上調(diào)促炎細(xì)胞因子。

    綜上所述,“退熱六法”能下調(diào)外周血中炎癥因子的表達(dá),同時(shí)下調(diào)中樞中TLR4的表達(dá),以及細(xì)胞核NF-κB p65的表達(dá)。說(shuō)明推拿可能是通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路起到抗炎解熱作用。

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