艾灸對三陰性乳腺癌移植瘤小鼠生存期的影響及機(jī)制研究

陳 軍，孫 嫘，惠建榮，KHARSANOV Shakir(哈薩克斯坦)，胡 蓉，李 靜

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心中醫(yī)學(xué)部，北京 100048)

2020年全球新發(fā)癌癥1929萬例，其中乳腺癌居全球發(fā)病首位[1]。尤其是三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC)對放、化療極易產(chǎn)生耐受，因此，如何延長帶瘤患者生存時間，提高其生活質(zhì)量成為目前亟需解決的公共衛(wèi)生問題[2]。有研究表明，電針可促進(jìn)細(xì)胞間通信介質(zhì)外泌體的分泌，有效改善腦卒中的臨床癥狀[3]；穴位局部外泌體可能參與了針刺穴位效應(yīng)啟動過程[4]。針刺與艾灸的物質(zhì)基礎(chǔ)均是經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)，通過對穴位的物理刺激而起效。本團(tuán)隊(duì)在前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，艾灸可有效緩解晚期腫瘤患者癌因性疲乏[5]，并從艾灸與能量代謝的角度進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)，證明艾灸可有效降低低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的表達(dá)，現(xiàn)進(jìn)一步探究艾灸干預(yù)三陰性乳腺癌荷瘤小鼠機(jī)制與外泌體的關(guān)系，為探尋TNBC的中西醫(yī)綜合治療提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞株：SPF級BALB/c雌性野生小鼠，體重25～30 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006；飼養(yǎng)于26～27 ℃和光照、黑暗交替各12 h的環(huán)境中；Luci-MB-231細(xì)胞株購自于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：透射電鏡(型號H7650，日本Hitachi公司)；納米顆粒跟蹤分析儀(型號ZetaView，德國Particle Metrix公司)；全自動蛋白印跡儀(型號Profiblot48，奧地利帝肯公司)?？剐∈驝D63單克隆抗體、抗小鼠TSG101單克隆抗體及HRP標(biāo)記二抗(美國Sigma公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國博士德公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物造模與分組：將Luci-MB-231細(xì)胞株從液氮中取出，常規(guī)復(fù)蘇并傳代至3～4代，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個/ml予以皮下移植。小鼠常規(guī)麻醉，仰臥位固定，于一側(cè)上肢腋窩下緩慢推入Luci-MB-231細(xì)胞，接種2周后，選取荷瘤成功的小鼠30只，隨機(jī)分為對照組及實(shí)驗(yàn)組各15只。

1.2.2 干預(yù)方法：實(shí)驗(yàn)組采用艾灸干預(yù)，參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》選取關(guān)元、氣海、中脘穴。每日抓取小鼠放入固定器固定，裸鼠仰臥固定，定穴后局部剪毛，用隔熱紙包裹局部，隔熱紙上剪5 mm×5 mm的小孔并對準(zhǔn)穴位，將艾條固定于自制艾條架上，使艾條點(diǎn)燃部位垂直距離裸鼠穴位約5 mm，點(diǎn)燃施灸，每日每穴灸20 min，連續(xù)艾灸直至全部小鼠自然死亡。對照組小鼠僅進(jìn)行抓取固定操作。

1.2.3 荷瘤小鼠生存曲線：造模成功后，每天觀察、記錄兩組小鼠生存情況，直至全部小鼠自然死亡，采用GraphPad Prism 9軟件繪制小鼠生存曲線。

1.2.4 血清收集及外泌體提?。寒?dāng)其中一組僅存活2只小鼠時，以此為時間節(jié)點(diǎn)，分別隨機(jī)收集兩組小鼠血樣各1份，采用斷頭采血方法，取血1～1.5 ml。將血樣置于冰盒中，4 ℃靜置4～5 h，析出血清；收集血清樣本以PBS稀釋，4 ℃、12000 r/min離心20 min，吸取上清、PBS重懸、低溫高速離心，再棄上清獲得外泌體沉淀，于-80 ℃保存。

1.2.5 外泌體鑒定：利用透射電鏡、納米粒子示蹤技術(shù)、蛋白印跡分析技術(shù)鑒定外泌體。①透射電鏡觀察：將外泌體溶液用2.5%戊二醛固定，取10 μl外泌體溶液滴加在銅網(wǎng)上，2 min后用濾紙吸干，加10 μl濃度為2%的磷鎢酸溶液，1 min后用濾紙吸干，將銅網(wǎng)置于紅外燈下烤干，上機(jī)觀察并拍照[6]。②納米顆粒跟蹤分析儀分析：含外泌體血清樣本經(jīng)過濾后以磷酸鹽緩沖液稀釋，緩慢注入納米顆粒跟蹤分析儀，分析粒徑分布及濃度。③蛋白印跡法檢測表面標(biāo)志物：樣本冰上孵育5 min，加入200 μl含蛋白酶抑制劑的裂解液冰上裂解15 min，以14000 r/min低溫離心15 min，再以BSA標(biāo)準(zhǔn)品及樣品進(jìn)行比對分析。根據(jù)BSA蛋白定量結(jié)果，調(diào)整8個樣本蛋白質(zhì)濃度，行SDS-PAGE電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉；以一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后以HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，洗膜、ECL顯影、定影。④檢測兩組小鼠血清外泌體濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組組間比較采用t檢驗(yàn)；生存曲線以Kaplan-Meier曲線呈現(xiàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 造模成功小鼠形態(tài)學(xué)觀察 接種后2周觀察小鼠，造模成功小鼠腋窩處可見大于50 mm3的皮下包塊(圖1)。

圖1 造模成功的小鼠外觀

2.2 兩組小鼠生存曲線 對照組第1只小鼠死亡時間是第19天，實(shí)驗(yàn)組第1只小鼠死亡時間是第22天，兩組在第4、5周出現(xiàn)最高峰，對照組最長存活時間為48 d，實(shí)驗(yàn)組最長存活時間為53 d。兩組小鼠存活率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 兩組小鼠生存曲線

2.3 兩組小鼠血清外泌體形態(tài)學(xué)觀察 透射電子顯微鏡下可見小鼠血清中有圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，符合外泌體的形態(tài)特征。

圖3 兩組小鼠透射電子顯微鏡下外泌體形態(tài)

2.4 兩組小鼠血清外泌體粒徑鑒定 見圖4。對照組血清外泌體平均粒徑為76.70 nm，30～150 nm的囊泡占總囊泡數(shù)的99.80%；實(shí)驗(yàn)組血清外泌體平均粒徑為78.71 nm，30～150 nm的囊泡占總囊泡數(shù)的99.34%，兩組均符合外泌體粒徑大小標(biāo)準(zhǔn)。

圖4 兩組小鼠血清外泌體粒徑檢測結(jié)果

2.5 兩組小鼠血清外泌體表面標(biāo)記蛋白檢測 通過蛋白印跡法檢測外泌體表面標(biāo)記蛋白CD63、TSG101水平，CD63、TSG101在兩組小鼠血清提取物質(zhì)中均有表達(dá)(圖5)。通過形態(tài)學(xué)、粒徑、表面標(biāo)記蛋白鑒定，可以確定提取物質(zhì)是外泌體。

圖5 兩組小鼠血清外泌體標(biāo)記蛋白CD63、

2.6 兩組小鼠血清外泌體濃度比較 對照組血清外泌體濃度為(2.34×109)個/ml，實(shí)驗(yàn)組血清外泌體濃度為(6.19×109)個/ml，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖6)。實(shí)驗(yàn)證明艾灸延長三陰性乳腺癌荷瘤小鼠生存期的機(jī)制與促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞釋放外泌體有關(guān)。

圖6 兩組小鼠血清外泌體濃度比較

3 討 論

21世紀(jì)以來，隨著自然科學(xué)的飛速發(fā)展，醫(yī)學(xué)研究進(jìn)入到現(xiàn)代醫(yī)學(xué)階段。針灸機(jī)制研究從“黑箱理論”“點(diǎn)到點(diǎn)”發(fā)展到“點(diǎn)到系統(tǒng)”，但終究屬于“干預(yù)與效應(yīng)”的線性研究模式范疇，即通過檢測特異性指標(biāo)，進(jìn)而推導(dǎo)針灸的作用機(jī)制[7]。針灸的理論基礎(chǔ)是經(jīng)絡(luò)，經(jīng)絡(luò)“內(nèi)屬于臟腑，外絡(luò)于肢節(jié)”，從經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)的組成及其分布預(yù)測，針灸的作用機(jī)制應(yīng)該是網(wǎng)狀、多層面、多靶點(diǎn)的?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，人體各部分在相互作用中形成相互關(guān)聯(lián)的整體，這與中醫(yī)的整體觀完全吻合。2021年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者David Julius和Ardem Patapoutian兩位科學(xué)家分別發(fā)現(xiàn)了溫度感受器TRPV1和觸覺感受器Piezo，揭示了熱、冷和機(jī)械力引發(fā)神經(jīng)沖動的機(jī)制[8-9]，而針灸療法正是通過觸覺(針)和溫度(灸)對皮膚產(chǎn)生刺激發(fā)揮療效。這不僅佐證了針灸的科學(xué)性，也為針灸作用機(jī)制的研究打開新的領(lǐng)域。

經(jīng)絡(luò)實(shí)質(zhì)的核心問題是確定經(jīng)穴與臟腑的聯(lián)系途徑[10]。王欣[11]提出經(jīng)絡(luò)的實(shí)質(zhì)是“人體定向水環(huán)境調(diào)控體系”，但并未提出具體的物質(zhì)基礎(chǔ)。李檸岑等[12]通過回輸針刺后血清外泌體，產(chǎn)生了“類針刺樣”作用，提出外泌體可能是聯(lián)系穴位與臟腑的重要載體。外泌體是一種能被機(jī)體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞分泌的微小囊泡，直徑約30～150 nm，廣泛分布于各種體液中，囊泡內(nèi)所荷載的DNA、miRNA、蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子及脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)，通過循環(huán)系統(tǒng)可以到達(dá)全身的器官、組織、細(xì)胞，從而參與調(diào)控細(xì)胞及細(xì)胞間的相互作用，并與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13-14]?；谝陨咸匦?，有學(xué)者指出，外泌體與經(jīng)絡(luò)具有高度的相通性，它們均具備全身廣泛分布、攜帶生命信息、靶向性、動態(tài)性、雙向調(diào)節(jié)性等特點(diǎn)，既能反映機(jī)體生理功能，也可反映病理變化[15]。艾灸通過其具有的溫?zé)嶙饔?、藥物作用、光輻射特性等綜合因素作用于人體體表[16]，中間通過大量的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，最終綜合作用于靶器官，其作用機(jī)制是否與外泌體有關(guān)？本研究結(jié)果顯示，對照組血清外泌體濃度低于實(shí)驗(yàn)組，提示外泌體可能是艾灸發(fā)揮作用的靶點(diǎn)。

“帶瘤生存”是中醫(yī)治療腫瘤的重要學(xué)術(shù)觀點(diǎn)[17]，現(xiàn)已被醫(yī)學(xué)界廣泛認(rèn)可，腫瘤臨床療效評價也由單一的瘤體控制率轉(zhuǎn)變?yōu)橐曰颊呱嫫?、主觀感受、生活質(zhì)量等多方面的評價標(biāo)準(zhǔn)[18]?！吨T病源候論》指出：“積聚者，由寒氣在內(nèi)所生也”，認(rèn)為“陽虛寒凝”是腫瘤主要病機(jī)之一，而“灸者溫暖經(jīng)絡(luò)，宣通氣血，使逆者得順，滯者得行”“夫灸取于火，以火性熱而至速，體柔而用剛，能消陰翳，走而不守，善入臟腑”[19]，以灸法補(bǔ)益正氣、扶正培本是“帶瘤生存”的有效治療手段[20]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，艾灸可增加三陰性乳腺癌荷瘤小鼠的生存期，通過電鏡觀察、粒徑分析、外泌體表面標(biāo)記蛋白檢測對小鼠血清外泌體進(jìn)行了確認(rèn)，實(shí)驗(yàn)組血清外泌體濃度明顯高于對照組，因此我們推測，艾灸干預(yù)乳腺癌機(jī)制與調(diào)控血清外泌體有必然聯(lián)系。目前本研究處于前期階段，后續(xù)將針對外泌體來源、外泌體荷載的生物活性物質(zhì)深入研究。