基于ESR和比色法的美拉德產(chǎn)物抗氧化活性對比研究

章銀良，黃天琪，郭浩彬，王悅，王明雷，陳科宇

(鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院，鄭州 450001)

美拉德反應產(chǎn)物(Maillard reaction products，MRPs)是指美拉德反應(Maillard reaction，MR)，即在一定條件下含羰基的碳水化合物與含氨基的氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)之間的兩種基團發(fā)生縮合反應，形成的棕黑色聚合產(chǎn)物[1-2]。MRPs中含有抗氧化活性的還原酮、呋喃、類黑精等物質(zhì)[3-5]。在食品加工過程中，合理利用好MRPs的天然抗氧化活性可以極大地提高食品安全性能、食品貯藏期、抗氧化活性等[6-7]。

目前有許多方法與指標已經(jīng)應用于食品中抗氧化活性的檢測，最常用的為通過抗氧化活性物質(zhì)清除自由基能力來反映食品的抗氧化性強弱[8]。電子自旋共振技術(shù)(electron spin resonance，ESR)是一種快速、簡單、直接的方法，能以譜圖的形式直接反映自由基的種類及數(shù)量[9]。研究者們發(fā)現(xiàn)選用比色法測定樣品的抗氧化活性容易受到樣品本身的影響。如臧爽[10]發(fā)現(xiàn)，藍莓、黑布林本身的顏色能影響紫外分光光度計法對于樣品抗氧化活性檢測的準確性。郭學文等[11]發(fā)現(xiàn)，番茄紅素與DPPH在517 nm處都具有較強吸收值，使得紫外法所測結(jié)果不準確。目前對于MRPs的抗氧化性研究多采用UV法檢測，而隨著美拉德反應條件的不同，MRPs褐變程度也截然不同[12-13]，這一差異極有可能會干擾到我們對于最優(yōu)條件的判斷，因此利用ESR法對MRPs抗氧化活性進行檢測并和紫外分光光度計法進行比較有利于我們更好地判斷MRPs抗氧化活性能力大小，為深入研究MRPs抗氧化活性提供了參考依據(jù)。

1 材料、設備與方法

1.1 試劑與材料

D-核糖(AR)、L-阿拉伯糖(AR)、L-精氨酸(AR)、L-賴氨酸(AR)、L-甘氨酸(AR)：北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉(AR)、無水乙醇(AR)：天津市永大化學試劑有限公司；鹽酸：煙臺市雙雙化工有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基 (DPPH)(AR)：進口試劑。

1.2 儀器設備

SQP電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；E-scan Bruker電子順磁共振波譜儀 德國布魯克科技(北京)有限公司；FE20 pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；HH-1智能型數(shù)顯恒溫油浴槽、HH-S水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司；T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Tecan Spark 20M多功能微孔板讀數(shù)儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 MRPs的制備

將實驗樣品依次分為時間組、pH組、溫度組和比例組，制備美拉德反應產(chǎn)物的具體操作如下。

1.3.1.1 時間組

準確稱量阿拉伯糖和賴氨酸各12.5 g(質(zhì)量比為1∶1)，溶解于450 mL的去離子水中，并分別用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH至10.0，然后用去離子水定容至500 mL，混合均勻。用移液槍吸取10 mL反應液轉(zhuǎn)移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴實后，置于100 ℃恒溫油浴槽中反應20，40，60，80，100，120，140，160,180，200 min。每組反應平行2次，反應結(jié)束后快速置于冰水中冷卻并進行相關測定，剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 pH組

準確稱量阿拉伯糖和賴氨酸各1.25 g(質(zhì)量比為1∶1)，溶解于45 mL的去離子水中，并分別用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，然后用去離子水定容至50 mL，混合均勻。用移液槍吸取10 mL反應液轉(zhuǎn)移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴實后，置于100 ℃恒溫油浴槽中反應1 h，每組反應平行2次。反應結(jié)束后快速置于冰水中冷卻并進行相關測定，剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3 溫度組

準確稱量阿拉伯糖和賴氨酸各12.5 g(質(zhì)量比為1∶1)，溶解于450 mL的去離子水中，并分別用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH至10.0，然后用去離子水定容至500 mL，混合均勻。用移液槍吸取10 mL反應液轉(zhuǎn)移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴實后，分別置于40，60，80 ℃水浴鍋中反應1 h。量取10 mL反應液轉(zhuǎn)移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴實后，分別置于100，120，140 ℃恒溫油浴槽中反應1 h。再取50 mL反應液轉(zhuǎn)移至100 mL圓底燒瓶中，固定冷凝回流裝置于160，180，200 ℃恒溫油浴槽中反應1 h。反應結(jié)束后快速置于冰水中冷卻并進行相關測定，每組反應平行2次，剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.4 比例組

準確稱量阿拉伯糖和賴氨酸，使它們的質(zhì)量比分別為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1，溶解于45 mL的去離子水中，并分別用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH至10.0，然后用去離子水定容至50 mL，混合均勻。用移液槍吸取10 mL反應液轉(zhuǎn)移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴實后，置于120 ℃恒溫油浴槽中反應1 h。反應結(jié)束后快速置于冰水中冷卻并進行相關測定，每組反應平行2次，剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.5 種類組

準確稱量一種糖(D-阿拉伯糖、D-核糖)和一種氨基酸(L-賴氨酸、L-精氨酸、L-甘氨酸)各1.25 g，溶解于45 mL的去離子水中，并分別用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH至10.0，然后用去離子水定容至50 mL，混合均勻。用移液槍吸取10 mL反應液轉(zhuǎn)移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴實后，置于100 ℃恒溫油浴槽中反應1 h。反應結(jié)束后快速置于冰水中冷卻并進行相關測定，每組反應平行2次，剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DPPH自由基清除率的測定

1.3.2.1 ESR法測定MRPs抗氧化活性

吸取0.1 mL MRPs于具塞刻度管中，加入4.9 mL去離子水，配制成50倍稀釋液，渦旋振蕩。再吸取500 μL MRPs(等量去離子水溶液作為空白對照組)與2 mL 0.35 mmol/L DPPH于棕色具塞試管中振蕩,混合均勻。暗反應30 min后，立即放入電子順磁波譜儀的諧振腔中，待儀器自動調(diào)諧完畢后按開始測量。將掃描譜圖導入WinEPR-Processing中，對DPPH自由基的ESR譜圖進行二重積分(積分區(qū)域為(3450±0.01)～(3525±0.01) G)，將測量的二重積分值記為As。在相同操作條件下，以0.5 mL去離子水代替0.5 mL稀釋后的樣品溶液，作為空白組，并記錄其二重積分值，記為Ac。美拉德反應產(chǎn)物對DPPH自由基的清除能力可由下式計算得出：

(1)

ESR測定條件：參考李輝等[14]的方法。頻率9.792069 GHz，功率5.00 mW，中心磁場3487 G，掃描寬度100 G，調(diào)制幅度2.27 G，調(diào)制頻率86.00 kHz，時間常數(shù)40.96，掃描時間83.88 s(20.97 s×4次)，橫坐標點數(shù)512，接收機增益為3.17×103。

1.3.2.2 紫外分光光度計法測定MRPs抗氧化活性

結(jié)合周紹琴等[15]、He等[16]的方法。取0.1 mL MRPs于具塞刻度管中，加入4.9 mL去離子水，配制成50倍稀釋液，振蕩搖勻。再取1 mL MRPs(等量去離子水溶液作為空白對照組)與4 mL 0.1 mmol/L DPPH于棕色具塞試管中振蕩，混合均勻。暗反應30 min后，記錄其在517 nm處的吸光度值為As?？瞻捉M在517 nm處的吸光度值記作Ac。MRPs對DPPH自由基的清除能力可由公式(1)得出。

1.3.2.3 多功能微孔板讀數(shù)儀(酶標儀)法測定MRPs抗氧化活性

用酶標儀測定空板在517 nm處的OD值，隨后吸取0.1 mL MRPs于具塞刻度管中，加入4.9 mL去離子水，配制成50倍稀釋液，渦旋振蕩。再吸取500 μL MRPs(等量去離子水溶液作為空白對照組)與2 mL 0.35 mmol/L DPPH于棕色具塞試管中振蕩，混合均勻。暗反應30 min后，吸取200 μL MRPs加入96孔板內(nèi)，所測得在517 nm處的OD值減去空板OD值記為As，空白組在517 nm處的OD值減去空板OD值記作Ac。MRPs對DPPH自由基的清除能力可由公式(1)得出。

酶標儀參數(shù)：溫度25 ℃、波長517 nm、無蓋。

1.3.3 MRPs吸光度值測定

取0.1 mL MRPs于具塞刻度管中，加入4.9 mL去離子水，配制成50倍稀釋液，振蕩搖勻。在517 nm處測量并記錄不同條件下MRPs的吸光度值。取不同種類的MRPs稀釋50倍，吸取200 μL加入至96孔板，用酶標儀測量不同波長范圍下的OD值。

1.3.4 標準曲線建立

以無水乙醇作為溶劑，配制0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mmol/L的DPPH溶液，按照1.3.2.1與1.3.2.3所述方法測量并建立ESR與酶標儀標準曲線。以無水乙醇作為溶劑，配制0.025，0.033，0.05，0.0667，0.075，0.1，0.2，0.3 mmol/L的DPPH溶液，按照1.3.2.2所述方法測量并建立紫外分光光度計標準曲線。

1.3.5 均勻?qū)嶒炓蛩厮皆O計

選取阿拉伯糖與賴氨酸組合，以DPPH自由基(DPPH·)清除率為檢測指標，應用酶標儀、ESR、紫外分光光度計對其進行抗氧化活性研究，采用 U10×(108)均勻?qū)嶒灡恚蛩厮揭姳?。

表1 U10×(108)均勻試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of U10×(108) uniform experiment

1.4 統(tǒng)計分析

所有實驗均做3次平行，采用WinEPR-Processing、Origin 8.0、Mathematics 4.0及其相關方法進行處理，并用SPSS軟件進行顯著性分析(差異顯著p<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線的建立

ESR、酶標儀、紫外分光光度計的標準曲線見圖1。

圖1 ESR(a)、多功能微孔板讀數(shù)儀(b)、 紫外分光光度計(c)標準曲線擬合圖Fig.1 Standard curve fitting diagrams of ESR (a), multifunctional microporous plate reader (b), UV spectrophotometer (c)

由圖1可知,DPPH濃度與ESR的強度和酶標儀、紫外分光光度計的OD值均具有良好的線性關系，3種儀器的相關性系數(shù)R2均大于0.98，線性方程依次為y=8.4596x+0.0317(ESR)，y=5.2145x-0.0072(酶標儀)，y=9.3812x+0.1072(UV)。因此從理論上來說，3種檢測儀器均可用于抗氧化活性研究。由圖1中b和c可知，紫外分光光度計法的相關系數(shù)大于酶標儀法，因此當選取的DPPH濃度較小時，應優(yōu)先選用紫外分光光度計法測量。

2.2 DPPH·清除率的測定

2.2.1 pH對DPPH·清除率的影響

pH對DPPH·清除率的影響關系圖見圖2。

圖2 pH對DPPH自由基清除率的影響關系圖Fig.2 Effect of pH on DPPH radical scavenging rate

由圖2可知，使用ESR測量的MRPs對DPPH·的清除率隨著pH值的增大而增大，在pH為12時達到最大，在酸性條件下(pH 3～7)，MRPs對DPPH·的清除率緩慢遞增且清除率非常低，當模擬體系進入到堿性后，MRPs對DPPH·的清除率迅速增大，說明堿性環(huán)境更加有利于MRPs中抗氧化活性物質(zhì)的生成。使用紫外分光光度計法與酶標儀法測量的結(jié)果與ESR法結(jié)果不一致，UV法與酶標儀法測量的MRPs對DPPH·的清除率隨著pH值的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢。相同性在于在酸性條件下(pH 3～7)，MRPs對DPPH·的清除率呈現(xiàn)緩慢遞增趨勢，使用紫外法測得的MRPs對DPPH·的清除率在pH為9時達到最大，之后呈現(xiàn)遞減趨勢。而使用酶標儀所測的MRPs對DPPH·的清除率在pH為10時達到最大，之后呈現(xiàn)遞減趨勢。這一差別可能來源于樣品自身OD值以及MRPs與DPPH反應后反應產(chǎn)物的OD值的影響。

2.2.2 反應溫度對DPPH·清除率的影響

反應溫度對DPPH·清除率的影響關系圖見圖3。

圖3 反應溫度對DPPH自由基清除率的影響關系圖Fig.3 Effect of reaction temperature on DPPH radical scavenging rate

由圖3可知，使用3種方法測量的MRPs對DPPH自由基的清除率隨著溫度的升高都呈現(xiàn)出先增大后穩(wěn)定的趨勢。當反應溫度為40～120 ℃時，MRPs對DPPH自由基的清除率隨著溫度的升高而增大，當反應溫度為120～200 ℃時，MRPs對DPPH自由基的清除率隨著溫度的升高而呈現(xiàn)穩(wěn)定的趨勢。這說明提高溫度有利于MRPs中抗氧化活性物質(zhì)的生成，并且MRPs中抗氧化活性物質(zhì)總量具有一定的穩(wěn)定性，可能存在兩種形式：一種形式為，隨著溫度提升到120 ℃以上，MRPs中抗氧化活性物質(zhì)不再生成，且具有極強的耐熱性，不會隨著反應溫度的提升而分解或者轉(zhuǎn)化；另一種形式為，當溫度提升到120 ℃以上時，MRPs中抗氧化活性物質(zhì)會隨著溫度的升高而分解或者轉(zhuǎn)化，但與此同時有新的抗氧化活性物質(zhì)在不斷生成，而生成的速率與分解或者轉(zhuǎn)化的速率一致，呈現(xiàn)出動態(tài)穩(wěn)定。使用酶標儀所測的MRPs對DPPH自由基的清除率在40～60 ℃時出現(xiàn)了負值，這可能是受到了樣品OD值的影響。

2.2.3 反應時間對DPPH·清除率的影響

反應時間對DPPH·清除率的影響關系圖見圖4。

由圖4可知，使用3種方法測量的MRPs對DPPH·的清除率隨著反應時間的延長都呈現(xiàn)出先增大后穩(wěn)定的趨勢。反應時間為20～120 min時，MRPs抗氧化活性物質(zhì)迅速生成。反應時間為120～200 min時，MRPs對DPPH·的清除率基本無明顯變化，說明 MRPs 中具有抗氧化活性的物質(zhì)形成于反應的初始階段，同時在后期的反應過程中，MRPs中具有抗氧化活性的物質(zhì)不會隨著反應時間的增長而分解，MRPs在模擬美拉德反應體系中具有一定的穩(wěn)定性。使用酶標儀所測得的MRPs對DPPH·的清除率在20 min時出現(xiàn)了負值，這可能是受到了樣品OD值的影響。

圖4 反應時間對DPPH自由基清除率的影響關系圖Fig.4 Effect of reaction time on DPPH radical scavenging rate

2.2.4 反應料液比對DPPH·清除率的影響

反應料液比對DPPH·清除率的影響關系圖見圖5。

圖5 料液比(阿拉伯糖∶賴氨酸)對DPPH自由基 清除率的影響關系圖Fig.5 Effect of solid-liquid ratio (arabinose∶lysine) on DPPH radical scavenging rate

由圖5可知，使用ESR法測量的MRPs對DPPH·的清除率隨著賴氨酸在反應體系中含量增大而升高，而使用UV法與酶標儀法所測結(jié)果與ESR法相反，即MRPs對DPPH·的清除率隨著賴氨酸在反應體系中含量增大而降低。使用紫外法研究的MRPs對DPPH自由基的清除率隨著阿拉伯糖在反應體系中含量增大而增大，而ESR法與酶標儀法則無規(guī)律，但是ESR法與酶標儀法所測得的結(jié)果更為接近。使用3種方法得出不同的結(jié)果，極有可能是MRPs與DPPH·反應后的反應產(chǎn)物在517 nm處具有很強的吸收值，而這類抗氧化活性物質(zhì)的生成可能與賴氨酸有關，使用UV法與酶標儀法測量的結(jié)果不一致在于DPPH含量不同，雖然酶標儀法原理與紫外法一致(即都以517 nm處的OD值反映DPPH·的含量)，但是由于酶標儀使用的DPPH含量更高，因此所受影響更小。

2.3 樣品OD值的測定

2.3.1 不同反應條件下MRPs OD值的測定

圖6 不同反應條件下MRPs OD值的變化關系曲線圖Fig.6 Change relation curves of OD values of MRPs under different reaction conditions

由圖6可知，不同條件的模擬體系下MRPs在517 nm處的吸光度值不同，隨著反應溫度、時間的增加，樣品OD值呈現(xiàn)先升高后穩(wěn)定的趨勢。反應溫度在40～120 ℃時，MRPs的OD值迅速增大，在120～200 ℃時，MRPs的OD值趨于穩(wěn)定。反應時間在20～100 min時，OD值急速增大，隨后隨著反應時間的延長，MRPs的吸光度值趨于穩(wěn)定。隨著pH值的增大，MRPs的吸光度值在不斷增大，在酸性條件下，MRPs的OD值增長較為緩慢，當模擬體系進入堿性條件時，MRPs的OD值迅速增大，在pH值為12時達到最大。隨著模擬體系中阿拉伯糖與賴氨酸的比例不同，MRPs的OD值也隨即變化。隨著反應條件的變化，MRPs自身的OD值呈現(xiàn)了不同的變化，這是影響比色法結(jié)果準確性的重要原因之一。

2.3.2 不同種類的MRPs對DPPH·清除率以及OD值的測定

為了驗證2.3.1的猜想，選取6種不同組合的糖和氨基酸，進行了MRPs OD值的測定。并且使用ESR法和紫外分光光度計法計進行對比，其中紫外分光光度計法測定的DPPH·清除率采用了扣除樣品OD值以及未扣除樣品OD值的兩種算法，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，ESR法測量不同種類模擬反應組合的MRPs對DPPH·的清除率由大到小依次為：核糖與賴氨酸>阿拉伯糖與賴氨酸>核糖與精氨酸>阿拉伯糖與甘氨酸>阿拉伯糖與精氨酸>核糖與甘氨酸。用紫外分光光度計法測量不同種類模擬反應組合的MRPs對DPPH·的清除率由大到小依次為：核糖與精氨酸>核糖與賴氨酸>阿拉伯糖與精氨酸>阿拉伯糖與賴氨酸>阿拉伯糖與甘氨酸>核糖與甘氨酸。減去樣品稀釋液吸光度值后計算不同種類模擬反應組合的MRPs對DPPH·的清除率由大到小依次為：阿拉伯糖與賴氨酸>阿拉伯糖與甘氨酸>核糖與甘氨酸>核糖與賴氨酸>核糖與精氨酸>阿拉伯糖與精氨酸，這一結(jié)果與紫外法相比，減去樣品吸光度值后計算的DPPH·清除率和ESR法測量的結(jié)果更為接近，但是依舊不同，可能是由于MRPs中具有抗氧化活性的物質(zhì)在和DPPH·反應后所生成的新產(chǎn)物在517 nm處依舊具有吸光度值。

圖 7 不同方法測定不同種類MRPs對DPPH·清除率Fig.7 Determination of DPPH· scavenging rate of different kinds of MRPs by different methods

圖8 不同種類的MRPs在不同波長處OD值變化曲線圖Fig.8 OD value variation curves of different kinds of MRPs at different wavelengths

由圖8可知，在517 nm處MRPs都具有一定的吸光度值，因此運用紫外分光光度計法測量自由基清除率容易受到MRPs自身的影響而造成實驗誤差。由圖中3個出峰位置觀察可知(A：阿拉伯糖與精氨酸、核糖與精氨酸；B：核糖與賴氨酸、阿拉伯糖與賴氨酸；C：阿拉伯糖與精氨酸、核糖與精氨酸)，MRPs產(chǎn)生的OD值極有可能與反應體系中的氨基酸類物質(zhì)有關，這一猜想需要進一步證實。

2.4 均勻?qū)嶒?/h3>

為了更好地對比3種儀器測量MRPs抗氧化活性的準確性，選取阿拉伯糖與賴氨酸組合，以DPPH自由基(DPPH·)清除率為檢測指標，應用酶標儀法、ESR法、紫外分光光度計法對其抗氧化活性進行均勻?qū)嶒?，結(jié)果見表2。

表2 均勻?qū)嶒灲Y(jié)果Table 2 Uniform experimental results

ESR法均勻?qū)嶒濵athmatics 4.0軟件分析：回歸方程的P值為0.008837，方程可靠；回歸方程為：Y=-31.2045-0.4127X1+12.0035X2-2.5427X3-0.1311X4+0.003888X1X4。

從回歸分析的顯著性分析可以看出，pH值(X2)對DPPH·清除率具有極顯著的影響，P值為0.00126；反應時間與反應溫度有一定的交互影響。

酶標儀法均勻?qū)嶒濵athmatics 4.0軟件分析：回歸方程的P值為0.035175，方程可靠；回歸方程為：Y=-64.3146+0.1509X1+3.4743X2-5.7622X3+0.4131X4。

從回歸分析的顯著性分析可以看出，反應溫度(X4)對DPPH·清除率具有極顯著的影響，P值為0.0095；反應時間(X1)、pH(X2)和料液比(X3)都不具有顯著影響。

紫外分光光度計法均勻?qū)嶒濵athmatics 4.0軟件分析：回歸方程的P值為0.00793，方程可靠；回歸方程為：Y=124.362+3.186X2X3+0.1083X2X4-19.6154X2-25.0783X3-0.3485X4。

從回歸分析的顯著性分析可以看出，pH(X2)、料液比(X3)以及pH(X2)與料液比(X3)之間的交互影響，pH(X2)與反應溫度(X4)之間的交互影響，對DPPH·清除率具有顯著的影響，P值分別為0.0145，0.020，0.0244，0.02136。

結(jié)合上述均勻?qū)嶒灲Y(jié)果以及研究實際情況得到優(yōu)化水平組合，見表3。

表3 3種方法均勻?qū)嶒瀮?yōu)化水平結(jié)果Table 3 Results of the uniform experimental optimization level of the three methods

由表2可知，紫外法和酶標儀法的DPPH·有負數(shù)存在，即加入MRPs后生成了DPPH·，這顯然不符合實際情況。且出現(xiàn)負數(shù)的組多為pH較大的組，這與pH的單因素實驗結(jié)果類似，因此pH值越高，越有利于在517 nm處有較強吸光度的反應產(chǎn)物生成或者是MRPs中某類物質(zhì)在堿性條件下轉(zhuǎn)化成具有較強吸光度值的物質(zhì)，這一猜想有待于進一步研究。

由表3可知，3種方法優(yōu)化的結(jié)果不同，且最優(yōu)條件差異較大。ESR法、酶標儀法、紫外法3種方法優(yōu)化結(jié)果的相對誤差分別為1.95%、504.31%、3.41%。因此從優(yōu)化結(jié)果來看，3種方法的準確性為ESR法>紫外法>酶標儀法。從最優(yōu)條件分析，酶標儀法與紫外法優(yōu)化都需要高溫和較長時間，而ESR法最優(yōu)條件的反應溫度和反應時間都很合理，因此ESR法優(yōu)于另外兩種方法。

3 結(jié)論

本實驗以阿拉伯糖與賴氨酸為美拉德反應模型，運用ESR法、紫外分光光度計法、酶標儀法測量了不同反應時間、反應溫度、料液比、pH下得到的MRPs對DPPH·的清除能力大小，通過單因素實驗發(fā)現(xiàn)，3種方法所測得的反應時間、反應溫度的結(jié)果基本保持一致，在酸性條件下3種方法所測得的結(jié)果也基本一致，但是用3種方法測得的堿性條件和不同糖和氨基酸比例組的結(jié)果不同。

對此可以做出以下假設：美拉德反應產(chǎn)物中具有抗氧化活性的物質(zhì)是一種復雜的物質(zhì)。在這類物質(zhì)中有一類物質(zhì)能夠與DPPH結(jié)合，且結(jié)合后的產(chǎn)物在517 nm處具有極強的吸光度信號，這類物質(zhì)在pH值越大時生成量也越大，且與糖和氨基酸的比例有關，因此以吸光度值來衡量MRPs與DPPH反應前后濃度變化就會有很大的誤差，且反應后反應物的OD值占據(jù)主要變化，因此扣除樣品OD值也不能完全保證實驗結(jié)果的準確性，在尋找MR最優(yōu)條件時也會因為這一誤差而導致結(jié)果不準確，因此ESR法更適合于尋找MR最優(yōu)條件以及抗氧化活性的研究。比色法(紫外法、酶標儀法)極有可能不適合MRPs最優(yōu)條件的優(yōu)化實驗，而只適用于同一反應條件下MRPs抗氧化活性的對比研究。