乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取蘋果多酚及與血清膽紅素相關(guān)性研究

安 瓊 王 江 文 田 春 堯 衛(wèi) 陽 飛 王 貞 香*

（1.河西學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所；2.甘肅省河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅 張掖 734000；3.中科院西北高原生物研究所，青海 西寧 810000）

蘋果多酚是蘋果中的營養(yǎng)物質(zhì)，主要包括羥基苯甲酸類、花色苷、黃烷醇類、二羥查耳酮以及黃烷-3-醇類等五類化合物［1］，它具有抗氧化、清除自由基、抗過敏、抗突變及抗癌、抑制高血壓等作用［2-3］.

據(jù)文獻報到，對蘋果多酚常見的提取方法有機溶劑提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取等［4-5］.有機溶劑提取法提取時間較長，有機溶劑用量多［6］；超聲波輔助法的雖然可縮短提取時間，但此法溶劑消耗過快，破壞程度較大［7］；超臨界流體萃取法避免了使用有毒溶劑，溶劑回收簡單，節(jié)約能源，但是該法，對設(shè)備要求高，一次性投資大［8］.

雙水相萃?。ˋqueous Two-phase Extraction，ATPE）是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配.當(dāng)萃取體系的性質(zhì)不同時，物質(zhì)進入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力（如憎水鍵、氫鍵、和離子鍵等）存在和環(huán)境因素的影響，使其在上下相中的濃度不同［9］.其優(yōu)點：萃取環(huán)境溫和，易操作，不會引起生物活性物質(zhì)失活或變性；傳質(zhì)速度快，可快速萃取目標分析物［10-14］.

在前期研究中，課題組的老師發(fā)現(xiàn)蘋果多酚對血清膽紅素有降解的作用.膽紅素是由紅細胞破裂后釋放出的血紅蛋白轉(zhuǎn)化而來的一種有毒代謝產(chǎn)物.尤其在新生兒體內(nèi)，當(dāng)膽紅素（大部分為未結(jié)合膽紅素）在體內(nèi)積聚，會引發(fā)黃疸（neonatal jaundice）.患兒的膽紅素水平會持續(xù)增高，使患兒出現(xiàn)酸中毒、感染、缺氧等癥狀，重者可致中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損，產(chǎn)生膽紅素腦病，引起死亡或嚴重的后遺癥［15］.研究蘋果多酚與血清膽紅素的相關(guān)性，為其相互作用的機理、探尋治療膽紅素相關(guān)疾病新藥奠定理論基礎(chǔ).

在本研究以無水乙醇-硫酸銨建立雙水相體系，考察硫酸銨濃度，乙醇濃度，溫度三個因素對于蘋果多酚萃取率的影響，利用Box-Benhnken 設(shè)計響應(yīng)面進一步優(yōu)化萃取條件，獲得最佳工藝條件.在最佳工藝條件提取不同濃度的蘋果多酚，將其按1：1與有異常膽紅素的血清（15例病人）混合，用釩酸鹽氧化法，在不同時間測定總膽紅素（total bilirubin，TB），結(jié)合膽紅素（direct bilirubin，DB），未結(jié)合膽紅素（indirect bilirubin，IB）的濃度，分析其相關(guān)性.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沒食子酸標準品：成都德斯特生物技術(shù)有限公司；無水乙醇：天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；無水碳酸鈉：天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；硫酸銨：天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司，以上試劑均為分析純試劑；乙腈（色譜純，山東禹王試劑廠）；甲醇（色譜純，山東禹王試劑廠）.血清總膽紅素、未結(jié)合膽紅素測定試劑盒（浙江泰司特生物技術(shù)有限公司）.

電子分析天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；循環(huán)水式真空泵：鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；電熱恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；可見分光光度計：上海儀電分析有限公司；榨汁機：佛山乾程電氣科技有限公司；離心機：無錫瑞江分析儀器有限公司；KH-3000DB數(shù)控型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），十萬分之一天平（上海奧豪斯Discovery 專業(yè)性分析天平），全自動生化分析儀.

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的制備

對照品溶液：精密稱取沒食子酸對照品適量，配置成約500μg/mL 的溶液，作為標準溶液儲備液，4℃的儲存?zhèn)溆?

1.2.2 構(gòu)建無水乙醇/（NH4）2SO4雙水相體系

雙水相萃取利用被分離物質(zhì)在體系中的選擇性分配達到分離目的［16］，當(dāng)物質(zhì)進入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和分子間作用力的存在和環(huán)境的影響，使目標分子在上、下相進行選擇性分配［17］.被分離物質(zhì)在兩相間的分配服從Nernst定律，即K=Ct/Cb（Ct，Cb為被分離物質(zhì)在上、下相的濃度，K為分配系數(shù)）.

稱取一定量的硫酸銨，乙醇，蒸餾水和一定體積的蘋果粗提液于小燒杯中，加水使（NH4）2SO4溶解，攪拌至兩相充分混勻，轉(zhuǎn)移到10ml刻度離心管中，加水定容至刻度，2500r/min離心5min，以加速相分離過程.準確測定上、下相體積，根據(jù)與標準樣品吸光度值的對照計算上下相中蘋果多酚的含量，計算相應(yīng)的分配系數(shù)K和上相回收率Y%.

用該方程計算雙水相萃取過程中蘋果多酚的分配系數(shù)K：

其中Ct（mg/ml）蘋果多酚在上相的濃度，Cb（mg/ml）是蘋果多酚在下相的濃度.

相比R定義為上相與下相的體積之比：

其中Vt（ml）是蘋果多酚在上相的體積，Vb（ml）是蘋果多酚在下相的體積.

上相回收率Y%定義為上相蘋果多酚濃度和粗提物蘋果多酚濃度之比：

其中Ct（mg/ml）蘋果多酚在上相的濃度，Cb（mg/ml）是蘋果多酚在下相的濃度；

Vt（ml）是蘋果多酚在上相的體積，Vb（ml）是蘋果多酚在下相的體積.

1.2.3 血清中膽紅素測定

TB（釩酸鹽氧化法）：樣本中總膽紅素在pH3.0附近，在氧化劑和反應(yīng)促進劑作用下，被氧化成膽綠素，與此同時，膽紅素特有的黃色消失，測定反應(yīng)前后吸光度的差，即可計算出樣本中總膽紅素的濃度.樣本中總膽紅素的含量（umol/L）=ΔAu/ΔAcXCc，其中ΔAu：測定樣本中吸光度差，ΔAc：校準品吸光度差，Cc：校準品標示值.

DB（釩酸鹽氧化法）：樣本中直接膽紅素在pH3.0附近，在氧化劑和表面活性劑作用下，被氧化成膽綠素，與此同時，膽紅素特有的黃色消失，測定反應(yīng)前后吸光度的差，即可計算出樣本中直接膽紅素的濃度.樣本中直接膽紅素的含量（umol/L）=ΔAu/ΔAcXCc，其中ΔAu：測定樣本中吸光度差，ΔAc：校準品吸光度差，Cc：校準品標示值.

IB：總膽紅素的濃度-結(jié)合膽紅素的濃度

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 繪圖，用Design-Expert8.05 進行響應(yīng)面分析.采用SPSS 20.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析.獲得的實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，將不同時間點的血清濃度，采用Pearson相關(guān)性分析法考察兩者的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

采用Folin-Ciocalteu（F-C）比色法測定蘋果多酚的含量［8］.移取0.2g/ml 的沒食子酸標準溶液1.25ml、2.5ml、3.75ml、5ml分別置于25ml比色管中，并設(shè)置一個空白對照組，加蒸餾水至刻度線.分別取1ml上述不同濃度的沒食子酸溶液，向其中加入2ml F-C試劑，5min后，再加入2ml 7.5%碳酸鈉溶液，將其搖勻，避光靜置1h，在749nm處測吸光值，繪制標準曲線，吸光度A對濃度C的曲線方程：y=0.04478x+0.1334，R2=0.9998，線性良好.

2.2 單因素試驗

2.2.1 硫酸銨用量對雙水相體系的影響

固定無水乙醇3ml，蒸餾水3ml，蘋果多酚粗提液2ml，分別加入1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g、3.5g、4.0g的硫酸銨，在離心機中離心5min（2500r），分相后，讀取上下相體積，測定蘋果多酚在上，下相的吸光度，求出蘋果多酚的分配系數(shù)，相比，回收率，結(jié)果如圖1.

由圖1可以看出硫酸銨的加入量從1.0g增加到3.0g，蘋果多酚的提取率不斷增加，加入量大于3.0g，蘋果多酚的提取率開始下降.隨雙水相體系中硫酸銨質(zhì)量分數(shù)增加，蘋果多酚的分配系數(shù)和萃取率先增大后減小，當(dāng)硫酸銨用量達到3.0g時，其分配系數(shù)為9.47，萃取率為91.63%，均達到最高值.一方面是由于硫酸銨濃度增加，與乙醇爭奪水，水分子由上相轉(zhuǎn)移至下相，上相乙醇濃度增大，根據(jù)相似相溶，蘋果多酚更易溶解在上相，使分配系數(shù)和萃取率增大；另一方面硫酸銨用量增加了乙醇與酚類物質(zhì)之間氫鍵萃合物的生成，提高了分配系數(shù)和上相萃取率.但是當(dāng)加入的硫酸銨太多時，過多的無機鹽影響體系整體的萃取能力，并且硫酸銨太多，達到它的飽和溶液濃度，會有晶體析出，浪費試劑.因此，在綜合考慮提取效果和綠色環(huán)保這兩方面因素，選擇硫酸銨用量為3.0g.

圖1 硫酸銨用量對蘋果多酚回收率的影響Fig.1 The influence of ammonium sulfate dosage of apple polyphenol recovery

2.2.2 乙醇濃度對雙水相體系的影響

固定硫酸銨3.0g，蒸餾水3ml，蘋果多酚粗提液2ml，分別加入30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇以及無水乙醇3ml，在離心機中離心5min（2500r），分相后，讀取上下相的體積，測定蘋果多酚在上，下相的吸光度，求出蘋果多酚的分配系數(shù)，相比，回收率，結(jié)果如圖2.

圖2 乙醇濃度對蘋果多酚回收率的影響Fig.2 The influence of ethanol concentration of apple polyphenol recovery

由圖2 可知，隨著乙醇濃度的增加，蘋果多酚的分配系數(shù)和萃取率先增大后減小.在乙醇濃度為60%～70%之間上升趨勢尤為明顯，當(dāng)乙醇濃度為70%時，蘋果多酚的提取率達到最高，其原因是當(dāng)體系中乙醇濃度增加使體系中更多的水分趨于上相，導(dǎo)致相比R增大.隨著乙醇濃度繼續(xù)增加蘋果多酚提取率明顯下降.其原因一方面可能是由于溶劑與多酚極性差異增大，根據(jù)相似相溶原理，多酚得不到充分溶解，提取率反而減少；另一方面，可能是隨乙醇濃度的增加，當(dāng)超過70%之后，高濃度乙醇使天然產(chǎn)物發(fā)生變性，使蘋果多酚的萃取率反而下降.因此，蘋果多酚提取的最適乙醇濃度為70%.

2.2.3 溫度對雙水相體系的影響

固定硫酸銨3.0g，70%無水乙醇3ml，蒸餾水3ml，蘋果粗提液2.0ml，分別設(shè)置溫度為20、30、40、50、60℃，在離心機中離心5min（2500r），分相后，讀取上下相的體積，測定蘋果多酚在上下相的吸光度，求出蘋果多酚的分配系數(shù)，相比，回收率，結(jié)果如圖3.

由圖3可以看出，溫度在30℃～50℃之間變化趨勢很明顯，在30℃～40℃之間陡峭上升，萃取溫度為40℃時，蘋果多酚的提取率達到最高值為92.92%.這是因為溫度主要通過影響硫酸銨溶解度，從而影響蘋果多酚在上、下相的分配.隨著溫度的增加，硫酸銨溶解度增加，更有利于上下相分相.當(dāng)溫度超過40℃時，多酚提取率減小了，因為溫度過高，多酚氧化、聚合等原因?qū)е露喾犹崛÷式档?因此，蘋果多酚提取的最佳溫度為40℃.

圖3 溫度對蘋果多酚回收率的影響Fig.3 The influence of temperature on the apple polyphenols recovery

2.3 響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化工藝條件

2.3.1 Box-Benhnken實驗設(shè)計（BBD）方案的確定

綜合單因素實驗結(jié)果，選擇硫酸銨用量（A）、乙醇濃度（B）以及萃取溫度（C）三個因素所確定的水平范圍，使用Design-Expert8.0.6 軟件設(shè)計響應(yīng)面實驗，選擇Box-Behnken 試驗設(shè)計，以多酚的提取率為響應(yīng)值，進行三因素三水平共17個試驗點的響應(yīng)面分析試驗.實驗結(jié)果見表1

表1 設(shè)計方案及結(jié)果Table 1 Design scheme and results

2.3.2 回歸模型的建立與顯著性檢查

利用Design-Eepert軟件對表1試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸擬合，建立二次多元回歸方程，對該方程的回歸分析與方差分析結(jié)果見各因素經(jīng)多元回歸擬，得到回歸方程=-225.66500+89.97875A+4.93963B+0.72900B-0.28075AB-0.017000BC+0.015400BC-11.58625A2-0.032413B2-0.024587C2，對此模型的回歸方程方差分析見表2.

表2 回歸模型的方差分析Table 2 Variance Analysis of regression Modle

響應(yīng)面模型分析結(jié)果中顯示：該模型的F值為306.21，p＜0.0001，說明獲得的回歸方程極顯著，即該模型在整個的回歸區(qū)域內(nèi)擬合的很好；模型的多元相關(guān)系數(shù)模型的多元相關(guān)系數(shù)R2＝0.9975，說明模型的相關(guān)性較好，預(yù)測模型擬合程度高，能很好地預(yù)測實際的處理效果；模型校正決定系數(shù)RAdj2＝0.9942，說明該模型可以解釋84.6%的響應(yīng)值變化，實驗誤差小，數(shù)據(jù)合理.

由表2可知，此模型是極顯著的（P＜0.0001），不同處理間的差異高度顯著.模型失擬項不顯著，模型的決定系數(shù)R2=0.9975，說明模型響應(yīng)值變化的99.75%來源于所選變量，實驗誤差較小，該模型是合適的.此模型與實驗數(shù)據(jù)擬合程度和可信度較高，因此可以用此分析和預(yù)測蘋果多酚得率的變化.回歸方程方差分析中各變量的P值表明：一次項B，C，二次項A2，B2，C2和交互項AB，對響應(yīng)值（Y）的影響極顯著（P＜0.01），其中，一次項B、C，二次項A2、B2、C2以及交互相AB的p值均小于0.0001.說明B、C對響應(yīng)值的線性效應(yīng)極顯著，AB對響應(yīng)值的交互影響極顯著，A2、B2、C2對響應(yīng)值的曲面效應(yīng)極顯著.交互項BC的p值是0.0007（p＜0.01），說明BC對響應(yīng)值的交互影響顯著.A對響應(yīng)值的線性效應(yīng)不顯著，AC對響應(yīng)值的交互影響不顯著.

2.3.3 響應(yīng)面分析

為了進一步考察3個試驗因子：硫酸銨用量（A）、乙醇濃度（B）及提取時間（C）的交互作用以及確定最優(yōu)點，對回歸模型采用降維法分析，即可得到兩因子的回歸模型，并通過Design-Expert 軟件繪制出響應(yīng)面曲線圖來進行直觀的分析.直觀地反應(yīng)出兩變量交互作用的顯著程度.極值條件出現(xiàn)在等高線的圓心處，等高線圖最圓，說明它們之間相互作用對蘋果中多酚的提取率的影響最大；而等高線圖越扁平，表示因素之間的相互影響越小.圖4-6顯示了以蘋果多酚提取率為響應(yīng)值的趨勢圖.

圖4 顯示硫酸銨用量與乙醇濃度對蘋果多酚提取率的交互作用，隨著硫酸銨用量和乙醇濃度的增大，提取率逐漸升高，當(dāng)達到最適條件后，再增加硫酸銨用量和升高溫度，提取率下降；圖5顯示硫酸銨用量和溫度對蘋果多酚提取率的交互作用，隨著硫酸銨用量的增加和溫度的上升，蘋果多酚提取率逐漸上升，最后趨于穩(wěn)定，達到較高點后又緩慢下降；圖6顯示溫度和乙醇濃度對蘋果多酚提取率的交互作用，隨著乙醇濃度和溫度的升高，蘋果中多酚的含量增加，最后趨于穩(wěn)定.綜合以上情況可以得出，硫酸銨用量與乙醇濃度、溫度之間交互作用較顯著，乙醇濃度與溫度之間交互作用不顯著.

圖4 硫酸銨用量和乙醇濃度對蘋果多酚提取率的交互作用Fig.4 Ammonium sulfate dosage and concentration of ethanol for apple polyphenols extraction yield of interaction

圖5 硫酸銨用量和溫度對蘋果多酚提取率的交互作用Fig.5 Ammonium sulfate dosage and temperature on the apple polyphenol extraction yield of interaction

圖6 乙醇濃度和溫度對蘋果多酚提取率的交互作用Fig.6 The ethanol concentration and temperature on the apple polyphenols extraction yield of interaction

通過Design-Expert 軟件分析，建立了一個以蘋果多酚提取率為目標值，以硫酸銨用量、乙醇濃度、溫度為因子的數(shù)學(xué)模型. 通過對回歸方程的優(yōu)計算，得出最優(yōu)提取工藝條件為：硫酸銨用量為3.07g，乙醇濃度為73.61%，溫度為40℃.考慮到實際操作的影響，將各因子進行修正：硫酸銨用量為3.1g，乙醇濃度為70%，萃取溫度為40℃.

2.4 蘋果多酚對血清膽紅素的影響

2.4.1 同一濃度蘋果多酚對血清膽紅素的影響

在最佳優(yōu)化工藝條件下，分別萃取40g/2ml、60g/2ml、80g/2ml、100g/2ml中的蘋果多酚，選取異常血清膽紅素按1：1混合，在同一時間測定血清膽紅素的濃度，與初始濃度相比，在80g/2ml萃取的蘋果多酚對血清膽紅素的影響比較明顯結(jié)果見圖7.

圖7 不同濃度蘋果多酚在同一時間對血清膽紅素的影響Fig.7 Different concentrations of apple polyphenols on at the same time the influence of serum bilirubin

以80g/2ml 中萃取蘋果多酚樣品，選取異常血清膽紅15例，然后按1：1與異常膽紅的血清樣本混合，體外37℃孵化，分別在0h，0.5h，1h，2h，4h，6h，根據(jù)釩酸鹽氧化法，用全自動生化分析儀分別測定總膽紅素、結(jié)合膽紅素的濃度，計算未結(jié)合膽紅素的濃度.取其平均值，以時間為橫坐標，以濃度為縱坐標.結(jié)果如圖8、9、10所示：同一濃度的蘋果多酚可使未結(jié)合膽紅素、總膽紅素的濃度下降，結(jié)合膽紅素的影響不明顯.Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，未結(jié)合膽紅素、總膽紅素濃度呈正相關(guān)（r分別為為0.994～0.996，0.610～0.993，P均小于0.05），結(jié)合膽紅素濃度無明顯的相關(guān)性（r為0.335～0.662，P＞0.05），結(jié)果見表3.

表3 不同時間三種血清膽紅素濃度（x±s，μmol/L，n＝15）及相關(guān)性分析結(jié)果Table 3 Three kinds of serum bilirubin concentrations and related parameters at different time points

圖8 同一濃度蘋果多酚對未結(jié)合膽紅素的影響Fig.8 The same concentration of apple polyphenols have not combined with the effect of bilirubin

圖9 同一濃度蘋果多酚對結(jié)合膽紅素的影響Fig.9 The same concentration of apple polyphenols have combined with the effect of bilirubin

圖10 同一濃度蘋果多酚對總膽紅素的影響Fig.10 The same concentration of apple polyphenol effects on total bilirubin

3 結(jié)論

在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析，建立了萃取蘋果多酚的乙醇-硫酸銨雙水相體系，最佳萃取條件為：硫酸銨3.1g，乙醇濃度為70%，萃取溫度為40℃，該方法綠色、易操作、萃取率高.蘋果多酚可使血清中總膽紅素和未結(jié)合膽紅素的濃度下降，為進一步研究蘋果多酚與其機制及探尋新藥奠定理論基礎(chǔ).