真菌耐藥機制及治療對策的研究進展

杜 霞

（深圳龍城醫(yī)院神經(jīng)康復(fù)科，廣東 深圳 518000）

真菌是地球上最具影響力的真核微生物之一，除了在環(huán)境中普遍存在外，許多種真菌被認(rèn)為是人體不同部位（包括皮膚、肺、泌尿生殖道、口腔和胃腸道）正常菌群的一部分，對人體健康有重要作用[1]。但當(dāng)免疫系統(tǒng)受損時，共生真菌可轉(zhuǎn)化為侵入性病原體，導(dǎo)致侵入性真菌感染[2]。真菌致病不僅僅局限于急性和慢性感染，研究發(fā)現(xiàn)，某些真菌的定植還與胰腺癌進展和酒精性肝硬化有關(guān)[3-4]?，F(xiàn)在越來越多的耐藥真菌出現(xiàn)，耐藥真菌感染造成了高病死率并增加了患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，因此需要在臨床工作中建立抗真菌管理計劃，加強真菌鑒定、抗真菌藥敏試驗和治療藥物監(jiān)測的研究，以最大限度地減少耐藥真菌的出現(xiàn)。目前，人類對真菌耐藥機制的了解有限。本文就真菌耐藥的機制、治療藥物監(jiān)測和新型抗真菌藥物的開發(fā)等研究的進展綜述如下。

1 抗真菌藥物的使用與真菌耐藥

抗真菌藥物按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為唑類、多烯類、棘白菌素類、尼可霉素類、氟尿嘧啶類、鞘磷酯類等，其中唑類分咪唑和三唑兩個亞類。臨床常用的抗真菌藥物包括：三唑類，如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑等；棘白菌素類，如卡泊芬凈、米卡芬凈；多烯類，如兩性霉素B。

最早的咪唑類藥物克霉唑和咪康唑?qū)θ祟惛闻K細(xì)胞色素氧化酶（CYP）有抑制作用，因而使用受到限制。20 世紀(jì)90 年代早期，三唑類藥物氟康唑和伊曲康唑開始應(yīng)用，顯示出了更好的藥代動力學(xué)特征和更廣泛的抗真菌活性，并且對人類細(xì)胞色素氧化酶P450（CYP450）系統(tǒng)的抑制作用降低[5]。21 世紀(jì)初，伏立康唑出現(xiàn)，與氟康唑或伊曲康唑相比，伏立康唑的抗真菌作用更強[5]。三唑類藥物與念珠菌中的ERG11 基因和曲霉菌中的Cyp51A 基因結(jié)合，中斷麥角甾醇的合成，而麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要成分。棘白菌素類藥物則以FKS 基因編碼的β-1,3-D-葡聚糖合酶的催化亞基為靶點，干擾細(xì)胞壁主要成分β-1，3-D-葡聚糖的合成[5]。多烯類藥物與真菌細(xì)胞膜中的麥角甾醇結(jié)合，通過在細(xì)胞膜上形成孔道導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變，使細(xì)胞死亡[5]?？拐婢幬锬芤种颇承┓N類的真菌生長，例如氟康唑?qū)δ钪榫囊种?，棘白菌素類藥物對曲霉菌的抑制。目前，具有抗霉菌活性的三唑類藥物伏立康唑、泊沙康唑和伊沙武康唑被推薦為治療侵襲性曲霉菌感染的一線抗真菌藥物[6]。棘白菌素類藥物米卡芬凈和卡泊芬凈被推薦為治療念珠菌感染的一線抗真菌藥物[7]。由于多烯類藥物具有潛在的腎毒性和肝毒性，因此使用謹(jǐn)慎，更常用于治療難治性念珠菌和曲霉菌感染。棘白菌素類藥物對新型隱球菌不敏感[7]，因此，新型隱球菌感染治療通常使用兩性霉素B、5-氟胞嘧啶和氟康唑[8]。肺孢子菌肺炎無首選藥物，替代療法有氨苯砜加甲氧芐啶，克林霉素加伯氨喹，阿托伐喹，戊脒，卡泊芬凈等[9]。

臨床對抗真菌藥物的廣泛使用以及在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中殺菌藥物的廣泛使用使得對一種或多種抗真菌藥物表現(xiàn)出耐藥性的真菌種類越來越多，并可能導(dǎo)致治療無效[10]。目前已出現(xiàn)耐三唑類藥物的煙曲霉[10]、熱帶假絲酵母菌、副絲酵母菌[11]和耐多藥金黃色假絲酵母菌[12]，耐多藥光滑假絲酵母菌的流行率也不斷上升。有報道三唑類抗真菌藥物對新型隱球菌性腦膜炎患者治療無效[13]；真菌性肝膿腫阻止了抗真菌藥物向感染部位的有效滲透和分布，促進了耐藥真菌的存活和出現(xiàn)[14]?？拐婢幬锏哪退幮钥梢允谦@得性的，即在抗真菌治療過程中真菌產(chǎn)生了耐藥性；也可以是固有性的，如克魯西假絲酵母，它固有地對氟康唑等唑類藥物產(chǎn)生耐藥性。

2 真菌的抗真菌藥物耐受和耐藥機制

真菌對抗真菌藥物有耐受和耐藥兩種反應(yīng)，前者指真菌沒有發(fā)生耐藥突變，后者指真菌接受外源抗性基因發(fā)生了耐藥突變，導(dǎo)致真菌感染治療失敗[15]。

2.1真菌的抗真菌藥物耐受機制 真菌的耐受途徑因使用的抗真菌藥物不同而有差異。例如，真菌體內(nèi)高滲甘油（HOG）、蛋白激酶C（PKC）和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶參與了真菌對棘白菌素藥物的耐受，稱為細(xì)胞壁完整性途徑；PKC 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶還參與了對三唑類藥物的耐受，稱為膜完整性途徑[16]。真菌體內(nèi)的熱休克蛋白90（HSP90）通過穩(wěn)定PKC 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶發(fā)揮重要作用，與真菌對藥物耐受性的產(chǎn)生有重要關(guān)系[17]。特異性HSP90 抑制劑與抗真菌藥物結(jié)合使用，可有效抑制霉菌和念珠菌中的耐藥菌株生長[16]。有研究顯示，近35%的熱帶假絲酵母菌血液分離株表現(xiàn)出高度的氟康唑耐受性，其中近1/3 的感染患者使用氟康唑治療時出現(xiàn)治療無效[18]。

2.2真菌的抗真菌藥物耐藥機制

2.2.1念珠菌屬的耐藥機制 在發(fā)展中國家，三唑類藥物是治療侵襲性念珠菌感染的主要藥物[19]，對三唑類藥物耐藥的真菌（尤其是白念珠菌），其外排泵分為兩大類：ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（CDR1 和CDR2）和促進因子超家族轉(zhuǎn)運蛋白（MDR1 和MDR2）[19]。它們分別受轉(zhuǎn)錄因子Tac1 和Mrr1 的調(diào)控[20]。當(dāng)真菌受到三唑類藥物攻擊時，真菌反應(yīng)性地過度表達(dá)外排泵[20]。三唑類藥物作用靶點ERG11 基因上的CTG 修飾是真菌（白念珠菌、副絲酵母菌、熱帶念珠菌、金黃色念珠菌）重要的耐藥機制[20]。異源表達(dá)和比較測序研究已確定，真菌ERG11 基因中Y132F、K143R、G458S 的氨基酸替換，深刻影響著三唑類藥物的藥敏譜[21]。

2.2.2煙曲霉的耐藥機制 煙曲霉對三唑類藥物耐藥是一種多因素現(xiàn)象，涉及基因Cyp51A 的修飾和過度表達(dá)，以及真菌外排泵（主要是CDR1B 和AtrF）的過度表達(dá)[22]。煙曲霉基因TR34/L98H 和TR46/Y121F/T289A 突變與對三唑類藥物耐藥有關(guān)[22]。研究表明，實驗室產(chǎn)生的對伏立康唑耐藥的黃曲霉分離物在Yap1 基因L558T 中攜帶氨基酸替換，此氨基酸替換導(dǎo)致外排泵AtrF 過度表達(dá)[22]。

2.2.3新型隱球菌和肺孢子菌的耐藥機制 新型隱球菌對三唑類藥物耐藥與ERG11 基因突變和（或）ERG11 和ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體的過度表達(dá)有關(guān)。新型隱球菌耐藥的出現(xiàn)還與藥物暴露有關(guān)，當(dāng)增加抗真菌藥物劑量或聯(lián)合用藥時可治療耐藥新型隱球菌感染[23]。在耐三唑類藥物的新型隱球菌菌株中，三唑類藥物雷夫康唑?qū)幋aG344S 替代蛋白的菌株顯示出有效性[24]；外排泵抑制劑（FK506，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑）與伏立康唑聯(lián)合使用時最小抑菌濃度（MIC）比單用伏立康唑低4 ～8 倍[24]。新型隱球菌中存在異質(zhì)耐藥亞群，當(dāng)暴露于抗真菌藥物時，可導(dǎo)致耐藥變體形成和克隆擴增，從而導(dǎo)致對氟康唑耐藥[25]。

3 抗真菌藥敏實驗（AFST）

AFST 的主要目的是提供MIC 值，以指導(dǎo)最佳抗真菌治療，并監(jiān)測對抗真菌藥物耐藥菌株的出現(xiàn)和提供流行病學(xué)報告。在真菌感染治療方面，可通過正確識別真菌及其固有的藥物敏感性特征來選擇藥物；因此，在潛在的侵襲性感染中，如果懷疑有抗真菌藥物耐藥性，或者治療無效時，建議進行AFST[26]；建議實施抗真菌管理計劃，該計劃包括真菌菌種鑒定和從體內(nèi)（如血液）采集標(biāo)本的AFST 監(jiān)測[26]。AFST 提供MIC 通常需要24 ～48 h，并且技術(shù)因素（有氧環(huán)境、高糖、浮游細(xì)胞、生長介質(zhì)等）以及真菌因素（菌絲、分生孢子和真菌生物膜的混合物、真菌毒力和適合度等）可能會影響MIC 讀數(shù)[27]?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）屬于抗真菌藥敏實驗，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點，可在幾個小時內(nèi)提供結(jié)果。未來需要研究一種簡化、自動化的方法來廣泛測試真菌和抗真菌藥物耐受性。已有一種低成本四孔平板瓊脂法適用于曲霉菌種的棘白菌素敏感性篩選[27]。

4 真菌耐藥性的檢測

在檢測真菌耐藥性的分子學(xué)方法中有一個主要限制：相同的耐藥性表型可能由不同位點的突變引起[28]?；谌蚪M測序?qū)ι矬w耐藥機制的研究方法，對真菌分離物進行的基因組研究顯示，其分類與標(biāo)準(zhǔn)的藥物敏感性試驗非常一致[29]。微生物耐藥、MIC 和靶基因的特異性突變之間存在很強的相關(guān)性，曲霉菌對三唑類抗真菌藥物的耐藥可使用全基因組測序的方法進行評估[30]。分析二代測序技術(shù)（NGS）提供的數(shù)據(jù)，回答特定的臨床問題，可使臨床醫(yī)生能夠根據(jù)數(shù)據(jù)對病情做出快速反應(yīng)。理想情況下，臨床級NGS 系統(tǒng)應(yīng)封裝為全自動或半自動設(shè)備，以最直接、最快速的方式處理樣本并輸出可參考數(shù)據(jù)。隨著我們對抗真菌耐藥性遺傳基礎(chǔ)的認(rèn)識不斷增長和加深，以及采用新的分子工具進行微生物診斷的研究，預(yù)計真菌耐藥性的分子檢測將成為臨床應(yīng)用的重要組成部分。

5 治療耐藥真菌感染藥物的檢測及藥物劑量優(yōu)化

多種因素可能影響抗真菌藥物的吸收、分布和代謝，包括感染的易感因素以及感染的部位和嚴(yán)重程度，所以侵襲性真菌感染的治療往往是復(fù)雜的，通常需要進行治療藥物監(jiān)測用于測定抗真菌藥物濃度，以防止劑量不足導(dǎo)致真菌耐藥和（或）治療失敗及劑量過高可能導(dǎo)致的藥物毒性。主要指南建議，一旦侵襲性曲霉菌病的三唑類藥物治療達(dá)到效果穩(wěn)定狀態(tài)，如果進行延長的預(yù)防療程，應(yīng)進行治療藥物監(jiān)測，包括美國傳染病學(xué)會的治療藥物監(jiān)測（TDM）和歐洲臨床微生物學(xué)和傳染病學(xué)會的治療藥物監(jiān)測（ESCMID）。使用伏立康唑治療侵襲性念珠菌病期間進行TDM[30]，使用5-氟胞嘧啶、伏立康唑和泊沙康唑治療時使用ESCMID[31]。泊沙康唑抗酵母菌的體外實驗發(fā)現(xiàn)，其濃度- 時間曲線下面積（AUC）和MIC 均與泊沙康唑的藥代動力學(xué)/藥效學(xué)（PK/PD）一致[32]。在侵襲性霉菌感染中，泊沙康唑、棘白菌素類藥物的AUC/MIC 決定了其治療效果[32]。峰值濃度（Cmax）和MIC 是兩性霉素B 和棘白菌素類藥物重要的PK/PD 指標(biāo)[32]。已經(jīng)證明，在三唑類耐藥真菌感染的治療中，使用更高劑量的伏立康唑和泊沙康唑治療有效[32]。

6 治療耐藥真菌的新藥物研制

耳道假絲酵母菌是一種多藥耐藥真菌。在美國，90%的耳道假絲酵母菌菌株對氟康唑具有耐藥性，約30% 的耳道假絲酵母菌菌株對兩性霉素B 具有耐藥性，對棘白菌素類具有耐藥性的耳道假絲酵母菌菌株不到5%；而印度耳道假絲酵母菌菌株中約有1/4 對兩種或兩種以上的抗真菌藥物具有耐藥性[33]。對于這些高度耐藥的念珠菌的治療，人們急切地期待著ibrexafungerp 的獲準(zhǔn)使用。ibrexafungerp 是一種新的抗真菌藥物，它與棘白菌素類藥物一樣，通過錨定葡聚糖合酶的結(jié)構(gòu)來攻擊真菌細(xì)胞壁。伊布昔芬（ERP）目前在臨床III 期試驗[34]中進行了評估，顯示出良好的口服生物利用度，使該藥物在長期或動態(tài)治療對三唑類抗真菌藥耐藥的酵母感染或有三唑類抗真菌藥禁忌證的患者中具有潛在的使用價值。Rezafungin 是一種新型棘白菌素類藥物，其III 期臨床試驗即將開始，其半衰期比其他棘白菌素類藥物長得多，可每周注射1 次[35]，重要的是，它可以高劑量給藥，從而克服某些類型真菌的棘白菌素類藥物耐藥。與其他棘白菌素類藥物相比，Rezafungin 具有更好的抗曲霉菌活性，因此可能成為治療耐三唑類藥物曲霉菌病的替代選擇[35]。

因耐三唑類藥物煙曲霉的流行病學(xué)不同，三唑類藥物不被普遍推薦為主要抗真菌藥物。脂質(zhì)體兩性霉素B 是治療三唑類藥物耐藥曲霉菌病的首選藥物[36]。目前正在臨床開發(fā)的新的抗真菌藥物包括fosmanogepix，也稱為APX001，是一種口服廣譜抗真菌藥物；orotomides 以二氫乳清酸脫氫酶為靶點[37]，沒有藥物間相互作用和毒性負(fù)擔(dān)，對煙曲霉菌具有很高的抗藥性[37]。

7 小 結(jié)

念珠菌和曲霉菌耐藥真菌的增加對人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，三唑類抗真菌藥耐藥的出現(xiàn)，需要人類更好地了解真菌潛在的耐藥機制。在全球范圍內(nèi)盡量減少耐三唑類煙曲霉分離株的出現(xiàn)，需要在農(nóng)業(yè)和臨床上采取嚴(yán)格的抗真菌管理措施。因此，建議應(yīng)用AFST、TDM 和準(zhǔn)確的物種鑒定作為常規(guī)抗真菌藥物決策的一部分。因抗真菌藥物的有限性和耐藥真菌的日益增加，需要人類發(fā)現(xiàn)新型抗真菌藥物。以HSP90、PKC 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑為靶點的輔助藥物可限制真菌產(chǎn)生藥物耐受，應(yīng)鼓勵其發(fā)展。