湖北省葡萄主產(chǎn)區(qū)灰葡萄孢菌多樣性分析

王澤瓊 劉勇 王榕馨 姜婷 龔林忠 孫中海 呂亮

摘要：【目的】了解湖北省葡萄主產(chǎn)區(qū)灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）多樣性，為葡萄灰霉病防治提供科學(xué)依據(jù)。【方法】采用常規(guī)微生物分離法對(duì)從湖北省8個(gè)葡萄主產(chǎn)區(qū)采集的葡萄灰霉病樣本進(jìn)行灰葡萄孢菌分離，在PDA培養(yǎng)基上觀察分離物菌落培養(yǎng)形態(tài)并測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速率;利用特異引物對(duì)各分離物的Flipper和Boty轉(zhuǎn)座子片段進(jìn)行擴(kuò)增，區(qū)分轉(zhuǎn)座子類型;擴(kuò)增Bc-hch基因并用Hha I酶切檢測(cè)分離物的多態(tài)性以區(qū)分組群;依據(jù)菌絲生長(zhǎng)速率、菌落形態(tài)及轉(zhuǎn)座子類型挑選4株典型分離物在4個(gè)葡萄品種果實(shí)上進(jìn)行致病力測(cè)定。【結(jié)果】從病害樣本中共分離獲得51株分離物，菌落培養(yǎng)形態(tài)表明30株分離物為菌核型，20株為孢子型，僅1株為菌絲型，出現(xiàn)頻率分別為58.82%、39.22%和1.96%。所有分離物菌絲生長(zhǎng)速率均較高，在10.86～13.94 mm/d。分離物只存在2種轉(zhuǎn)座子類型，其中50株為Transposa型，僅1株為Flipper型。Bc-hch基因Hha I酶切多態(tài)性鑒定結(jié)果表明，所有菌株均為Group II，為狹義的灰葡萄孢菌。分離物致病力測(cè)定結(jié)果表明，菌絲生長(zhǎng)速率最低的WH3在供試葡萄品種上的致病力均最強(qiáng)，其次是Flipper型分離物SX1，菌絲生長(zhǎng)速率最高的XN2和菌絲型WH6分離物致病力均較弱，且不同分離物在不同品種上致病力趨勢(shì)不同?！窘Y(jié)論】湖北省葡萄主產(chǎn)區(qū)灰葡萄孢菌菌落培養(yǎng)形態(tài)較豐富，所有分離物均為狹義灰葡萄孢菌，只存在Transposa和Flipper 2種轉(zhuǎn)座子類型，前者占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，典型分離物間致病力差異明顯。

關(guān)鍵詞： 葡萄;灰霉病;灰葡萄孢菌;多樣性;致病力;湖北

中圖分類號(hào)： S436.631.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）04-1049-08

Diversity of Botrytis cinerea in major grape production

regions of Hubei Province

WANG Ze-qiong1， LIU Yong1， WANG Rong-xin2， JIANG Ting2， GONG Lin-zhong1*，

SUN Zhong-hai1*， LYU Liang3

（1Institute of Fruit Tree and Tea， Hubei Academy of Agricultural Science， Wuhan， Hubei? 430064， China; 2 Wuhan Institute of Bioengineering， Wuhan， Hubei? 430415， China; 3Key Laboratory of Integrated Pest Management on

Crops in Central China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， R. P. China/Hubei Key Laboratory

of Crop Diseases， Insect Pests and Weeds Control，Wuhan， Hubei? 430064， China）

Abstract：【Objective】To assess the diversity of Botrytis cinerea in major grape production regions of Hubei Provin-ce， so as to provide scientific support for grape gray mold control. 【Method】Isolates of B. cinerea from 8 main grape production regions in Hubei Province were isolated by conventional microbial separation method. All the isolates were cultured on PDA medium to observe the morphological characteristics and measure the mycelium growth rates. Transposon segments Flipper and Boty were amplified using specific primers to detect the transposon types. Bc-hch gene was amplified and detected by Hha I digestion to identify the group. Four representative isolates were used for pathogenicity analysis by inoculating on fruits of 4 grape varieties. 【Result】Totally， 51 isolate were obtained. Results of the morphological analysis showed that：Among them， 30 isolates were the sclerotia type with the frequency of 58.82%， which was the most prevalent type; twenty isolates were the conidial type with the frequency of 39.22%; only 1 isolate was the mycelium type with the frequency of 1.96%. Mycelium growth rates of all isolates were high and ranged from 10.86 mm/d to 13.94 mm/d. Only two transposon types were found in isolates： 50 were Transposa and only 1 was Flipper. All the isolates were classified into group II according to the restriction polymorphism analysis of enzyme Hha I of Bc-hch gene. Pathogencity analysis revealed that， isolate WH3 which had the lowest mycelium growth rate had the strongest pathogenicity. SX1， the only Flipper type isolate， had the second strongest pathogenicity. Pathogenicity of XN2 which had the highest growth rate and WH6 which was the only mycelium type were weaker. Pathogenicity regulations of isolates on different varieties were different. 【Conclusion】Morphological characteristics of B. cinerea in the major grape production regions of Hubei Provin-ce is abundant. All the isolates are identified as B.cinerea in a narrow sense. There are two genotypes of transposable elements：Transposa and Flipper types. The Transposa type is predominant. The differentiation of pathogenicity is obvious between representative isolates.

Key words： grape; gray mold disease; Botrytis cinerea; diversity; pathogenicity; Hubei

Foundation items：National Modern Agricultural Industry Technology System Construction Project （CARS-29-19）; Hubei Technology Innovation Major Project （2019ABA093）; Open Fund of Key Laboratory of Comprehensive Pest Mana-gement of Crops in Central China of Ministry of Agriculture and Rural Affairs （2018ZTSJJ9）

0 引言

【研究意義】灰葡萄孢菌（Botrytic cinerea）引起的灰霉病是湖北省葡萄生產(chǎn)上的一種重要病害，主要危害葡萄花序和果實(shí)，導(dǎo)致落花落果，每年因此造成的損失在20%～40%。灰葡萄孢菌寄主范圍廣，能侵染1000多種植物（Veloso and van Kan，2018），其遺傳變異大，在表型及分子水平上均表現(xiàn)出豐富的多樣性，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，易發(fā)生變異或產(chǎn)生抗藥性（鄭媛萍，2018;Saito et al.，2019;賈爽爽，2020;孔瓊等，2020;DeLong et al.，2020）。湖北省屬亞熱帶季風(fēng)氣候，葡萄生長(zhǎng)季降水量充沛，高濕的氣候條件極易造成葡萄灰霉病流行。因此，針對(duì)湖北葡萄主產(chǎn)區(qū)灰葡萄孢菌開(kāi)展多樣性研究，對(duì)掌握本產(chǎn)區(qū)葡萄上灰葡萄孢菌發(fā)生規(guī)律，并據(jù)此制定綜合防控方案具有重要指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】灰葡萄孢菌表型多樣性豐富，其菌落培養(yǎng)形態(tài)一般可劃分為菌絲型（M）、菌核型（S）和孢子型（C）（張靜，2010）;也可分為菌絲型和菌核型兩大類，再分別細(xì)分為M1～M4亞表型和S1～S5亞表型（Mirzaei et al.，2010;Kuzmanovska et al.，2012）共9種表型。灰葡萄孢菌在分子水平上也表現(xiàn)出較強(qiáng)的遺傳變異。在系統(tǒng)發(fā)育水平上，灰葡萄孢菌包含2個(gè)群（Fournier et al.，2003），Group I為假灰葡萄孢（B. pseudocinerea），Group II是狹義的灰葡萄孢（B. cinerea）（Walker et al.，2011），2個(gè)群可根據(jù)粗糙脈孢菌het-c營(yíng)養(yǎng)體不親和位點(diǎn)同源基因Bc-hch位點(diǎn)的Hha I酶切多態(tài)性來(lái)劃分;Group II分布更普遍，侵染力更強(qiáng)（Johnston et al.，2014;Mu?oz et al.，2016）。真菌轉(zhuǎn)座子是一類跳躍性元件，因其在真核基因組中的分布、插入位置及拷貝數(shù)的不同會(huì)導(dǎo)致菌株間或群體內(nèi)出現(xiàn)遺傳多樣性從而更好地適應(yīng)環(huán)境?；移咸焰呔幸褕?bào)道2個(gè)轉(zhuǎn)座子Boty（Diolez et al.，1995）和Flipper（Levis et al.，1997），根據(jù)轉(zhuǎn)座子存在特點(diǎn)可劃分為4種類型：同時(shí)含有2種轉(zhuǎn)座子的Transposa型、僅含有Flipper的Flipper型、僅含有Boty的Boty型和不含這2種轉(zhuǎn)座子的Vacuma型。研究認(rèn)為轉(zhuǎn)座子類型與病原菌致病力及樣品采集時(shí)期具有一定相關(guān)性（Mu?oz and Campos，2013;Johnston et al.，2014;Kumari et al.，2014），且一般認(rèn)為Transposa型分離物致病力及抗藥性較強(qiáng)（Martinez et al.，2003;Mu?oz and Campos，2013;Johnston et al.，2016）。大部分灰葡萄孢菌分離菌株為異宗配合，被2個(gè)單獨(dú)的交配型基因 MAT1-1和MAT1-2所控制，當(dāng)2種交配型基因在種群中以1∶1存在時(shí)，病原菌有性重組概率提高，有利于增強(qiáng)真菌的生活力和適應(yīng)性（喬廣行等，2015;Pei et al.，2019;周默等，2020），以此可評(píng)估灰葡萄孢群體的變異潛力。此外，SSR分析（王帆帆等，2020;DeLong et al.，2020;Diao et al.，2020），3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（G3PDH）、熱激蛋白60基因（HSP60）和依賴DNA的RNA聚合酶亞基II基因（RPB2）等基因序列的同源進(jìn)化分析（張靜，2010;Mu?oz et al.，2016），多位點(diǎn)測(cè)序分型（Plesken et al.，2021）等也有報(bào)道應(yīng)用于遺傳多樣性分析?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】湖北省葡萄上灰霉病發(fā)生較普遍，而其病原灰葡萄孢菌多樣性及群體研究尚未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用常規(guī)微生物分離法對(duì)從湖北省8個(gè)葡萄主產(chǎn)區(qū)采集的葡萄灰霉病樣本進(jìn)行灰葡萄孢菌分離，通過(guò)對(duì)灰葡萄孢菌菌落培養(yǎng)形態(tài)觀察及菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定、轉(zhuǎn)座子類型檢測(cè)、Bc-hch基因的Hha I酶切多態(tài)性分析及典型菌株的致病力測(cè)定，了解湖北省葡萄主產(chǎn)區(qū)灰葡萄孢菌的多樣性，為科學(xué)防治葡萄灰霉病打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

2017—2018年，從湖北省不同葡萄產(chǎn)區(qū)采集病害樣本，樣本信息見(jiàn)表1。

1. 2 病原菌分離

采用常規(guī)微生物分離方法對(duì)病原菌進(jìn)行分離純化，每株葡萄保留1個(gè)單孢分離物，保存于-80 ℃冰箱。

1. 3 菌落形態(tài)觀察

將保存菌株接種到新鮮PDA培養(yǎng)基上活化3 d，用直徑5 mm的滅菌打孔器沿菌落邊緣打取菌餅，接種到PDA培養(yǎng)基上，每株菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，20 ℃恒溫暗培養(yǎng)，15 d后觀察培養(yǎng)形態(tài)。以培養(yǎng)24～48 h的菌落半徑增長(zhǎng)量為菌絲生長(zhǎng)速率，菌絲生長(zhǎng)速率（mm/d）=（48 h菌落直徑-24 h菌落直徑）/2。

1. 4 DNA提取

將活化后的菌株接種至鋪有滅菌玻璃紙的PDA培養(yǎng)基中20 ℃下倒置培養(yǎng)，3 d后刮取菌絲，參照DNA提取試劑盒（杭州新景生物試劑開(kāi)發(fā)有限公司）操作說(shuō)明提取病原菌總DNA。取1 μL DNA樣品用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)進(jìn)行濃度檢測(cè)，樣品稀釋至濃度為50 ng/μL備用。

1. 5 灰葡萄孢菌轉(zhuǎn)座子檢測(cè)

Flipper轉(zhuǎn)座子檢測(cè)引物為Flipper-F（5'-GCAC AAAACCTACAGAAGA-3'）/Flipper-R（5'-ATTCGT TTCTTGGACTGTA-3'） （Levis et al.，1997）;Boty轉(zhuǎn)座子檢測(cè)引物為Boty-F（5'-TTAGCCAAGGGATGG ATCAG-3'）/Boty-R（5'-TTCGAGCACTGCCTTAAC CT-3'）（Johnston et al.，2014）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：2×PCR Mix（Coolaber，北京）12.5 μL，DNA 模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，滅菌去離子水補(bǔ)足至25.0 μL。2種轉(zhuǎn)座子PCR擴(kuò)增程序均為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1. 6 Bc-hch基因序列擴(kuò)增及酶切

Bc-hch基因擴(kuò)增引物為Bc-hch-F（5'-AAGCCC TTCGATGTCTTGGA-3'）/Bc-hch-R（5'-ACGGATTC CGAACTAAGTAA-3'）（Fournier et al.，2003）。PCR反應(yīng)體系同1.5。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增得到的基因片段用Hha I（TaKaRa，大連）酶切。酶切反應(yīng)體系20.0 μL：PCR 產(chǎn)物8.0 μL，Hha I 1.0 μL，10×Buffer 2.0 μL，滅菌去離子水補(bǔ)足至20.0 μL。37 ℃酶切4 h，產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1. 7 致病力測(cè)定

結(jié)合菌落形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)速率及轉(zhuǎn)座子類型，挑選4株典型分離物進(jìn)行致病力測(cè)定。將新鮮采摘近成熟期的陽(yáng)光玫瑰、夏黑、甬優(yōu)和紅地球葡萄健康果粒剪下，清水洗凈后用75%乙醇表面消毒30 s，無(wú)菌水清洗3次，自然晾干。沿菌絲邊緣打取直徑5 mm的菌餅接種于葡萄果實(shí)上，菌絲面朝下，每個(gè)果實(shí)接種1塊，以PDA培養(yǎng)基塊為對(duì)照，重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)3個(gè)果實(shí)。將接種后的果實(shí)置于無(wú)菌吸水紙上保濕，20 ℃培養(yǎng)4 d后十字交叉法測(cè)量病斑直徑并計(jì)算病斑面積。

2 結(jié)果與分析

2. 1 灰葡萄孢菌不同分離物培養(yǎng)形態(tài)特征

采用常規(guī)微生物分離法從病害樣本中共分離獲得51株分離物。分離物在PDA上培養(yǎng)15 d后，菌落培養(yǎng)形態(tài)可明顯分為3種類型，其中菌核型30株，有大、小粒2種形態(tài)，菌絲短，產(chǎn)生黑色菌核，環(huán)狀生長(zhǎng)，外周均有少量分生孢子產(chǎn)生;孢子型20株，菌絲生長(zhǎng)較菌核型豐富，分生孢子由外緣向中間生長(zhǎng)，培養(yǎng)21 d鋪滿整個(gè)培養(yǎng)基表面，沒(méi)有菌核產(chǎn)生;菌絲型僅1株，為WH6，菌絲生長(zhǎng)濃密蓬松，產(chǎn)生少量分生孢子，沒(méi)有菌核產(chǎn)生（圖1）。菌核型出現(xiàn)頻率為58.82%，孢子型為39.22%，菌絲型僅為1.96%;8個(gè)采集地中，只有仙桃的3株分離物形態(tài)均為孢子型，其余地區(qū)的分離物菌核型和孢子型均有出現(xiàn);分離物菌絲生長(zhǎng)速率在10.86～13.94 mm/d，其中生長(zhǎng)最慢的為WH3，最快的為XN2（表1）。

2. 2 灰葡萄孢菌不同分離物的轉(zhuǎn)座子分類

用Boty和Flipper 2種轉(zhuǎn)座子的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖2）表明，51株分離物中只含有2種轉(zhuǎn)座子類型，除分離物SX1為Flipper型外，其余均為Transposa型，未發(fā)現(xiàn)Boty和Vacuma型分離物（表1）。

2. 3 Bc-hch基因酶切多態(tài)性分析結(jié)果

51個(gè)灰葡萄孢菌分離物Bc-hch基因位點(diǎn)擴(kuò)增后均能得到1171 bp大小的目標(biāo)片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)Hha I酶切后均出現(xiàn)6條帶，最大片段為517 bp（圖3）。參照Fournier等（2003）結(jié)果，本研究中所有分離物均屬于Group II，是狹義的灰葡萄孢菌。

2. 4 不同分離物對(duì)不同葡萄品種果實(shí)的致病力分析結(jié)果

挑選編號(hào)為WH6、WH3、SX1和XN2菌株進(jìn)行致病力測(cè)定，其中SX1是唯一的轉(zhuǎn)座子類型為Flipper的分離物，WH6是唯一的菌絲型分離物，XN2的生長(zhǎng)速率最快，WH3最慢，分離物生長(zhǎng)速率表現(xiàn)為WH3<WH6<SX1<XN2。由表2可知，4株分離物在4個(gè)品種葡萄果實(shí)上均能侵染造成病斑并產(chǎn)生分生孢子。在葡萄果實(shí)上致病力分化較大，病斑面積36.70～465.33 mm2，其中，WH3的致病力最強(qiáng)，病斑面積為235.43～465.33 mm2，顯著高于其他分離物（P<0.05，下同），SX1次之，WH6和XN2的致病力均較弱，在甬優(yōu)葡萄上表現(xiàn)最明顯。

從分離物特性與致病力的關(guān)系來(lái)看，4株分離物中，只有SX1轉(zhuǎn)座子類型為Flipper，在陽(yáng)光玫瑰上致病力與XN2和WH6相當(dāng)，在夏黑上的致病力與XN2相當(dāng)，在紅地球和甬優(yōu)上的致病力顯著強(qiáng)于XN2和WH6，致病力較強(qiáng)。但由于得到的Flipper型分離物僅SX1一株，無(wú)法評(píng)估轉(zhuǎn)座子類型與致病力間的關(guān)系。WH6是唯一的菌絲型分離物，其致病力與XN2相當(dāng)，僅在夏黑上顯著弱于XN2。WH3菌絲生長(zhǎng)最慢，但致病力顯著強(qiáng)于其他分離物;XN2菌絲生長(zhǎng)最快，但致病力與生長(zhǎng)速率較慢的WH6相當(dāng)。

同一分離物在不同葡萄品種上的致病力趨勢(shì)存在一定差異，如4個(gè)分離物在甬優(yōu)和紅地球上的致病力趨勢(shì)相同，均為WH3最強(qiáng)，其余依次為SX1、WH6和XN2;在陽(yáng)光玫瑰上WH3最強(qiáng)，在其余品種上的致病力相當(dāng);在夏黑上WH3的致病力最強(qiáng)，SX1和XN2次之，WH6最弱。

3 討論

灰葡萄孢菌具有豐富的表型多樣性，一般可分為菌核型、孢子型和菌絲型3種，也可分為菌核型和菌絲型2種，在此基礎(chǔ)上再細(xì)分為9種表型。無(wú)論以哪種分類方法，其分離物大多以菌核型為主（Martinez et al.，2003;Kumari et al.，2014;張艷杰等，2017;Pei et al.，2019;周默等，2020）。本研究51株分離物中菌核型占58.82%，為主要類型，其中又有大、小菌核2種表型，形態(tài)較豐富。張艷杰等（2017）將菌絲生長(zhǎng)速率在9.28～12.91 mm/d的分離物聚類為高等級(jí)，本研究中分離物菌絲生長(zhǎng)速率在10.86～13.94 mm/d，有不少分離物超過(guò)12.91 mm/d，表明所得到的分離物生長(zhǎng)速率快?；移咸焰呔儺惪欤硇筒环€(wěn)定，因此還需從分子水平上對(duì)其多樣性進(jìn)行評(píng)估。

在分子水平上灰葡萄孢菌遺傳多樣性受有性重組、繁殖及轉(zhuǎn)座子等的影響。對(duì)來(lái)源于不同地區(qū)及寄主的分離物研究表明，灰葡萄孢菌轉(zhuǎn)座子類型大多以Transposa為主（張靜，2010;張佳等，2016;Wahab，2015;Pei et al.，2019;DeLong et al.，2020），該特點(diǎn)在灰葡萄孢菌葡萄分離物中表現(xiàn)明顯（Martinez et al.，2005;Kretschmer and Hahn，2008;Esterio et al.，2011;Samuel et al.，2012;Zhang et al.，2018），甚至可達(dá)100%（Mu?oz et al.，2010）。本研究中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子類型只有Transposa和Flipper 2種，前者占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，后者僅有1株。研究認(rèn)為灰葡萄孢菌葡萄分離物轉(zhuǎn)座子類型及出現(xiàn)頻率可能與采樣時(shí)期及植株是否顯癥相關(guān)，相比在葡萄花期采樣，結(jié)果期分離物中Transposa型出現(xiàn)頻率明顯上升，其他類型頻率明顯下降，花期Vacuma型出現(xiàn)頻率較其他時(shí)期高（Martinez et al.，2003，2005;Johnston et al.，2016）。無(wú)癥狀植株中分離物多樣性更豐富（Johnston et al.，2014，2016）。轉(zhuǎn)座子出現(xiàn)頻率還與藥劑施用相關(guān)，不同類型轉(zhuǎn)座子分離物表現(xiàn)出對(duì)不同藥劑的抗性，Transposa型分離物抗藥性更廣泛（Esterio et al.，2011）。同時(shí)，轉(zhuǎn)座子類型與地理位置、寄主（Zhang et al.，2018;Pei et al.，2019）及氣候（Zhang et al.，2018）等均存在相關(guān)性?；移咸焰呔咸逊蛛x物中Vacuma型主要分布于我國(guó)北方，但分離頻率也不高（Zhang et al.，2018）。Boty型和Flipper型轉(zhuǎn)座子分離物分別具有地域和寄主專一性（Kumari et al.，2014）。本研究中灰葡萄孢菌分離物的轉(zhuǎn)座子只有Transposa和Flipper 2種，類型單一，可能與分離物均來(lái)自湖北省內(nèi)，地域相近、氣候條件相似、施藥和管理措施較相似及菌株產(chǎn)生抗藥性（鄭媛萍，2018）等因素有關(guān)。此外，本研究樣品均采自灰霉病顯癥材料，可能影響了其多樣性表現(xiàn)。Transposa型占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明湖北省的灰葡萄孢菌可能具有較廣的抗藥性，后期應(yīng)注意其抗藥性監(jiān)控及藥劑篩選。

來(lái)源于不同寄主的灰葡萄孢菌分離物研究表明，Group I出現(xiàn)頻率低，Group II更為普遍，侵染力更強(qiáng)（Johnston et al.，2014;Mu?oz et al.，2016），在葡萄分離物中也是如此（Esterio et al.，2011;Zhang et al.，2018）。來(lái)源于湖北省8個(gè)葡萄主產(chǎn)區(qū)的灰葡萄孢菌分離物只檢測(cè)到Group II，表明所有分離物均為狹義的灰葡萄孢菌，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)假灰葡萄孢分離物。但湖北省番茄上已有假灰葡萄孢分離物的報(bào)道（Li et al.，2015），葡萄上是否存在假灰葡萄孢菌還需進(jìn)一步收集樣品，增加采樣地區(qū)及次數(shù)以驗(yàn)證。

本研究選取的4株典型分離物在葡萄果實(shí)上致病力分化明顯。大部分研究認(rèn)為Transposa型轉(zhuǎn)座子分離物致病力更強(qiáng)（Martinez et al.，2003;張靜，2010;Mu?oz and Campos，2013;Johnston et al.，2016;周默等，2020），也有Boty型分離物致病力最強(qiáng)的報(bào)道（張佳等，2016）。WH3是Transposa型轉(zhuǎn)座子分離物，致病力最強(qiáng)，而Flipper型轉(zhuǎn)座子分離物SX1致病力并不弱于另2個(gè)Transposa型轉(zhuǎn)座子分離物。受Flipper型分離物樣本量限制，無(wú)法評(píng)估湖北省葡萄上灰葡萄孢菌轉(zhuǎn)座子類型與致病力間的關(guān)系。此外，致病力測(cè)定結(jié)果與選用品種有關(guān)，同一分離物在不同葡萄品種上致病力趨勢(shì)不完全一致，因此有必要選取不同品種或篩選對(duì)不同分離物致病力趨勢(shì)相近的品種進(jìn)行測(cè)定。

4 結(jié)論

湖北省葡萄主產(chǎn)區(qū)灰葡萄孢菌菌落培養(yǎng)形態(tài)較豐富，以菌核型為主。所有分離物均為狹義灰葡萄孢菌，暫未發(fā)現(xiàn)假灰葡萄孢分離物。分離物只具有Transposa和Flipper 2種轉(zhuǎn)座子類型，前者占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而Transposa型是抗藥性和致病力最強(qiáng)的類型，生產(chǎn)中應(yīng)加強(qiáng)病害防治并監(jiān)測(cè)抗藥性變化。典型分離物致病力分化明顯，在不同品種上不同分離物致病力趨勢(shì)存在差異。

參考文獻(xiàn)：

賈爽爽. 2020. 我國(guó)葡萄灰霉菌對(duì)主要?dú)⒕鷦┑目顾幫蛔冃头植寂c多藥抗性機(jī)制研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院. [Jia S S. 2020. Study on the distribution of resistant mutation to main fungicides and the mechanism of multi-drug resistance of Botrytis cinerea in China[D]. Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences.] doi：10.27630/ d.cnki.gznky.2020.000891.

孔瓊，袁盛勇，李珣，薛春麗，李林倩，余朝陽(yáng)，楊紅玉. 2020. 灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素的致病性研究[J].? 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，49（4）：72-77. [Kong Q，Yuan S Y，Li X，Xue C L，Li L Q，Yu C Y，Yang H Y. 2020. Study on pathogenicity of protein toxin secreted from Botrytics cinerea[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，49（4）：72-77.] doi：10. 15933/j.cnki.1004-3268.2020.04.010.

喬廣行，李興紅，黃金寶，林秀敏，周瑩. 2015. 灰葡萄孢交配型基因的分析與檢測(cè)[J]. 菌物學(xué)報(bào)，34（1）： 108-116. [Qiao G H，Li X H，Huang J B，Lin X M， Zhou Y. 2015. Analysis and molecular detection of Botrytis cinerea ma-

ting type genes[J]. Mycosystema，34（1）：108-116.] doi：

10.13346/j.mycosystema.130210.

王帆帆，曾佳，郭杰，唐其， 郭曉亮， 段媛媛，游景茂. 2020. 華重樓灰霉病菌灰葡萄孢 ITS 分型及 SSR 遺傳多樣性分析[J]. 菌物學(xué)報(bào)，40（2）：1-13. [Wang F F，Zeng J， Guo J，Tang Q，Guo X L，Duan Y Y，You J M. 2020. ITS and SSR-PCR analyses reveal the genetic diversity of Botrytis cinerea strains collected from Paris polyphylla var. chinensis[J]. Mycosystema，40（2）：1-13.] doi：10.13346/j.mycosystema.200234.

張靜. 2010. 湖北省灰霉病病菌區(qū)系和灰葡萄孢菌多樣性研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué). [Zhang J. 2010. Studies on taxonomy of Botrytis species in Hubei Province and diversity of B. cinerea[D]. Wuhan：Huazhong Agricultural University.]

張佳，張曉歌，張璨，張國(guó)珍. 2016. 北京地區(qū)草莓灰葡萄孢菌的轉(zhuǎn)座子及其分布頻率[J]. 植物保護(hù)，42（2）：177-181. [Zhang J，Zhang X G，Zhang C，Zhang G Z. 2016. Presen-ce and frequency distribution of Transposable elements in Botrytis cinerea from strawberry in Beijing[J]. Plant Protection，42（2）：177-181.] doi：10.3969/j.issn.0529-1542. 2016.02.032.

張艷杰，許換平，沈鳳英，李興紅，李亞寧，劉大群. 2017. 我國(guó)葡萄灰葡萄孢菌形態(tài)型和致病力分化[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，25（11）：1740-1755. [Zhang Y J，Xu H P，Shen F Y，Li X H，Li Y N，Liu D Q. 2017. Phenotypes and viru-lence variability among grape gray mold isolates from grapes （Vitis vinifera） in China[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，25（11）：1740-1755.] doi：10.3969/j.issn.1674-7968.2017.11.002.

鄭媛萍. 2018. 我國(guó)葡萄灰霉病菌對(duì)主要?dú)⒕鷦┑目顾幮詸z測(cè)[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院. [Zheng Y P. 2018. The detection on the main fungicides resistance of Botrytis cinerea from grape in China[D]. Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences.]

周默，盧寶慧，劉麗萍，白慶榮，高潔. 2020. 人參灰葡萄孢菌Botrytis cinerea的種群表型和基因型多樣性[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，39（3）：45-53. [Zhou M，Lu B H，Liu L P，Bai Q R，Gao J. 2020. Phenotypeic and genetic variability among Botrytis cinerea population isolated from ginseng[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，39（3）：45-53.] doi：10.13300/j.cnki.hnlkxb.2020.03.006.

DeLong J A，Saito S，Xiao C L，Naegele R P. 2020. Population genetics and fungicide resistance of Botrytis cinerea on Vitis and Prunus spp. in California[J]. Phytopathology，110（3）：694-702. doi：10.1094/PHYTO-09-19-0362-R.

Diao Y Z，Larsen M M，Kamvar Z N，Zhang C，Li S，Wang W Z，Lin D，Peng Q， Knaus B J， Foster Z S L，Grünwald N J，Liu X L. 2020. Genetic differentiation and clonal expansion of Chinese Botrytis cinerea populations from tomato and other crops in China[J]. Phytopathology，110：428-439. doi：10.1094/PHYTO-09-18-0347-R.

Diolez A，Marchies F，F(xiàn)ortini D，Brygoo Y. 1995. Boty，a long-terminal-repeat retroelement in the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea[J]. Applied and Environment Microbiology，61（1）：103-108. doi：10.1128/aem.61.1.103-108.1995.

Esterio M，Mu?oz G，Ramos C，Estévez R，Salinas A，Auger J. 2011. Characterization of Botrytis cinerea isolates pre-sent in Thompson seedless table grapes in the central valley of Chile[J]. Plant Disease，95：683-690. doi：10.1094/PDIS-04-10-0298.

Fournier E，Levis C，F(xiàn)ortini D，Leroux P，Giraud T，Brygoo Y. 2003. Characterization of Bc-hch，the Botiytis cinerea homolog of the Neurospora crassa het-c vegetative incompatibility locus，and its use as a population marker[J]. Mycologia，95（2）：951-961. doi：10.1080/15572536.2004. 11833110.

Johnston P R，Hoksbergen K，Park D，Beever R E. 2014. Genetic diversity of Botrytis in New Zealand vineyards and the signi?cance of its seasonal and regional variation[J]. Plant Pathology，63（4）：888-898. doi：10.1111/ppa.12143.

Johnston P R，Park D，White D，Wilkie J P. 2016. Genetic diversity of Botrytis populations in New Zealand vineyards across seasons and regions[J]. New Zealand Plant Protection，69：25-29. doi：10.30843/nzpp.2016.69.5911.

Kretschmer M，Hahn M. 2008. Fungicide resistance and genetic diversity of Botrytis cinerea isolates from a vineyard in Germany[J]. Journal of Plant Disease and Protection，115 （5）：214-219. doi：10.1007/BF03356266.

Kumari S，Tayal P，Sharma E，Kapoor R. 2014. Analyses of genetic and pathogenic variability among Botrytis cinerea isolates[J]. Microbiological Research，169（11）：862-872. doi：10.1016/j.micres.2014.02.012.

Kuzmanovska B，Rusevski R，Ljupcho J，Mirjana J，Dario I，Katerina B. 2012. Phenotypic and genetic characterization of Botrytis cinerea isolates from tomato[J]. Genetika，44（3）：633-647. doi：10.2298/GENSR1203663K.

Levis C，F(xiàn)ortini D，Brygoo Y. 1997. Flipper，a mobile Fot1-like transposable element in Botrytis cinerea[J]. Molecular and General Genetics，254：674-680. doi：10.1007/s00 4380050465.

Li N，Zhang J，Yang L，Wu M D，Li G Q. 2015. First report of Botrytis pseudocinerea causing gray mold on tomato （Lycopersicon esculentum） in central China[J]. Plant Disea-se，99（2）：283. doi：10.1094/PDIS-03-14-0256-PDN.

Martinez F，Blancard D，Lecomte L，Levis C，Dubos B，F(xiàn)ermaud M. 2003. Phenotypic differences between vacuma and transposa subpopulations of Botrytis cinerea[J]. European Journal of Plant Pathology，109：479-488. doi：10. 1023/A：1024222206991.

Martinez F，Dubos B，F(xiàn)ermaud M. 2005. The role of saprotrophy and virulence in the population dynamics of Botrytis cinerea in vineyards[J]. Phytopathology，95：692-700. doi：10.1094/PHYTO-95-0692.

Mirzaei S，Goltapeh E M，Shams-Bakhsh M，Safaie M，Chaichi M. 2010. Genetic and phenotypic diversity among Botrytis cinerea isolates in Iran[J]. Journal of phytopathology，157（7-8）：474-482. doi：10.1111/j.1439-0434.2008. 01518.x.

Mu?oz C，Talquenca S G，Oriolani E，Combina M. 2010. Genetic characterization of grapevine-infecting Botrytis cinerea isolates from Argentina[J]. Revista Iberoamericana de Micología，27（2）：66-70. doi：10.1016/j.riam.2009.12. 006.

Mu?oz G，Campos F. 2013. Genetic characterization of Botrytis cinerea，isolates collected from pine and eucalyptus nurse-ries in Bio-Bio Region，Chile[J]. Forest Pathology，43（6）：509-512. doi：10.1111/efp.12057.

Mu?oz G，Campos F，Salgado D，Galdames R，Gilchrist L，Chahin G，Andrade O. 2016. Molecular identification of Botrytis cinerea，Botrytis paeoniae and Botrytis pseudocinerea associated with gray mould disease in peonies （Paeo-nia lactiflora Pall.） in southern Chile[J]. Revista Iberoa-mericana de Micología，33（1）：43-47. doi：10.1016/j.riam. 2015.02.002.

Pei Y G，Tao Q J，Zheng X J，Li Y，Sun X F，Li Z F，Qi X B，Xu J，Zhang M，Chen H B，Chang X L，Tang H M，Sui L Y，Gong G S. 2019. Phenotypic and genetic characterization of Botrytis cinerea population from kiwifruit in Si-chuan Province，China[J]. Plant Disease，103：748-758. doi：10.1094/PDIS-04-18-0707-RE.

Plesken C，Pattar P，Reiss B，Noor Z N， Zhang L，Klug K，Huettel B，Hahn M. 2021. Genetic diversity of Botrytis cinerea revealed by multilocus sequencing，and identification of B. cinerea populations showing genetic isolation and distinct host adaptation[J]. Frontiers in Plant Science，12：e663027. doi：10.3389/fpls.2021.663027.

Saito S，Michailides T J，Xiao C L. 2019. Fungicide-resistant phenotypes in Botrytis cinerea populations and their impact on control of gray mold on stored table grapes in California[J]. European Journal of Plant Pathology，154（2）：203-213. doi：10.1007/s10658-018-01649-z.

Samuel S，Veloukas T，Papavasileiou A，Karaoglanidis G S. 2012. Differences in frequency of transposable elements presence in Botrytis cinerea populations from several hosts in Greece[J]. Plant Disease，96：1286-1290. doi：10.1094/PDIS-01-12-0103-RE.

Veloso J，van Kan J A L. 2018. Many shades of grey in Botrytis-host plant interactions[J]. Trends in Plant Scien-ce，23（7）：613-622. doi：10.1016/j.tplants.2018.03.016.

Wahab H A. 2015. Characterization of Egyptian Botrytis cinerea isolates from different host plants[J]. Advances in Microbiology，5（3）：177-189. doi：10.4236/aim.2015.53017.

Walker A S，Gautier A，Confais J，Martinho D，Viaud M，Le Pêcheur P，Dupont J，F(xiàn)ournier E. 2011. Botrytis pseudocinerea，a new cryptic species causing gray mold in French vineyards in sympatry with Botrytis cinerea[J]. Phytopathology，101（12）：1433-1445. doi：10.1094/PHYTO-04-11-0104.

Zhang Y J，Li X H，Shen F Y，Xu H P，Li Y N，Liu D Q. 2018. Characterization of Botrytis cinerea isolates from grape vineyards in China[J]. Plant Disease，102：40-48.? doi：10.1094/PDIS-01-17-0062-RE.

收稿日期：2021-08-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-29-19）;湖北省技術(shù)創(chuàng)新重大專項(xiàng) （2019ABA093）;農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（2018ZTSJJ9）

通訊作者：龔林忠（1977-），https：//orcid.org/0000-0001-6042-0769，研究員，主要從事葡萄、桃等果樹(shù)遺傳育種與栽培研究工作，E-mail：gcs325@126.com;孫中海（1961-），https：//orcid.org/0000-0001-5412-3274，博士，研究員，主要從事果樹(shù)及經(jīng)濟(jì)林果育種與栽培研究工作，E-mail：hbfruit@126.com

第一作者：王澤瓊（1981-），https：//orcid.org/0000-0002-7361-1561，博士，主要從事植物保護(hù)研究工作，E-mail：wangzeqiong@126.com