血清外泌體微小RNA-21 與微小RNA-124 水平變化在一氧化碳中毒并發(fā)遲發(fā)性腦病中的臨床意義

景少巍 朱浩軒 楊曉燕 駱圖南 歐陽曉春

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇八醫(yī)院，江西 南昌 330000）

一氧化碳（CO）中毒患者經(jīng)治療恢復(fù)后，可能再次發(fā)生大腦神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，即遲發(fā)性腦病，該并發(fā)癥危害性極大，會引起認知障礙、錐體系受損、大小便障礙等，增加死亡風險[1]。急性CO 中毒后，遲發(fā)性腦病發(fā)生率約10% ～30%[2]，經(jīng)治療后部分患者留有永久后遺癥，預(yù)后較差。因此，臨床一直在尋找有效指標以及時識別遲發(fā)性腦病的預(yù)后風險。近年來研究發(fā)現(xiàn)，外泌體與神經(jīng)發(fā)育、生長以及修復(fù)過程密切相關(guān)，可以其為載體實現(xiàn)血液循環(huán)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的物質(zhì)雙向傳遞[3]。外泌體中的微小核糖核酸（miRNA）也被證實與腦損害存在關(guān)聯(lián)，如miRNA -21（miR-21）在腦組織缺氧狀態(tài)下可見表達異常，miR-124 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥以及免疫狀態(tài)有調(diào)控作用[4-5]。為此，本研究中擬分析miR-21 與miR-124 在CO 中毒并遲發(fā)性腦病中的臨床意義，為該病診療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇八醫(yī)院2020 年7 月—2021 年10 月收治的CO 中毒并遲發(fā)性腦病患者60 例作為病例組，CO 中毒至因遲發(fā)性腦病入院時間平均（5.15±1.04）d。病例納入標準：①遲發(fā)性腦病就診前1 周內(nèi)存在CO 中毒史；②CO 中毒經(jīng)治療恢復(fù)后，再次出現(xiàn)意識障礙、定向障礙、反應(yīng)遲鈍等癥狀，符合CO 中毒并遲發(fā)性腦病診斷標準[6]；③年齡18 ～75 歲；④家屬對研究知情同意，并簽署知情同意書。排除標準：①既往有偏癱、精神障礙病史；②合并急性或慢性感染、阿爾茨海默癥、血管性癡呆等疾??；③合并有腫瘤疾病者；④合并心、肝、腎等臟器功能不全；⑤在CO 中毒前已出現(xiàn)腦損害；⑥患者或家屬不愿意參與本研究，或中途退出者；⑦CO 中毒前有腦病相關(guān)治療史者；⑧因其他腦部疾病接受治療者。對照組35 例為同期體檢的18 ～75 歲健康志愿者，均無腦部功能及重要臟器異常，也無腦病相關(guān)疾病治療史，且均知情同意，簽署知情同意書。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表1），具有可比性。本研究方案征得我院醫(yī)學倫理委員會審核同意。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2治療方法 所有患者根據(jù)病情給予改善微循環(huán)、糾正酸堿失衡等對癥處理，定時幫助患者按摩四肢，指導翻身，維持肌張力。行高壓氧治療，每日1 次：進入高壓氧療艙（上海寰熙醫(yī)療器械有限公司，TB1800L-1.3TA 型），利用空氣加壓艙進行加壓，時間為20 min，使艙內(nèi)壓調(diào)整為0.20 MPa，患者佩戴面罩，吸純氧，時間為30 min，然后調(diào)整為吸艙內(nèi)空氣5 min，再次吸純氧30 min，最后進行20 min 的減壓，待減至常壓后出艙；治療10 d 為1 個療程。給予患者地塞米松注射液10 mg/d 靜脈滴注，連續(xù)5 d。同時患者接受康復(fù)訓練，包括肌力訓練、體位轉(zhuǎn)移、四肢靈活度訓練、平衡訓練等，每次45 min，每周5 次。

1.3實驗室檢測指標與方法 病例組分別在確診后第2 天（治療前）、治療6 個月后測定各指標，對照組在體檢時檢測。在受試者空腹狀態(tài)下采集4 mL 肘靜脈血，分裝于兩管。①其中一管離心5 min（2 500 r/min），分離血清，-80℃保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、白細胞介素-6（IL-6）和IL-8 水平。②另一管離心10 min（3 000 r/min），去除細胞及其碎片，收集上清液，再次離心10 min（3 000 r/min），進一步清除殘留血細胞，吸取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆?，采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄- 聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）測定血清外泌體miR-21、miR-124 表達水平：經(jīng)Trizol 試劑（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）提取外泌體內(nèi)總RNA，操作按說明書進行，針對RNA 進行質(zhì)檢，取RNA 1 μL 測定純度與濃度，其260 nm 和280 nm 處吸光度比值（A260/A280）為1.6 ～1.8 提示符合要求，剩余RNA -80 ℃保存?zhèn)溆茫唤?jīng)血清miRNA 提取分離試劑（北京艾克賽侖生物科技有限公司）提取并收集外泌體內(nèi)miRNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?；行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，獲得cDNA 產(chǎn)物；行熒光RT-PCR 擴增，PCR 程序：94 ℃ 5 min（預(yù)變性），95 ℃ 15 s（變性），60 ℃ 60 s 退火，72 ℃ 60 s（延伸），40 個循環(huán)。引物序列：①miR-21：上、下游引物序列分別為：5’-AC ACTCCAGCTGGCTAGCTTATCAGACTGA TG-3’、5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’。②miR-124： 上、 下 游 引 物 序 列 分 別 為：5’-C G T G C A C A G C G G A C C T T G A T-3’、5’-C G G G A G C G G A C C T T A G T G G T-3’；③內(nèi) 參 引 物U6： 上、 下 游 序 列 分 別 為5’-C T C G C T T T G C A A C T T A G-3’、5’-CGCCACGAAGAATGAATGTC-3’。 通 過2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。

1.4昏迷程度與預(yù)后評估 ①在治療前進行格拉斯哥昏迷評分（GCS）評估昏迷程度[7]：共計15分，13 ～15 分、7 ～12 分、＜7 分分別代表輕、中、重度昏迷。據(jù)此將患者分為輕中度昏迷組（n=43例）和重度昏迷組（n=17 例）。②在治療6 個月后進行格拉斯哥預(yù)后評分（GOS）[8]評價預(yù)后：①死亡；②植物狀態(tài)：反應(yīng)性降低，有覺醒特征，可有吸吮、睜眼等反應(yīng)；③重度殘疾：意識清醒，但24 h 均需他人照料；④輕微殘疾：在保護下能夠獨立生活，對他人依賴性??；⑤恢復(fù)良好：社交、工作正常，可有輕微后遺癥。其中①、②、③為預(yù)后不良，④、⑤為預(yù)后良好。據(jù)此將患者分成預(yù)后不良組（n=15）、預(yù)后良好組（n=45）。

1.5統(tǒng)計學方法 利用SPSS20.0 軟件分析數(shù)據(jù)資料，計數(shù)資料用例數(shù)和百分比（%）表示，行χ2檢驗。計量資料（符合正態(tài)分布）以表示，行獨立或配對樣本t檢驗。兩個變量之間的相關(guān)性行Pearson 線性相關(guān)分析，經(jīng)多元Logistic 回歸模型分析患者預(yù)后獨立影響因素。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析本次構(gòu)建的多元Logistic 回歸模型評估預(yù)后的價值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1病例組和對照組血清外泌體miR-21、miR-124 表達比較 病例組治療前的血清外泌體miR-21、miR-124 表達低于對照組（P＜0.001），治療后其表達高于治療前（P＜0.05），但仍低于對照組（P＜0.001）。見表2。

表2 兩組患者血清外泌體miR-21、miR-124 表達及血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平的比較

表2 兩組患者血清外泌體miR-21、miR-124 表達及血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平的比較

注：與對照組比較：*P ＜0.001；與本組治療前比較：#P ＜0.05。

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2.2病例組和對照組血清HIF-1α、IL-6、IL-8水平的比較 病例組治療前的血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平高于對照組（P＜0.001），經(jīng)治療后，患者各指標水平均低于治療前（P＜0.05），但仍高于對照組（P＜0.001）。見表2。

2.3預(yù)后良好組和預(yù)后不良組miR-21、miR-124和血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平的比較 治療前，兩組各指標水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療后，預(yù)后良好組血清外泌體miR-21和miR-124 表達高于治療前與預(yù)后不良組，血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平低于治療前與預(yù)后不良組（P＜0.05）。見表3。

表3 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組miR-21、miR-124 和血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平的比較

表3 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組miR-21、miR-124 和血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平的比較

注：與預(yù)后不良組治療6 個月比較：*P ＜0.05。

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2.4病例組miR-21、miR-124 表達與HIF-1α、IL-6、IL-8 水平的相關(guān)性 Pearson 線性相關(guān)分析提示，血清外泌體miR-21 和miR-124 表達與HIF-1α、IL-6、IL-8 水平呈負相關(guān)（P＜0.01）。見表4。

表4 病例組miR-21、miR-124 表達與血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平的相關(guān)性分析

2.5不同昏迷程度患者的miR-21 和miR-124 表達比較 治療前，不同昏迷程度患者miR-21 和miR-124 表達比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療后，兩組各指標表達均高于治療前（P＜0.05），且輕中度昏迷組高于重度昏迷組（P＜0.001）。見表5。

表5 不同昏迷程度患者miR-21 和miR-124 表達的比較

表5 不同昏迷程度患者miR-21 和miR-124 表達的比較

注：與本組治療前比較：#P ＜0.05。

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2.6中毒后不同時間接受高壓氧治療患者的miR-21、miR-124 表達比較 在60 例患者中，有46 例在中毒12 h 內(nèi)行高壓氧治療，14 例中毒12 h 后治療。據(jù)此分組，治療前，兩組miR-21 和miR-124表達比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療后，兩組各指標表達高于治療前（P＜0.05），且中毒12 h 內(nèi)治療組各指標表達高于中毒12 h 后治療組（P＜0.001）。見表6。

表6 中毒后不同時間接受高壓氧治療患者的miR-21、miR-124 表達比較

表6 中毒后不同時間接受高壓氧治療患者的miR-21、miR-124 表達比較

注：與本組治療前比較：#P ＜0.05。

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2.7患者預(yù)后分析 通過多元Logistic 回歸模型分析提示，miR-21 和miR-124 表達增高及早期行高壓氧療是預(yù)后保護因素，而HIF-1α、IL-6、IL-8 水平增高及昏迷程度加重是預(yù)后危險因素（P＜0.01）。見表7?；诙嘣狶ogistic 回歸模型評估患者預(yù)后的ROC 曲線見圖1，曲線下面積為0.876（標準誤：0.055，P＜0.001，95%CI：0.768 ～0.985）。

圖1 CO 中毒并發(fā)遲發(fā)性腦病預(yù)后的多元Logistic 回歸模型評估患者預(yù)后的ROC 曲線

表7 患者預(yù)后危險因素的多元Logistic 回歸模型分析

3 討 論

遲發(fā)性腦病是CO 中毒后的一種嚴重并發(fā)癥，發(fā)病機制復(fù)雜，可能與細胞凋亡、細胞毒性損傷、缺氧缺血等機制相關(guān)[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在機體多個器官內(nèi)存在豐富表達，并且對多種蛋白編碼基因表達有影響，其參與了缺氧、缺血狀態(tài)下的細胞擴增、凋亡、代謝、分化、遷移、神經(jīng)元發(fā)育等過程，與腦部神經(jīng)功能損傷性疾病密切相關(guān)[10]。在腦內(nèi)組織缺氧、缺血狀態(tài)下，神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞等會分泌大量外泌體，外泌體轉(zhuǎn)運miRNA 參與神經(jīng)細胞修復(fù)、抗凋亡機制[11]。因此，通過尋求與腦內(nèi)神經(jīng)損害相關(guān)的血清外泌體miRNA，可能為遲發(fā)性腦病的診療提供幫助。

本次研究結(jié)果提示，與對照組相比，病例組的血清外泌體miR-21 和miR-124 表達下降，經(jīng)治療后二者表達有所升高，但仍低于對照組，提示miR-21 和miR-124 表達下降與遲發(fā)性腦病有關(guān)，二者表達越高，對患者病情越有利。研究發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧性腦病患兒miR-21 表達高于正常新生兒[12]。另有研究指出腦出血患者外周血miR-21 表達下調(diào)[13]。這表明臨床對于miR-21 在腦損傷中的作用還存在爭議，需進一步探討。動物實驗發(fā)現(xiàn)，miR-21 對缺血缺氧狀態(tài)下的神經(jīng)細胞有保護作用，其高表達對N2a 細胞內(nèi)p53 表達有抑制作用，這可能是miR-21 保護神經(jīng)功能的機制[14]，為本次結(jié)論提供了支持。miR-124 對神經(jīng)元發(fā)育有促進作用，且參與受損神經(jīng)元功能的修復(fù)過程，對腦組織受損后的神經(jīng)元炎癥有抑制作用，它可能利用對絲裂素活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路進行調(diào)節(jié)，抑制神經(jīng)細胞凋亡，對其予以保護。

本研究中，與對照組相比，病例組治療前后的血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平均較高。在嚴重缺氧的情況下，HIF-1α 過表達能夠?qū)ρ軆?nèi)皮生長因子以及促紅細胞生成素表達進行誘導，增強血管通透性，致炎癥反應(yīng)加重。李晟等[15]研究發(fā)現(xiàn)，CO 中毒患者中樞神經(jīng)損傷的發(fā)生與HIF-1α 基因多態(tài)性有關(guān)。IL-6 和IL-8 是常見的炎癥因子，在機體處于炎癥狀態(tài)時水平增高，能促進炎癥進展，與缺血缺氧所致的炎癥反應(yīng)存在密切關(guān)聯(lián)[16-17]。本研究結(jié)果顯示，CO 中毒并遲發(fā)性腦病預(yù)后良好者經(jīng)治療后，血清外泌體miR-21 和miR-124 表達較預(yù)后不良者增高，而HIF-1α、IL-6、IL-8 水平下降，提示miR-21 和miR-124表達上調(diào)以及炎癥緩解有利于改善預(yù)后。miR-21 能對磷酸酶張力蛋白同源物基因- 蛋白激酶B信號通路予以調(diào)控，從而對神經(jīng)元細胞凋亡進行抑制[18]。miR-124 則能通過促進腦損傷組織內(nèi)小膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化（M1 型轉(zhuǎn)化成M2 型），緩解神經(jīng)炎癥[19]。而HIF-1α、IL-6、IL-8 與miR-21、miR-124 作用相反，其具有促炎作用，能加重神經(jīng)炎癥。故經(jīng)治療后，預(yù)后良好者miR-21 和miR-124 表達更高，而促炎相關(guān)指標下調(diào)。本研究中還發(fā)現(xiàn)，CO 中毒遲發(fā)性腦病患者miR-21 和miR-124 表達與HIF-1α、IL-6、IL-8 之間存在相關(guān)性，且miR-21 和miR-124 對預(yù)后有保護作用，而HIF-1α、IL-6、IL-8 是預(yù)后危險因素，這可能主要與miR-21 和miR-124 的神經(jīng)炎癥抑制作用以及HIF-1α、IL-6、IL-8 促炎作用有關(guān)，各指標因?qū)ρ装Y的影響不同而產(chǎn)生負性相關(guān)，并影響預(yù)后。通過進一步分析提示，不同昏迷程度、不同高壓氧療開始時間的患者在血清外泌體miR-21和miR-124 表達上也存在差異，且昏迷程度與高壓氧療開始時間均與預(yù)后有關(guān)?；杳栽街匾约癈O中毒時間越長的患者可能伴隨的神經(jīng)炎癥越重，從而導致患者miR-21 和miR-124 表達出現(xiàn)差異。隨著昏迷程度越重，患者的預(yù)后不良風險必然越高，早期給予高壓氧療能夠及時緩解病情，降低預(yù)后不良風險。

綜上所述，CO 中毒遲發(fā)性腦病患者血清外泌體miR-21 和miR-124 表達明顯下降，二者表達增加有利于預(yù)后。本研究局限性在于病例樣本數(shù)和觀察時間均有限，未來需擴增樣本、延長觀察時間分析miR-21、miR-124 與患者遠期預(yù)后的關(guān)系。