粘質(zhì)沙雷氏菌高產(chǎn)發(fā)酵靈菌紅素的工藝優(yōu)化及抗病毒活性

葛 明，馮 佳，李 瑩，焦裕冰，申莉莉，王鳳龍，李 斌，李文剛，劉東陽，王 勇，江連強(qiáng)，張明金，閆芳芳，楊 宇*，楊金廣*

粘質(zhì)沙雷氏菌高產(chǎn)發(fā)酵靈菌紅素的工藝優(yōu)化及抗病毒活性

葛 明1，馮 佳1，李 瑩1，焦裕冰1，申莉莉1，王鳳龍1，李 斌2，李文剛2，劉東陽3，王 勇3，江連強(qiáng)3，張明金4，閆芳芳5，楊 宇5*，楊金廣1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.四川省煙草公司，成都 610017；3.四川省煙草公司涼山州公司，四川 西昌 615000；4.四川省煙草公司瀘州市公司，四川 瀘州 646000；5.四川省煙草公司攀枝花市公司，四川 攀枝花 617000）

為提高粘質(zhì)沙雷氏菌S3菌株的靈菌紅素產(chǎn)率，本研究對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌S3發(fā)酵過程中重要的發(fā)酵條件參數(shù)和關(guān)鍵組分進(jìn)行逐項(xiàng)優(yōu)化，并驗(yàn)證了發(fā)酵液靈菌紅素提取物對(duì)本氏煙草病毒的抑制效果。結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)基配方為：丙三醇0.5%，蛋白胨1.5%，氯化鈉0.5%，氯化鉀0.25%；最佳發(fā)酵條件為：接種量為10%，裝液量為60%～70%，pH恒定為6.0，培養(yǎng)溫度為28 ℃，振搖速度160 r/min，發(fā)酵周期為60 h。在該發(fā)酵條件下，既有利于粘質(zhì)沙雷氏菌菌體生長，又能夠使靈菌紅素的產(chǎn)量達(dá)到最大化。按照該優(yōu)化條件進(jìn)行發(fā)酵后，其靈菌紅素提取物溶液噴施于接種TMV、CMV和PVY的本氏煙，煙葉中TMV、CMV和PVY病毒量分別為空白對(duì)照的12.61%、29.41%和17.69%，對(duì)病毒的抑制效果優(yōu)于氨基寡糖素。試驗(yàn)所得的發(fā)酵制備條件能夠提高靈菌紅素產(chǎn)量，提取物具備顯著抗病毒特性，具有產(chǎn)業(yè)化開發(fā)潛力和經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價(jià)值。

粘質(zhì)沙雷氏菌；靈菌紅素；發(fā)酵條件優(yōu)化；植物抗病毒劑

靈菌紅素（Prodigiosin）是由粘質(zhì)沙雷氏菌（）及其他多種細(xì)菌產(chǎn)生的一種天然次生代謝產(chǎn)物，其中粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的靈菌紅素的生物活性較好[1]。靈菌紅素具有3個(gè)吡咯組成的甲氧基吡咯骨架，幾乎不溶于水，但易溶于極性較大的有機(jī)溶劑，在不同pH條件下呈現(xiàn)不同的顏色[2]。近年來研究表明，靈菌紅素在抗細(xì)菌[3]、抗病毒[4]、抗真菌[5]、免疫調(diào)控[6]以及純天然工業(yè)染料[7]等方面具有廣闊的應(yīng)用潛力。本實(shí)驗(yàn)室已初步揭示了靈菌紅素可以誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生抗病毒特性[8]，激活農(nóng)作物抗病毒免疫調(diào)控。

目前，靈菌紅素可以通過化學(xué)合成法[5]和微生物發(fā)酵法[9]制備。然而化學(xué)合成法相對(duì)困難，反應(yīng)步驟復(fù)雜，產(chǎn)率低，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；而目前國內(nèi)對(duì)靈菌紅素發(fā)酵過程的研究主要使用搖瓶培養(yǎng)，對(duì)發(fā)酵罐發(fā)酵過程研究較少[10]。在發(fā)酵過程中，次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成不僅受制于碳氮源的快速消耗及其分解產(chǎn)物的積累[11]，還受磷酸鹽等的調(diào)節(jié)。對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成途徑的調(diào)控，最終要?dú)w結(jié)到發(fā)酵培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件的調(diào)控上。通過對(duì)這些因素的調(diào)控，以最大限度地調(diào)節(jié)代謝向合成產(chǎn)物方向進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)的目的。

煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）和馬鈴薯Y病毒（PVY）是危害煙草、馬鈴薯、番茄、辣椒等茄科作物的常見病毒，尤其對(duì)煙草等主要經(jīng)濟(jì)作物的生產(chǎn)造成極大危害且難以防治[12]，然而，目前低毒、高效、低殘留的天然抗病毒藥劑的選擇仍然較少[13]。

在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌S3搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素的發(fā)酵條件和發(fā)酵液組分進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵液組分和發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)，為靈菌紅素的高產(chǎn)工業(yè)化提供試驗(yàn)基礎(chǔ)；同時(shí)對(duì)靈菌紅素抗病毒活性進(jìn)行初步驗(yàn)證，結(jié)合農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化需求，以最大經(jīng)濟(jì)性實(shí)現(xiàn)粘質(zhì)沙雷氏菌S3的靈菌紅素產(chǎn)量和抗病毒活性的雙重提升。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株-S3（GenBank：MK411566.1）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植保中心病毒實(shí)驗(yàn)室獲得并保存。已完成對(duì)該菌株的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定、16S rDNA鑒定[14]。

供試煙草：本氏煙（），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植保中心病毒實(shí)驗(yàn)室提供。

病毒毒源：TMV、CMV、PVY毒源植株均保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植保中心病毒實(shí)驗(yàn)室。

平板培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.5%，氯化鈉0.5%，超純水97.5%；發(fā)酵培養(yǎng)基：按照1.2.5試驗(yàn)結(jié)果對(duì)種子培養(yǎng)基進(jìn)行改進(jìn)。

主要試劑：牛肉膏、葡萄糖、氯化鈉、氯化鎂、氯化鉀、丙三醇、油酸及蔗糖購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨及吐溫80購于Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司；酵母粉購于北京奧博星公司；LB肉湯、瓊脂粉購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 取保存于?80 ℃的粘質(zhì)沙雷氏菌菌株，在LB固體平板培養(yǎng)基上過夜活化后，挑取單菌落分別置于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，28 ℃，160 r/min條件下培養(yǎng)24 h，得到種子液。向發(fā)酵培養(yǎng)基加入體積總量10%的種子液，在28 ℃，pH 6.0，160 r/min條件下發(fā)酵60 h。

1.2.2 菌體生物量測(cè)定 取20 mL發(fā)酵液裝入已知質(zhì)量的50 mL離心管中，10?000 r/min離心20 min，棄上清，用蒸餾水洗滌后再離心，重復(fù)2次，余下的濕菌體置于80 ℃烘箱中烘干至恒重，測(cè)菌體干質(zhì)量。

1.2.3 靈菌紅素含量測(cè)定 采用比色法測(cè)定，取發(fā)酵液0.5 mL，加入酸性甲醇（pH 3.0）4.5 mL，混合均勻，靜置30 min萃取胞內(nèi)色素，離心后取上清液檢測(cè)吸光度534[2]，用以表示靈菌紅素產(chǎn)量。

1.2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 依次進(jìn)行以下條件的優(yōu)化，每次都將上一優(yōu)化結(jié)果應(yīng)用于下一因素的優(yōu)化。光照強(qiáng)度：0、100、500、1000 cd；pH值：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0；溫度：22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃；振搖速度：0、60、100、160、180、200 r/min。發(fā)酵60 h后，測(cè)定每組發(fā)酵液中菌體干質(zhì)量和靈菌紅素產(chǎn)量。

1.2.5 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化 在初始發(fā)酵培養(yǎng)基和已優(yōu)化因素的基礎(chǔ)上，對(duì)最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽種類進(jìn)行優(yōu)選。碳源：0.5%的葡萄糖、蔗糖、丙三醇和牛肉膏；氮源：1%的無機(jī)氮源物質(zhì)硫酸銨、氯化銨和有機(jī)氮源物質(zhì)蛋白胨、酵母粉、尿素；無機(jī)鹽：0.2%的MgCl2、CaCl2、KCl、MgSO4。發(fā)酵60 h后，測(cè)定每組發(fā)酵液中菌體干質(zhì)量和靈菌紅素產(chǎn)量。

1.2.6 靈菌紅素的獲取 將粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵液和乙酸乙酯按照1∶1體積混合，期間多次攪拌，加速靈菌紅素的萃??；乙酸乙酯處理發(fā)酵液2～3 d后，取紅色上清（濾去不溶性雜質(zhì)）至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行蒸發(fā)，得到靈菌紅素粗提物[15]，再通過層析純化獲得靈菌紅素精提物。

1.2.7 抗病毒活性的測(cè)定 取新鮮毒源葉片研磨勻漿后，在本氏煙葉片上摩擦接種病毒，24 h后用濃度為10 μg/mL的靈菌紅素溶液噴釋植株，等量去離子水和10 μg/mL的氨基寡糖素溶液分別作為空白對(duì)照和陽性對(duì)照。72 h后提取系統(tǒng)葉總RNA，反轉(zhuǎn)錄[16]，進(jìn)行qRT-PCR進(jìn)行病毒量的檢測(cè)，以測(cè)定抗病毒活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Kruskal-Wallis t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，并使用GraphPad Prism 8制作圖表。

2 結(jié) 果

2.1 發(fā)酵條件對(duì)靈菌紅素的影響

2.1.1 光照強(qiáng)度對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響 由圖1可知，光照強(qiáng)度對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌體的生長沒有顯著影響，但是對(duì)靈菌紅素的產(chǎn)量影響顯著。無光照時(shí)靈菌紅素的產(chǎn)量最多，534為0.443。隨著光照強(qiáng)度的增加，靈菌紅素的產(chǎn)量不斷下降，光照越強(qiáng)下降的比例越大。

2.1.2 pH對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響 由圖2可知，粘質(zhì)沙雷氏菌體質(zhì)量和靈菌紅素產(chǎn)量都隨著初始pH的變化而發(fā)生變化，當(dāng)pH值為6.0時(shí)兩者的量均達(dá)到最大值，菌體干質(zhì)量濃度為1.906 g/L，534達(dá)0.416。因此，pH 6.0是粘質(zhì)沙雷氏菌高產(chǎn)靈菌紅素的最優(yōu)pH。

2.1.3 培養(yǎng)溫度對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響 由圖3可知，培養(yǎng)溫度在22～32 ℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的上升粘質(zhì)沙雷氏菌體質(zhì)量和靈菌紅素產(chǎn)量均先增多后減少。菌體干質(zhì)量濃度在培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)最大為1.934 g/L；靈菌紅素產(chǎn)量在溫度為28 ℃時(shí)最高，534為0.413。

2.1.4 振搖速度對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響 由圖4可知，速度在0～200 r/min范圍內(nèi)變化時(shí)，隨著振搖速度增大，粘質(zhì)沙雷氏菌生長速度加快，菌體富集增多；然而其合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物靈菌紅素產(chǎn)量先隨振搖速度的加快而增多，但是繼續(xù)增快時(shí)，發(fā)酵液中次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量減少。由于本試驗(yàn)的目的在于后期分離純化靈菌紅素，因此要選擇最適代謝靈菌紅素的發(fā)酵條件，故最佳振搖速度為160 r/min。

注：誤差線表示3組重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差，**表示差異顯著（p＜0.05）。下同。

圖2 pH對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響

圖3 溫度對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響

圖4 振搖速度對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響

2.2 發(fā)酵液組分的優(yōu)化

2.2.1 碳源對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響 由圖5可知，粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵的過程中，以丙三醇為碳源物質(zhì)時(shí)靈菌紅素的產(chǎn)量最高，534為0.943。當(dāng)選擇牛肉膏作為碳源物質(zhì)時(shí)，雖然粘質(zhì)沙雷氏菌菌體質(zhì)量增長顯著，但嚴(yán)重限制了靈菌紅素的合成。因此根據(jù)試驗(yàn)的結(jié)果，將丙三醇定為粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵合成靈菌紅素的最佳碳源物質(zhì)。

2.2.2 氮源對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響 由圖6可知，添加無機(jī)氮源硫酸銨和氯化銨時(shí)，粘質(zhì)沙雷氏菌的干質(zhì)量和靈菌紅素的產(chǎn)量均較少；將無機(jī)氮源換成有機(jī)氮源時(shí)，靈菌紅素的產(chǎn)量有顯著增加，尤其是添加蛋白胨時(shí)靈菌紅素的產(chǎn)量最高，534達(dá)到了0.964。添加酵母粉后，雖然菌體質(zhì)量達(dá)到了最大值，但菌體生長過于迅速，抑制了靈菌紅素合成。因此，蛋白胨是粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵高產(chǎn)靈菌紅素最合適的氮源物質(zhì)。

2.2.3 無機(jī)鹽對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響 由圖7可知，當(dāng)以無機(jī)鹽作為單因素時(shí)，分別添加MgCl2、CaCl2、KCl、MgSO4四種不同無機(jī)鹽時(shí)，靈菌紅素的產(chǎn)量均不同程度增加，說明Mg2+、Ca2+、K+均能起到促進(jìn)靈菌紅素合成的作用，并且其中促進(jìn)作用最為顯著的是K+，同時(shí)粘質(zhì)沙雷氏菌菌體的生長量也有所增加。根據(jù)上述結(jié)果，為了得到高產(chǎn)量的靈菌紅素，粘質(zhì)沙雷氏菌S3發(fā)酵培養(yǎng)基需要添加無機(jī)鹽KCl起到促進(jìn)作用。

2.3 靈菌紅素的抗病毒活性

如圖8所示，分別接種TMV、CMV和PVY后，靈菌紅素提取物處理組的病毒含量與空白對(duì)照組相比均非常低，TMV、CMV和PVY的病毒積累量分別是空白對(duì)照的12.61%、29.41%和17.69%，差異顯著，抑制效果優(yōu)于氨基寡糖素?？梢?，靈菌紅素對(duì)TMV、CMV和PVY的侵染復(fù)制具有較強(qiáng)的抑制作用，說明噴施靈菌紅素溶液對(duì)煙草病毒病有較好的防治潛力。

圖5 碳源對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響

圖6 氮源對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響

圖7 無機(jī)鹽對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響

圖8 靈菌紅素的抗病毒效果

3 討 論

在動(dòng)物病毒病防治應(yīng)用研究中，靈菌紅素主要通過改變細(xì)胞內(nèi)pH[17]、阻斷細(xì)胞自噬[18]、裂解DNA分子[19]等多種方式抑制多種病毒感染、增殖。本研究證明了靈菌紅素可以有效抑制煙草病毒病的侵染和復(fù)制。在國際市場(chǎng)上，靈菌紅素制劑價(jià)格高昂，生物合成效率較低，應(yīng)用成本較高，這是其難以在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域進(jìn)行推廣的主要因素。特異性產(chǎn)生靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌S3菌株的穩(wěn)定生長代謝是高通量獲得靈菌紅素的保障。

光照能促進(jìn)多種微生物和植物的生長、繁殖和運(yùn)動(dòng)等生命活動(dòng)，但相關(guān)文獻(xiàn)表明靈菌紅素對(duì)光敏感，光照不利于其合成[20]。發(fā)酵過程中有光照射會(huì)使得靈菌紅素的產(chǎn)量大幅度減少，表明粘質(zhì)沙雷氏菌的發(fā)酵應(yīng)盡量避光。pH的變化影響著機(jī)體的代謝和生長繁殖，粘質(zhì)沙雷氏菌的生長過程會(huì)改變發(fā)酵液pH，從而使靈菌紅素合成受阻[9]，因此在培養(yǎng)過程中要不斷調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH，以保持pH的恒定。溫度是影響微生物生命活動(dòng)的重要因素，在粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵過程中保持適合的培養(yǎng)溫度，有利于縮短其發(fā)酵周期和提高靈菌紅素產(chǎn)量。本研究中粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素的適宜溫度為28 ℃，這與已報(bào)道的粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)靈菌紅素的最佳發(fā)酵溫度28 ℃一致[21-22]。微生物發(fā)酵工藝過程中，搖瓶轉(zhuǎn)速直接影響發(fā)酵基質(zhì)的傳遞和微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的利用，并且在一定水平上影響著發(fā)酵液中的溶氧程度[20]，最終決定發(fā)酵生產(chǎn)能力和產(chǎn)品質(zhì)量。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，搖瓶發(fā)酵時(shí)振搖速度在160 r/min時(shí)有利于菌體的代謝生長，為工業(yè)化高產(chǎn)靈菌紅素提供幫助。

微生物的生長繁殖和發(fā)酵產(chǎn)物的合成都需要碳源和氮源物質(zhì)。價(jià)格更為低廉的碳源有利于在工業(yè)化生產(chǎn)靈菌紅素的過程中降低成本。適量添加的丙三醇在提高靈菌紅素的產(chǎn)量方面具有一定優(yōu)勢(shì)，且不會(huì)漂浮在發(fā)酵液上方阻礙氣體交換[23]。微生物發(fā)酵使用的氮源分為有機(jī)氮源和無機(jī)氮源。無機(jī)氮源成分單一，質(zhì)量較穩(wěn)定，可被快速利用；有機(jī)氮源營養(yǎng)豐富，因而微生物在含有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中常表現(xiàn)出生長旺盛、菌體濃度增長迅速等特點(diǎn)[24]。靈菌紅素的基本分子結(jié)構(gòu)是三個(gè)吡咯環(huán)[2]，其合成原料來源于氨基酸。無機(jī)鹽具有很多生理作用，如組成組織和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，有些為無機(jī)或有機(jī)化合物以構(gòu)成酶的輔基、激素、維生素、蛋白質(zhì)和核酸的成分，或作為多種酶系統(tǒng)的激活劑，參與許多重要的生理功能，并且無機(jī)鹽離子參與調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的通透性，確保滲透壓水平正常以及pH值穩(wěn)定[25]。通過試驗(yàn)，我們確定產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌最佳發(fā)酵液成分為丙三醇、蛋白胨、氯化鈉、氯化鉀。

研究結(jié)束后，在生產(chǎn)工廠按照本研究優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)條件在50 L-5 T發(fā)酵罐中進(jìn)行了發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)可有效提高靈菌紅素的產(chǎn)量，相較于報(bào)道的500～2000 mg/L的靈菌紅素產(chǎn)率[26]也維持在較高水平。由于粘質(zhì)沙雷氏菌屬于兼性厭氧菌，因此發(fā)酵液溶氧值建議溶氧探頭實(shí)時(shí)監(jiān)控，保持微量通氣即可。pH可用pH探頭實(shí)時(shí)監(jiān)控，并通過發(fā)酵系統(tǒng)軟件恒定為pH 6.0。發(fā)酵溫度控制在28 ℃，罐內(nèi)攪拌轉(zhuǎn)速保持在160 r/min。

隨著人們食品安全意識(shí)的提高和環(huán)保觀念的增強(qiáng)，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)更加關(guān)注農(nóng)藥應(yīng)用導(dǎo)致的健康損害以及環(huán)保問題[27]，重污染的化學(xué)農(nóng)藥逐漸退出市場(chǎng)，需要低毒、高效、低殘留的天然農(nóng)藥不斷推陳出新。作為一種新型的植物免疫誘抗劑，靈菌紅素生產(chǎn)成本的降低不但有利于其抗病毒活性的基礎(chǔ)研究，更有巨大的市場(chǎng)推廣潛力。

4 結(jié) 論

本研究確定粘質(zhì)沙雷氏菌S3制備靈菌紅素的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：丙三醇、蛋白胨、氯化鈉、氯化鉀、吐溫-80質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.5%、0.5%、0.25%、0.3%；發(fā)酵工藝參數(shù)為：接種量10%，裝液量60%～70%，發(fā)酵周期60 h，培養(yǎng)溫度28 ℃，振搖速度160 r/min。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件可有效提高靈菌紅素的產(chǎn)量，對(duì)于規(guī)?；苽潇`菌紅素具有重要指導(dǎo)意義。

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Process Optimization and Antiviral Activity of High Yielding Prodigiosin from

GE Ming1, FENG Jia1, LI Ying1, JIAO Yubing1, SHEN Lili1, WANG Fenglong1, LI Bin2, LI Wengang2, LIU Dongyang3, WANG Yong3, JIANG Lianqiang3, ZHANG Mingjin4, YAN Fangfang5, YANG Yu5*, YANG Jinguang1*

(1. Institute of Tobacco Research of CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Sichuan Province Company of China Tobacco Corporation, Chengdu 610017, China; 3. Liangshan Prefecture Company of Sichuan Tobacco Corpoation, Xichang, Sichuan 615000, China; 4. Luzhou City Company of Sichuan Tobacco Corpoation, Luzhou, Sichuan 646000, China; 5. Panzhihua City Company of Sichuan Tobacco Corpoation, Panzhihua, Sichuan 617000, China)

In order to improve the yield of prodigiosin in the industrial fermentation of-S3, the important fermentation condition parameters and key components of the fermentation broth of-S3 were optimized, and the inhibitory effect of the extracts of fermentation broth on viral diseases was verified. The results showed that the best medium formulation was: 0.5% of glycerol, 1.5% of peptone, 0.5% of sodium chloride and 0.25% of potassium chloride. The optimal fermentation conditions were: 10% inoculum, 60%-70% loading, constant pH of 6.0, incubation temperature of 28 ℃, stirring speed of 160 r/min, and 60 h fermentation cycle, which not only facilitated the growth of-S3, but also maximized the production of prodigiosin. After fermentation under the optimized conditions, the extract solution of prodigiosin was sprayed oninoculated with TMV, CMV and PVY, and the amount of TMV, CMV and PVY viruses in leaves was 12.61%, 29.41% and 17.69% of that in the blank control, respectively. The inhibitory effect on viruses was better than that of chitosan oligosaccharide. The fermentation conditions obtained from this study can improve the yield of prodigiosin, and the extracts have significant antiviral property, which has the potential for industrial development and economic application value.

; prodigiosin; optimization of fermentation conditions; plant antiviral agent

S435.72

A

1007-5119（2022）03-0020-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.03.004

山東省自然科學(xué)基金（ZR202103070049）；中國煙草總公司重大科技項(xiàng)目[110201901041（LS-04），110101601024（LS-04）]；四川省煙草公司科技項(xiàng)目（SCYC202008）；河南省煙草公司洛陽市公司科技項(xiàng)目（2020410300270076）；云南省煙草公司科技項(xiàng)目（2020530000241011）

葛 明（1996-），男，在讀碩士，主要從事分子病理學(xué)研究。E-mail：18653008590

，E-mail：楊 宇，405425592@qq.com；楊金廣，yangjinguang@caas.cn

2021-10-05

2022-05-31