黔江煙田病毒與周邊作物及雜草攜毒關系分析

王 晶，何偉光，陳海濤，冉 茂，汪代斌，孫現(xiàn)超*

黔江煙田病毒與周邊作物及雜草攜毒關系分析

王 晶1，何偉光2，陳海濤1，冉 茂3，汪代斌3，孫現(xiàn)超2*

（1.中國煙草總公司重慶市公司，重慶 400023；2.西南大學植物保護學院，重慶 400716；3.重慶煙草科學研究所，重慶 400715）

為明確煙田煙葉攜帶病毒與周邊作物和雜草攜帶病毒的親緣關系，利用RT-PCR克隆煙田煙葉與周邊雜草和作物攜帶病毒外殼蛋白（CP），通過MEGA序列比對分析黔江煙田煙葉和周邊雜草與作物所帶病毒種類及其親緣關系。結果顯示，黔江地區(qū)煙草感染病毒有煙草普通花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）和馬鈴薯Y病毒（PVY）；在煙田周邊雜草和作物番薯、四季豆、糯米團、三懸葉鉤草、雜草中檢測到了TMV；自番薯、四季豆、蓬蘽、千里光、糯米團、三懸葉鉤草中擴增出CMV；自番薯、四季豆、假酸漿、雜草中擴增出了PVY。進化關系分析顯示，三懸葉鉤草、四季豆、糯米團以及番薯為黔江煙田煙葉TMV的主要來源，蓬蘽為煙葉病毒病CMV的侵染源，假酸漿為煙田PVY的主要來源。

煙草；病毒病；雜草；親緣關系

煙草病毒病是威脅重慶市煙草生產(chǎn)的主要病害，其發(fā)生普遍、危害嚴重、防治困難，對煙草的產(chǎn)質量影響很大[1]。據(jù)報道，自然狀態(tài)下能侵染煙草的病毒有近20種[2]，其中煙草普通花葉病毒（，TMV）以及煙蚜傳播的黃瓜花葉病毒（，CMV）和馬鈴薯Y病毒（，PVY）分布廣、危害大，是重慶市煙區(qū)的主要病毒病病原[3]。病毒病傳播快、難防治，目前尚無有效單一的防治措施[4]。煙草病毒病的防治一直遵循“預防為主，綜合防治”的植保方針，重點在于減少毒源、阻斷病毒傳染或切斷侵染循環(huán)，同時運用多種防治方法相互配合綜合防治[4]。前人研究表明，病殘體是煙草病毒病的主要初侵染源[3,5]，但重慶煙田雜草在煙草病毒傳播中的作用尚未有研究報道。煙田雜草是在煙田中生長、不斷自然延續(xù)其種族，并影響到煙草生長的一類植物，已成為影響煙草的產(chǎn)量和質量的重要因素[6]，多項研究表明雜草能攜帶植物病毒，包括馬唐、狗尾草、雀稗、雙穗雀稗、小飛蓬、黃花蒿、野艾蒿、苦荬菜、勝紅薊、桃葉蓼、尼泊爾廖、藜、蔊菜等在內(nèi)的多種雜草能感染TMV、CMV等[7-8]，而生活在煙田周邊的雜草則可能會作為非植煙季節(jié)病毒的中間寄主，成為次年煙葉病毒病發(fā)生的侵染源。

本研究針對黔江煙區(qū)煙草病毒病的主要病原及其周邊雜草及作物帶毒情況進行分析，明確黔江地區(qū)煙葉病毒病的來源，為煙葉田間阻斷病毒傳播及控制煙草病毒病提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2019年在重慶市黔江區(qū)濯水鎮(zhèn)附近村落采集煙田周邊具有類似病毒病癥狀的作物番薯（Lam.）、四季豆（）；黔江煙田周邊具有病毒病癥狀的雜草蓬蘽（Thunb）、茼蒿（）、千里光（Buch.-Ham. ex D. Don）、糯米團[(Bl.) Miq.]、假酸漿[(Linn.) Gaertn.]、三懸葉鉤草（）和尚未鑒定出的雜草與種子共計21個樣品于非植煙季節(jié)采集；于煙草生長期采集感染病毒病的煙草（）葉片樣品，采集地點分別是黔江區(qū)濯水鎮(zhèn)堰塘村（YT）、彭家村（PJ），五福村（WF），后槽村（HC），桐木村（TM），鄔楊村（WY）。

1.2 試劑與菌株

植物總RNA提取Trizol、DNA連接試劑盒、反轉錄試劑盒購于寶日醫(yī)生物技術（TaKaRa）有限公司；DNA純化回收試劑盒和pGEM-T Easy載體購于天根生化科技（TIANGEN）有限公司；大腸桿菌DH5α購自北京全式金生物技術有限公司；引物合成及測序均由北京六合華大基因科技有限公司完成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 RNA提取及cDNA的合成

煙葉總RNA提取采用RNAiso Plus，步驟見https://www.takarabiomed.com.cn/DownLoad/9108-9109.pdf。反轉錄采用NovoScrip Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，體系如下：3 μL模版RNA，1 μLDNA Purge，6 μL RNase Free Water，10 μL 2×NovoScript Plus 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix，程序如下：50 ℃ 30 min，75 ℃ 5 min，16 ℃ 5 min。

1.4 病毒檢測及克隆

重慶煙區(qū)煙草主要受TMV、CMV、PVY侵染[1]。根據(jù)NCBI報道的上述病毒外殼蛋白（coat protein，CP）核酸序列，設計出特異性引物，詳見表1。PCR擴增體系為：2×PCR Mix 12.5 μL，上下游引物（10 mmol）各1 μL，DNA 2 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性 3 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60 s/90 s，共34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，16 ℃保溫5 min。

參考使用說明書用DNA凝膠回收試劑盒回收獲得的目標條帶，將回收的片段連接到pGEM-T Easy 載體上并轉入大腸桿菌，隨機挑選2個陽性克隆送華大基因測序。

1.5 進化關系分析

采用MEGA 7.0.26比較序列同源性，采用默認參數(shù)?；卩徑臃ǎ∟eighbor-Joining, NJ），采用MEGA 7.0.26程序構建系統(tǒng)發(fā)育樹。選擇Poisson模型，將bootstrap設置為1000，以此來評估系統(tǒng)發(fā)育分析結果的置信度。

2 結 果

2.1 幾種雜草田間癥狀

如圖1所示，與正常雜草相比，黔江煙田周邊蓬蘽病狀表現(xiàn)為新葉褪綠，成黃綠相間的花葉，葉緣向下翻卷；三懸葉鉤草葉脈呈黃色，新葉黃化，葉片泡狀突起，皺縮，葉緣紅色扭曲畸形；糯米團葉片黃化，葉片變窄；千里光葉片變窄，葉緣向上翻卷。

表1 用于RT-PCR擴增的特異性引物

注：A-B，蓬蘽；C-E，三懸葉鉤草；F，糯米團；G，千里光。

2.2 TMV序列分析及親緣關系比較

利用設計的特異性檢測引物，經(jīng)PCR擴增、電泳檢測得到600 bp左右的與目標基因大小一致的片段。共檢測了21個樣品，分別是煙葉樣5個、番薯樣2個、四季豆樣1個、蓬蘽樣1個、茼蒿樣1個、千里光樣2個、糯米團樣1個、假酸漿樣2個、三懸葉鉤草樣3個、雜草樣2個、雜草種子1個。其中有11個樣品檢測到了TMV（圖2），檢出率為52.38%，分別為5個煙葉、1個番薯、1個四季豆、1個糯米團、2個三懸葉鉤草、1個雜草。

注：M，Maker 2000+；1-5，煙葉；6，未知雜草種子；7，蓬蘽；8，茼蒿；9-10，千里光；11，糯米團；12-13，假酸漿；14-16，三懸葉鉤草；17-18，番薯；19-20，未知雜草；21，四季豆；22，陰性；23，陽性。下同。

將上述PCR產(chǎn)物純化回收后連接到pGEM-T Easy 載體上，轉化至大腸桿菌，經(jīng)菌檢測序，結果顯示番薯（fan_T）、四季豆（si_T）、糯米團（nuo_T）、三懸葉鉤草（san_T）中的TMV CP分離物核酸長度為480 bp。將所得序列進行NCBI的Blastn比對，下載親緣關系最近的16個TMV分離物CP序列，利用MEGA對黔江煙田煙葉TMV分離物（HC、TM、WY、YT、PJ、WF）CP與雜草/作物檢測到的TMV分離物CP進行親緣關系比對。結果顯示（圖3），黔江番薯（fan_T）、四季豆（si_T）、糯米團（nuo_T）、三懸葉鉤草（san_T）中TMV分離物與其他的TMV分離物親緣關系較遠，但與黔江煙田煙葉TMV分離物親緣關系較近。黔江地區(qū)煙葉TMV分離物ZL5與其他分離物親緣關系較遠，與KU175649.1中國安徽辣椒TMV分離物親緣關系最近，而DPI與KJ508019.1福建煙草分離物親緣關系最近?？偟膩碚f，這4種雜草/作物中的TMV分離物與煙葉TMV分離物的親緣關系較近，因此認為煙田煙葉的TMV可能來自這些感病雜草。

圖3 基于TMV各分離物部分CP基因序列的系統(tǒng)進化樹

2.3 CMV序列分析及親緣關系比較

利用我們設計的特異性引物，經(jīng)PCR擴增過后，電泳檢測得到322 bp左右的與目標基因大小一致的片段。本次共檢測的21個樣品中，有8個樣品檢測到了CMV（圖4），分別為番薯、四季豆、煙葉、蓬蘽、千里光、糯米團各1個，三懸葉鉤草2個，檢出率為38.10%。

圖4 黔江雜草、作物CMV CP擴增電泳圖

通過分子克隆測序確定蓬蘽（peng_C）和四季豆（si_C）的CMV重慶黔江分離物CP片段長度為322 bp。將上述兩種雜草與作物的CMV分離物CP片段進行NCBI的Blastn比對，下載E值最小的17 個CMV分離物CP片段，與黔江CMV煙草分離物（WF、HC、TM、PJ、WY和YT）CP序列一同，利用MEGA對比進化距離。由圖5可知，四季豆（si_C）的CMV與其他分離物的親緣關系較近，蓬蘽（peng_C）與這些CMV分離物的親緣關系較遠，但蓬蘽（peng_C）與煙田煙葉CMV分離物的親緣關系較近，因此蓬蘽為煙田煙葉CMV的直接來源。

2.4 PVY序列分析及親緣關系比較

根據(jù)已報道的PVY CP序列，設計一段特異性引物擴增PVY CP。經(jīng)PCR擴增電泳檢測得到800 bp左右的與目標基因大小一致的片段。本次檢測了21個樣品，有5個樣品中檢測到了PVY（圖6），分別為煙葉、番薯、四季豆、假酸漿、雜草，檢出率為23.81%。

測序結果表明，番薯（fan-P）和假酸漿（jia-P）重慶黔江雜草PVY分離物CP長度均為803 bp，與各代表株系核苷酸同源性相比較，與PVYN:O、PVYO、PVYC、PVYNT株系核苷酸同源性分別為99.00%～99.38%、98.63%～98.75%、92.74%～98.75%、91.11%～91.48%，與PVYN株系核苷酸同源性較低，為88.04%～89.61%；相較而言與PVYN:O株系的同源性最高。與黔江煙草PVY分離物CP核苷酸同源性相比較，黔江煙草PVY分離物CP核苷酸同源性與假酸漿（jia-P）最高，達99.00%，但與番薯（fan-P）核苷酸同源性不高，僅有49%。因此，認為假酸漿（jia-P）可能是黔江地區(qū)煙草病毒病PVY的傳播源。

圖5 基于CMV各分離物部分CP基因序列的系統(tǒng)進化樹

圖6 黔江雜草、作物PVY擴增電泳圖

結合進化樹可以看出（圖7），黔江作物與雜草PVY分離物分屬于兩個分支，假酸漿（jia-P）同黔江煙草PVY分離物MY同源性最高，屬于PVYN:O株系。番薯（fan-P）PVY分離物由于與其他PVY分離物關系較遠，被分為其他株系。

圖7 基于PVY各分離物部分CP基因序列的系統(tǒng)進化樹

3 討 論

前人對貴州煙田的雜草進行病毒檢測，發(fā)現(xiàn)雜草病毒平均檢測率達20.98%[9]，部分地區(qū)的TMV檢出率甚至達到了58.5%[10]；嚴丹侃等[11]對煙草生產(chǎn)不同時期煙田雜草TMV進行檢測，發(fā)現(xiàn)不同煙草生產(chǎn)時期煙田周邊雜草均含TMV，且煙草收獲期的TMV檢出率高達66.7%，表明煙葉病毒極有可能為周邊雜草傳播所致。本研究檢測了番薯、四季豆、蓬蘽、茼蒿、千里光、糯米團、假酸漿、三懸葉鉤草和尚未鑒定出的雜草與種子，共計21個采自非植煙季節(jié)的雜草及作物樣品、以及在煙草生長期采集的感染病毒病的煙葉樣品。雜草中TMV檢出率為52.38%，與已報道檢出率相似[9-11]。其中6種雜草及作物中檢測并分離出了病毒的外殼蛋白，番薯、四季豆同時含有兩種病毒，為復合侵染；糯米團、三懸葉鉤草、蓬蘽和假酸漿只含一種病毒。本次檢測首次在番薯、四季豆、三懸葉鉤草中檢測出TMV，首次在番薯中檢測出PVY，首次在蓬蘽中檢測出CMV。

為驗證上述作物和雜草病毒外殼蛋白分離物與黔江煙葉病毒外殼蛋白的親緣關系，將煙葉病毒分離物CP序列與上述雜草及作物病毒分離物CP序列進行系統(tǒng)進化樹分析。結果顯示，雜草和作物中的TMV分離物親緣關系較近，與煙葉TMV分離物也較近，但二者分屬兩個不同支系，同樣可認為雜草是煙田煙葉TMV的直接來源。從四季豆（si-C）和蓬蘽（peng-C）檢測出了CMV，但通過進化樹分析發(fā)現(xiàn)二者相似度較低，可能來源于不同侵染源，其中蓬蘽（peng-C）分離物與黔江煙葉CMV分離物親緣關系較近，蓬蘽為黔江煙田煙葉病毒病CMV的侵染源。此外，從假酸漿（jia-P）和番薯（fan-P）中檢測出PVY，通過序列比對發(fā)現(xiàn)二者CP相似度不高，通過進化樹分析發(fā)現(xiàn)假酸漿PVY分離物CP與黔江地區(qū)煙田煙葉PVY分離物CP（MQG2, HTX4）同源性很高，分屬在同一支，屬于PVYN:O株系。而番薯分離物與黔江地區(qū)煙田煙葉PVY分離物CP親緣關系較遠，且無法斷定株系。因此猜測黔江地區(qū)煙田煙葉PVY的來源可能是該假酸漿（jia-P）帶毒植株。

病毒由于其特殊的結構，具有傳播快、防治難等特點[12]，目前病毒病的防治，以預防為主，重視傳播源，減少病毒傳染或阻斷傳染途徑[13]。貴陽煙區(qū)調查發(fā)現(xiàn)[14]，煙田周圍的作物、雜草常年出現(xiàn)病毒病樣，推測這些雜草和作物可能是煙田煙苗病毒病的侵染來源，與本研究的檢測結果類似。因此對于類似煙區(qū)的病毒病防治，應加大對煙田周邊作物、雜草病毒病發(fā)病時期的實時監(jiān)測，及時處理這些作物和雜草，降低其傳播到煙草的可能性，只有從源頭上治理煙草病毒病害，才能將其所造成的經(jīng)濟損失降到最低。

4 結 論

研究結果表明，在煙田周邊的番薯、四季豆、三懸葉鉤草中檢測出TMV，在番薯中檢測出PVY，在蓬蘽中檢測出CMV；三懸葉鉤草、四季豆、糯米團以及番薯為黔江煙田煙葉TMV主要來源，蓬蘽為黔江煙田煙葉CMV的侵染源，假酸漿為黔江煙田煙葉PVY主要來源之一。

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Analysis of Virus Carrying Relationship between Tobacco and Neighboring Crops and Weeds in Tobacco Fields of Qianjiang, Chongqing

WANG Jing1, HE Weiguang2, CHEN Haitao1, RAN Mao3, WANG Daibin3, SUN Xianchao2*

(1. Chongqing Company of China Tobacco Corporation, Chongqing 400023, China; 2. College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400716, China; 3. Chongqing Tobacco Science Research Institute, Chongqing 400715, China)

Toclarifying the genetic relationship between the viruses in tobacco leaves and the viruses in neighboring crops and weeds, RT-PCR was used to detect and clone virus CPs in tobacco leaves and neighboring crops and weeds. MEGA was employed to analyze the relationships between viruses from tobacco leaves and neighboring crops and weeds in Qianjiang. The results showed that tobacco leaves in Qianjiang area contained TMV, CMV and PVY. In addition, TMV CP was isolated and cloned from(Bl.).,,Lam., and. CMV CP was isolated and cloned from,Buch.-Ham. ex D. Don,(Bl.) Miq.,,Lam. and, and PVY CP was isolated and cloned from(Linn.) Gaertn.,Lam, weeds and. Through the analysis of the evolutionary relationship, it can be concluded that,,(Bl.) Miq. andLam. are the main sources of TMV in tobacco fields,is one of the sources of infection of CMV in tobacco fields, and(Linn.). is one of the main sources of PVY in tobacco fields in Qianjiang.

tobacco; virus disease; weeds; evolutionary relationship

S435.72

A

1007-5119（2022）03-0033-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.03.006

中國煙草總公司重慶市公司科技項目（B20212NY2312、B20212NY2318）

王 晶（1981-），男，碩士，農(nóng)藝師，主要從事煙草科研管理工作。E-mail：306140461@qq.com。

，E-mail：sunxianchao@163.com

2021-08-09

2021-12-15