基于NF-κB/TGF-β1/Smad3信號通路研究通腑活血方防治腸粘連作用機(jī)制

羅 慧，閆曙光，魏海梁，陳志國

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

腸粘連是指腸管與腸管、腹膜、腹腔內(nèi)臟器之間發(fā)生的異常黏附，是腹腔、盆腔手術(shù)后的常見并發(fā)癥[1-2]。由炎癥引起的纖維組織異常增生是腸粘連的重要發(fā)病機(jī)制，因此臨床防治腸粘連主要以抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)纖維蛋白原溶解、在粘連好發(fā)部位建立局部生物屏障等為主，以上方法可取得一定的臨床療效，但不能完全預(yù)防腸粘連的發(fā)生，因此腸粘連及其導(dǎo)致的腸梗阻是外科手術(shù)后的重要難題[3]。鑒于此，課題組近年來把多學(xué)科治療術(shù)后腸粘連作為主要研究方向，采用中醫(yī)藥治療術(shù)后腸粘連，取得了較好的臨床效果。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用通腑活血方治療后，術(shù)后腸粘連患者的腹脹、腹痛癥狀明顯改善，住院時(shí)間縮短，生活質(zhì)量顯著提高[4]。為進(jìn)一步明確通腑活血方防治術(shù)后腸粘連的作用機(jī)制，本研究聚焦腸粘連發(fā)生、發(fā)展的使動因素——以免疫細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子誘發(fā)的初始炎癥，以在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)/轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smad3炎癥通路為切入點(diǎn)，探討通腑活血方防治術(shù)后腸粘連的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：清潔級雄性SD大鼠48只，體重(200±20)g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號：SCXK(川)2015-030，均飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：通腑活血方由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一購買，符合中華人民共和國藥典(Ⅰ部)要求，組方：大黃、醋莪術(shù)、制川烏、乳香、沒藥、丁香、艾葉各5 g，常規(guī)煎煮濃縮后備用。BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0010)，兔抗鼠核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白(Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IκB)一抗(批號：bs-1287R)，兔抗鼠磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65 (Nuclear factor kappa-Bp65,p-NF-κB p65)一抗(批號：10745-1-AP)，兔抗鼠TGF-β1、Smad3一抗(批號：AF2002、AF2006)，兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(Tissue inhibitor of metalloproteinases-1,TIMP-1)、兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)一抗(批號：DN2432、DN2125)，羊抗兔二抗(批號：BA1054)，NF-κB、TGF-β1、Smad3引物設(shè)計(jì)與合成由北京擎科生物科技有限公司提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：全自動酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)，CR22GⅡ型高速低溫離心機(jī)(日本日立公司)，熒光定量Real-time PCR儀(美國ABI公司)，全自動凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，SuperMiro SM-100超微量分光光度計(jì)(英國Biochrom公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組：雄性SD大鼠48只，以隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、通腑活血方組、幾丁糖組，每組12只。

1.2.2 模型建立及給藥：術(shù)后腸粘連大鼠模型的建立標(biāo)準(zhǔn)如下[5]。除對照組外，各組大鼠禁食12 h后，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉。大鼠仰臥固定，腹部脫毛后皮膚消毒，鋪無菌巾，于下腹部正中部位剪開約2 cm切口，提出盲腸，置于無菌紗布上直至使?jié){膜干燥后，用刀片輕刮整個漿膜直至出現(xiàn)輕度滲血，用無水酒精滴于創(chuàng)面上以進(jìn)一步破壞漿膜層，然后血管鉗夾住盲腸系膜動脈約2 min，造成暫時(shí)局部缺血。后將盲腸回納入腹腔原位后以止血鉗在盲腸對應(yīng)腹壁處造成局部損傷，分別縫合腹壁和皮膚，關(guān)腹，造模完成；幾丁糖組大鼠在造模基礎(chǔ)上，關(guān)腹時(shí)盲腸創(chuàng)面局部涂抹幾丁糖；通腑活血方組關(guān)腹后給予通腑活血方灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃8 d。

1.2.3 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察：取病變結(jié)腸組織，10%甲醛固定24 h，梯度酒精脫水，浸蠟，切片，脫蠟，HE染色，光鏡下觀測組織形態(tài)學(xué)改變。

1.2.4 ELISA法檢測血清白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量：末次給藥后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟采血，3000 r/min離心15 min，分離血清，按照試劑盒說明書步驟檢測血清TNF-α、IL-6含量。

1.2.5 PCR法檢測IL-6、TNF-α、NF-κB、TGF-β1、Smad3 mRNA水平：取新鮮凍存的大鼠盲腸組織100 mg,加入1 ml Trizol試劑，提取RNA。取1 μl溶解后的RNA以DEPC水稀釋200倍后，計(jì)算RNA純度和濃度?？俁NA逆轉(zhuǎn)錄cDNA：取RNA，加入5×Hiscript Buffer、dNTP(2.5 mmol/L)、Oligo (dT) 15 (10 μmol/L)、無RNA酶水等共20 μl的反應(yīng)體系；混合物輕柔混勻離心30 s，反應(yīng)條件：25 ℃ 5 min，50 ℃15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min，檢測cDNA濃度。按照5.2 μl反應(yīng)體系上機(jī)，PCR反應(yīng)條件設(shè)置為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10min,95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。繪制溶解曲線，以2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。引物序列見表1。

1.2.6 Western bolt法檢測IκB、p-NF-κBp65、TGF-β1、Smad3、MMP-9、TIMP-1蛋白水平：取新鮮凍存的大鼠盲腸組織提取總蛋白；按照BCA蛋白定量試劑盒說明書配制標(biāo)準(zhǔn)品，測定吸光度后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶標(biāo)儀測定稀釋后的樣本蛋白濃度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算各樣本的總蛋白濃度，蛋白變性；依照實(shí)驗(yàn)條件配膠，然后將備好的蛋白樣品和Maker置于電泳緩沖液中電泳1.5 h；轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉的TBST封閉液浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h。加入稀釋1000倍的一抗，4 ℃過夜孵育；TBST洗膜；加入稀釋5000倍的二抗4 ml，室溫下孵育2 h；1×TBST洗膜。于PVDF膜表面滴加ECL發(fā)光液，采用全自動凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。用Band Scan分析膠片灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 通腑活血方對腸粘連大鼠盲腸病理組織學(xué)形態(tài)的影響 對照組大鼠盲腸肌層光滑平整，未見組織破損及炎細(xì)胞浸潤；模型組大鼠盲腸肌層明顯缺損，漿膜層增厚，可見明顯肌層水腫，增厚，大量炎細(xì)胞浸潤，甚至深達(dá)盲腸黏膜層，黏膜層內(nèi)有大量新生血管即纖維組織生成；幾丁糖組大鼠盲腸組織肌層可見大量皺褶，肌層增厚，可見出血點(diǎn)及散在炎細(xì)胞浸潤；通腑活血方組可見盲腸肌層逐漸恢復(fù)光滑平整，但緊挨肌層的黏膜下層可見間隙增寬，仍可見部分出血及炎細(xì)胞生成(圖1)。

2.2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，幾丁糖組大鼠血清IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)，通腑活血方組大鼠血清IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較(pg/ml)

2.3 各組大鼠盲腸組織IL-6、TNF-α、NF-κB、TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)比較 與對照組比較，模型組大鼠盲腸組織IL-6、TNF-α、NF-κB、TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，幾丁糖組大鼠盲腸組織IL-6、TNF-α、NF-κB、TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)降低(P<0.05),通腑活血方組大鼠盲腸組織IL-6、TNF-α、NF-κB、TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)，見表3。

2.4 各組大鼠盲腸組織IκB、p-NF-κBp65、TGF-β1、Smad3、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)比較 與對照組比較，模型組大鼠盲腸組織IκB、TIMP-1蛋白相對表達(dá)水平降低(P<0.01)，p-NF-κBp65、TGF-β1、Smad3、MMP-9蛋白相對表達(dá)水平升高(P<0.01)；與模型組比較，p-NF-κBp65、TGF-β1、Smad3、MMP-9蛋白相對表達(dá)水平降低(P<0.01)，通腑活血方組、幾丁糖組大鼠盲腸組織IκB、TIMP-1蛋白相對表達(dá)水平升高(P<0.01)。見表4(圖2)。

表3 各組大鼠盲腸組織IL-6、TNF-α、NF-κB、TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)比較

表4 各組大鼠盲腸組織IκB、p-NF-κBp65、TGF-β1、Smad3、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)比較

A:對照組；B:模型組；C:幾丁糖組；D:通腑活血方組

3 討 論

腸粘連發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，免疫細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子誘發(fā)的初始炎癥是導(dǎo)致粘連的核心因素[6]。當(dāng)腹腔的正常結(jié)構(gòu)受到各種損害時(shí)，腹膜的吞噬細(xì)胞被激活，細(xì)胞外信號傳遞入細(xì)胞內(nèi)，啟動免疫進(jìn)程，在免疫細(xì)胞的激活過程中NF-κB信號通路發(fā)揮了關(guān)鍵作用[7]，在靜息狀態(tài)下，IκB與NF-κB二聚體以結(jié)合形式位于細(xì)胞質(zhì)中，抑制NF-κB活化，當(dāng)炎癥反應(yīng)被激活，IκB與NF-κB解聚合，對NF-κB的抑制作用逐漸減弱，NF-κB活化發(fā)揮其生物活性，釋放大量細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子、IL-1和IL-6激活下游的TGF-β/Smad信號通路，TGF-β是誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化的重要細(xì)胞因子，TGF-β/Smad信號通路是成纖維細(xì)胞激活并發(fā)揮細(xì)胞功能的關(guān)鍵，活化的成纖維細(xì)胞分泌大量膠原蛋白，從而誘發(fā)粘連形成[8-9]。MMP-9是TGF-β/Smad信號通路下游的重要靶蛋白，其主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡，具有促進(jìn)纖維組織形成的作用[10-11]。TIMP-1是MMP-9的抑制劑，能夠抑制纖維組織的分泌和生成，抑制腸粘連的發(fā)生。TGF-β/Smad信號通路活化后TIMP-1/MMP-9平衡被打破，成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白增多，同時(shí)在多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的共同刺激下，腹膜內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生纖溶酶原激活抑制因子，使纖溶酶原激活因子的活性降低，從而導(dǎo)致纖溶酶原不能及時(shí)有效的轉(zhuǎn)化為纖溶酶，隨之纖維蛋白性的沉積物因不能及時(shí)溶解轉(zhuǎn)變成纖維蛋白性組織，從而形成組織粘連。由此可見，炎癥水平與腸粘連程度呈正相關(guān)，因此TNF-α被視為腹腔粘連標(biāo)記物，TIMP-1/MMP-9失衡在腸粘連的發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12-13]。本研究顯示，模型組大鼠盲腸肌層明顯缺損，漿膜層增厚，可見明顯肌層水腫、增厚，大量炎細(xì)胞浸潤，有大量新生血管即纖維組織生成，發(fā)生了嚴(yán)重的腸粘連，腸粘連程度分級多處于Ⅲ、Ⅳ級；模型組大鼠結(jié)腸組織IκB蛋白表達(dá)逐漸減少，對NF-κB的抑制減弱，p-NF-κBp65表達(dá)增加，炎癥反應(yīng)逐漸加重，血清炎癥因子TNF-α和IL-6水平顯著升高，TGF-β/Smad3信號通路被活化，引起MMP-9升高，TIMP-1降低，細(xì)胞外基質(zhì)增多，最終促進(jìn)腸粘連的發(fā)生。因此抑制NF-κB/TGF-β/Smad信號通路的活化是防止腸粘連發(fā)生的重要靶點(diǎn)。

中醫(yī)將術(shù)后腸粘連歸屬于“腹痛”“腸結(jié)”等范疇，多由于腸道氣血痞結(jié)、通降失調(diào)而成[14]。因此，課題組根據(jù)腸粘連的臨床證候特點(diǎn)，采用通腑活血法治療，取得一定的療效[15]。在此基礎(chǔ)上，經(jīng)過對藥物和治療方法的不斷篩選和優(yōu)化，以通腑活血方(大黃、醋莪術(shù)、制川烏、乳香、沒藥、丁香、艾葉、冰片)作為臨床協(xié)定方治療粘連性腸梗阻患者80例，效果顯著[4]。方中生大黃瀉下通便、清熱利濕、涼血活血，莪術(shù)以活血化瘀、行氣止痛功效見著，兩藥合用，通腸活血、化瘀止痛，共為君藥，藥理學(xué)研究證實(shí)兩者均可促進(jìn)腸道平滑肌收縮而增加腸黏膜蠕動，同時(shí)還可干預(yù)腸道內(nèi)菌群移位導(dǎo)致的感染擴(kuò)散[16-17]。乳香、沒藥為活血化瘀常用藥對，而乳香長于理氣而活血，沒藥長于化瘀而理血，共同起理血化瘀止痛的作用，共為臣藥。烏頭具有溫經(jīng)散寒、祛風(fēng)止痛的功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)烏頭的有效成分烏頭堿可作用于中樞鈣離子或去甲腎上腺素系統(tǒng)，起鎮(zhèn)痛和局部麻醉的作用，緩解腸粘連導(dǎo)致的腹痛，其次烏頭堿通過抑制前列腺素E表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，從而減少纖維蛋白的滲出防止粘連的發(fā)生[18-20]。丁香、冰片、艾葉三藥皆可理氣止痛，共為佐藥。全方通腸下氣、活血散瘀，針對腸粘連效果卓著。

本研究結(jié)果證實(shí)，通腑活血方可顯著減少大鼠腸粘連的發(fā)生，降低粘連程度，通過抑制血清TNF-α、IL-6表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)；進(jìn)一步機(jī)制研究顯示，通腑活血方通過NF-κB/TGF-β/Smad信號通路促進(jìn)TIMP-1/MMP-9恢復(fù)平衡，從而發(fā)揮防治術(shù)后腸粘連的作用。