基于轉錄組測序技術探討復方蛇龍膠囊治療膜性腎病大鼠潛在機制

賈世艷，仲啟明，司瑞花，范曉陽，嚴文允，劉光珍

(1.山西中醫(yī)藥大學，山西 晉中 030619；2.山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原 030012)

膜性腎病(Membranous nephropathy,MN)是成人腎病綜合征的主要病因之一，僅次于發(fā)病率最高的IgA腎病，目前已成為我國腎病的主要類型[1-2]。MN臨床常表現(xiàn)為腎病綜合征，以大量蛋白尿并伴有低蛋白血癥為主要表現(xiàn)，如不及時治療，還有向終末期腎功能衰竭和尿毒癥轉歸的危險[3-5]。目前MN主要以糖皮質激素、免疫抑制劑為治療手段，但是療效較差，復發(fā)率高，極易引發(fā)嚴重的不良反應[6]。

近年來，中藥復方治療MN效果顯著，安全性高，不良反應少，愈來愈受到臨床的重視[7-8]。復方蛇龍膠囊是劉光珍教授總結多年治療慢性腎臟疾病的臨床經(jīng)驗，在“清熱利濕，活血化瘀”組方理論基礎上形成的，臨床療效確切，能明顯改善MN大鼠蛋白尿等相關指標，保護腎小球的功能與結構[9-11]。為進一步揭示復方蛇龍膠囊作用機制，本研究通過構建陽離子化牛血清白蛋白(Cationic bovine serum albumin,C-BSA)誘導膜性腎病大鼠模型，采用高通量轉錄組測序技術，對復方蛇龍膠囊治療MN的潛在分子機制進行系統(tǒng)性揭示，不僅對復方蛇龍膠囊的臨床應用提供研究基礎，同時能夠加深對MN發(fā)病機制的理解。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SD大鼠，SPF級，雄性，體重160～180 g，6周齡，共40只，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，合格證號：SCXK(京)2017-0005，實驗方案符合山西省中醫(yī)藥研究院動物倫理要求。

1.1.2 藥物與制備：復方蛇龍膠囊由穿山龍(批號20191101)、鬼箭羽(批號20190901)和白花蛇舌草(批號20190801)組成，均購自山西省中醫(yī)院藥房。將上述3味中藥加10倍水煎煮2次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.23～1.28(80 ℃)的清膏，真空干燥，粉碎成粗粉，備用。

1.1.3 主要試劑與儀器：C-BSA(批號102062773)；一水乙二胺(批號6780-13-8)；弗氏不完全佐劑(批號344291)；Forma -80 ℃冰箱(美國Thermo Scientific)。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模制備、動物分組及給藥：大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，進行24 h尿蛋白定量，剔除大于5 mg的蛋白尿陽性大鼠，模型制備參照改良Border法[12]，預免疫階段，取C-BSA 1 mg溶解于0.5 ml 0.9%氯化鈉溶液中，與等量弗氏不完全佐劑在注射器中來回推動充分乳化成乳白色的懸濁液后，大鼠頸背部、腹股溝和腋下等多點皮下注射0.1 ml，隔日1次，共3次；正式免疫階段，將C-BSA與等體積的磷酸鹽緩沖液混勻，大鼠尾靜脈注射，注射劑量16 mg/kg，每周3次，連續(xù)4周。將造模大鼠隨機分為模型組和復方蛇龍膠囊高、中、低劑量組，每組10只，模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，給藥劑量根據(jù)人與大鼠的體表面積換算成等效給藥劑量[13]；復方蛇龍膠囊高、中、低劑量組分別給予1.5、0.75、0.375 g/kg復方蛇龍膠囊，每天1次，連續(xù)8周。

1.2.2 腎組織樣本采集：末次給藥24 h后，嚴格遵守實驗動物操作規(guī)程麻醉大鼠，快速完整采集各組大鼠腎臟組織，濾紙吸去多余水分，組織采用液氮速凍后轉-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 轉錄組測序及數(shù)據(jù)分析：腎組織高通量轉錄組測序采用華大基因公司(深圳)BGISEQ-500測序平臺完成。采用Qiagen RNeasy Micro kit試劑盒提取腎組織總RNA，Nano Drop和Agilent 2100生物分析儀對提取的總RNA進行合格定量，構建mRNA文庫。測序完成后，采用SOAPnuke對測序數(shù)據(jù)進行過濾，HISAT將clean reads與GCF_000001895.5_Rnor_6.0大鼠基因組進行比對和注釋，Bowtie 2對參考編碼基因進行校正，RSEM計算各個樣品的基因表達水平。

1.2.4 差異表達基因分析：使用PossionDis算法進行差異表達基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)篩選，篩選標準為：log2基因表達差異倍數(shù)(Fold change,FC)絕對值≥2.00，F(xiàn)DR≤0.001，對DEGs進行后續(xù)的基因本體論功能(Gene Ontology,GO)功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)生物通路富集分析。

1.2.5 GO功能和KEGG富集分析：使用Blastx對Unigene進行KEGG注釋，Blast2 GO以及NR注釋結果進行GO注釋，GO和KEGG富集分析采用R語言中phyper函數(shù)，Q值≤0.05認為在候選基因中顯著富集。

1.2.6 建立復方蛇龍膠囊治療MN機制中蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(Protein-protein interaction,PPI)和篩選關鍵基因：將DEGs上傳至STRING在線數(shù)據(jù)庫，設置相互作用可信區(qū)間為中度(Medium confidence 0.400)，繪制差異表達基因PPI網(wǎng)絡圖，把STRING數(shù)據(jù)庫計算結果導入Cytoscape 3.8.2軟件，利用Cytoscape-hubba插件篩選出PPI網(wǎng)絡中處于關鍵位置的前10個基因。

2 結 果

2.1 確定DEGs篩選結果 當|log2FC|≥2.00，F(xiàn)DR≤0.001時，與模型組相比，復方蛇龍膠囊低劑量組腎組織中顯著表達DEGs共1353個，其中上調(diào)基因1039個，下調(diào)基因314個；復方蛇龍膠囊中劑量組腎組織中顯著表達DEGs共1410個，其中上調(diào)基因1089個，下調(diào)基因321個；復方蛇龍膠囊高劑量組腎組織中顯著表達DEGs共1575個，其中上調(diào)基因833個，下調(diào)基因742個。將上述3組數(shù)據(jù)進行交叉比對，得到685個共表達顯著差異基因，其中535個上調(diào)基因，150個下調(diào)基因。見圖1。

圖1 不同劑量組篩選出的差異表達基因韋恩圖分析

2.2 差異表達基因的GO和KEGG富集分析 GO功能主要分為細胞組分(Cellular component,CC)、生物過程(Biological process,BP)和分子功能(Molecular function,MF)三大類別。對535個共表達上調(diào)基因和150個共表達下調(diào)基因分別進行GO功能和KEGG富集分析。GO功能富集分析顯示，顯著上調(diào)基因主要富集在細胞膜結構，參與細胞粘附、正向調(diào)控細胞遷移和鈣離子結合等生物過程；顯著下調(diào)基因主要富集在細胞膜組分，參與調(diào)控跨膜運輸過程和跨膜轉運蛋白活性。KEGG富集分析結果顯示，顯著差異表達基因主要富集在PI3K/Akt和MAPK信號通路，按Q值≤0.05視為顯著富集，展示前5個條目。見表1、2。

表1 上調(diào)差異基因的GO功能和KEGG信號通路富集

表2 下調(diào)差異基因的GO功能和KEGG信號通路富集

2.3 DEGs的PPI網(wǎng)絡分析結果 利用STRING在線數(shù)據(jù)庫，預測685個共表達顯著差異基因的蛋白質相互作用，構建了一個由501個節(jié)點和1283條邊組成的共表達網(wǎng)絡(刪除網(wǎng)絡中不連接的基因)。利用Cytoscape軟件對PPI進行可視化分析，應用Cytoscape-hubba插件篩選出網(wǎng)絡中的關鍵基因，由多種模式算法結果；按連接度(Degree)模式篩選出前10個關鍵基因，分別是Egfr、Fn1、Rac3、Frk、Cdh1、Agt、Hspg2、Itga8、Akt3和Fgfr2。見表3(圖2)。

表3 PPI網(wǎng)絡核心基因連通度統(tǒng)計結果

圖2 PPI網(wǎng)絡Degree模式下前10個基因連通度

2.4 關鍵基因生物學功能分析 GO功能富集分析顯示關鍵基因主要富集在細胞膜表面及間質，參與跨胞外基質組織及黏附過程，調(diào)控激酶活性；KEGG富集分析結果顯示關鍵基因主要富集在PI3K/Akt信號通路，按Q值≤0.05視為顯著富集，展示前5個條目。見表4。

3 討 論

近年來，MN的患病率逐年上升，其發(fā)病機制復雜，盡管對癥治療能夠緩解部分臨床癥狀，但約30%的患者進展到終末期腎臟疾病，最終依賴腎透析，嚴重影響生活質量，因此尋求更加安全有效的治療藥物來延緩疾病進展、改善預后成為亟需解決的難點[14]。中藥復方成分復雜，作用靶點及通路眾多，有必要從整體上闡釋中藥復方的作用機制，提升中藥復方的科學內(nèi)涵。本研究采用轉錄組測序技術，探討復方蛇龍膠囊對MN大鼠腎組織中DEGs表達的影響，結合生物信息學分析，旨在為復方蛇龍膠囊治療MN的深入研究提供思路。

Itga8屬于整合素家族，主要表達于腎系膜細胞，為腎毛細血管內(nèi)皮提供機械穩(wěn)定和功能支持，可調(diào)控細胞基質黏附、凋亡和自噬等生物學過程，是維持腎小球穩(wěn)態(tài)的重要分子，表達水平可作為腎小球疾病預后的危險分層標志物[15]。目前，研究證實腎足細胞損傷是參與各種原發(fā)性或繼發(fā)性腎小球疾病等腎病綜合征進展的關鍵因素，足細胞數(shù)量減少和細胞結構損傷是不可逆的，是促進MN惡性生物學進展的重要因素[16-17]。研究表明，足細胞可表現(xiàn)出較高的基礎自噬活性，對維持足細胞結構、功能以及代謝穩(wěn)態(tài)有重要的調(diào)控作用，足細胞自噬調(diào)控異常是足細胞損傷的關鍵因素[18]。Rac3屬于Rac蛋白家族，對細胞分化、增殖、凋亡和自噬等行為具有重要的調(diào)控功能，細胞自噬和凋亡是細胞程序性死亡的重要機制，自噬-凋亡動態(tài)平衡對MN的發(fā)生發(fā)展具有重要影響。研究表明Rac3表達水平升高能夠通過NF-κB信號通路抑制細胞凋亡和自噬[19]。成熟的足細胞是終末分化的上皮細胞，無法通過細胞增殖來補充細胞數(shù)量，因此復方蛇龍膠囊可能通過抑制細胞凋亡減輕MN大鼠足細胞損傷。Agt是合成所有血管緊張素多肽所必需的底物，循環(huán)中的Agt不能通過腎小球濾過屏障，而尿Agt主要來源于腎臟，因此尿Agt水平能夠反映腎臟纖維化的情況，可能作為腎臟損傷尤其是慢性腎損傷程度的指標[20]，因此推測復方蛇龍膠囊通過降低腎臟中Agt表達水平，進而減輕腎損害。

針對關鍵基因的KEGG信號通路富集分析結果顯示，復方蛇龍膠囊治療MN主要通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路，從而影響足細胞細胞增殖、自噬和凋亡等生物學過程。Akt是PI3K的直接靶基因，處于信號通路的中心環(huán)節(jié)，外界因素通過激活PI3K而使Akt磷酸化。研究表明，激活PI3K/Akt信號通路能夠上調(diào)足細胞自噬作用，抑制細胞凋亡，從而保護腎小球足細胞并改善蛋白尿[21]。

表4 前10個關鍵基因的GO功能和KEGG信號通路富集

本研究結果顯示，復方蛇龍膠囊組Egfr、Fgfr2、Akt3表達水平明顯上升，提示復方蛇龍膠囊可能通過細胞表面受體Egfr和Fgfr2激活Ras蛋白，導致磷酸化級聯(lián)反應進而激活PI3K/Akt信號通路，提高足細胞自噬水平，加速對受損細胞器、蛋白質的清除，促進足細胞修復，從而保護足細胞。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)復方蛇龍膠囊可能通過PI3K/Akt信號通路，調(diào)控Akt3等關鍵基因表達，誘導足細胞自噬水平升高，抑制足細胞損傷，為復方蛇龍膠囊治療MN提供了實驗依據(jù)。本研究得出的結論未通過相關基礎研究予以驗證，有待后續(xù)進一步研究。