伴移行性環(huán)形紅斑的單純性大皰性表皮松解癥一家系報(bào)道及基因檢測(cè)

楊蓓蓓 武衛(wèi)民 肖 華

1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建福州，350005；2郴州市第一人民醫(yī)院皮膚科，湖南郴州，423000

單純性大皰性表皮松解癥(EBS)是一種遺傳性皮膚脆性疾病，屬常染色體顯性遺傳。多數(shù)于出生后數(shù)天或數(shù)月發(fā)病。皮損好發(fā)于手足以及其他受壓和摩擦部位。愈后遺留色素沉著，但不留瘢痕。本病常持續(xù)終生，部分患者青春期后癥狀改善。EBS的致病主要是由于編碼表皮和基底膜帶的角蛋白K5和K14的基因突變。迄今為止，在EBS各亞型患者中，已報(bào)道260多種K5和K14基因突變。本研究中，收集到一家系并通過全基因組外顯子測(cè)序和Sanger測(cè)序確定了KRT5基因的一個(gè)新的突變位點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者，女，1.5歲。因“全身紅斑、水皰1年余”就診?；颊呱?月余，雙側(cè)手足反復(fù)出現(xiàn)紅斑、 水皰，水皰愈合后未出現(xiàn)瘢痕。體格檢查：一般情況良好。皮膚科檢查：頸部、雙腋下、腹部、腹股溝、四肢關(guān)節(jié)及雙足可見大小不一環(huán)狀紅斑，邊緣區(qū)可見散在綠豆至蠶豆大水皰，部分皰壁緊張，部分皰壁松弛，水皰消退后不留瘢痕，愈合后伴有褐色色素沉著(圖1)，無指甲、毛發(fā)及黏膜受累，雙掌跖未見角化性皮疹。實(shí)驗(yàn)室檢查：血、尿、糞常規(guī)正常，肝腎功能、電解質(zhì)、微量元素、免疫球蛋白及補(bǔ)體、自身抗體譜均正常?；颊吒赣H訴5歲前在皺褶部位有紅斑水皰等皮損，未予處理，5歲后皮損基本自愈，患者父親皮膚科檢查無異常。皮膚組織病理：表皮內(nèi)皰(圖2)。免疫熒光dsg1、dsg3、BP180、BP230均陰性。

圖1 腹部、腹股溝、四肢關(guān)節(jié)及雙足可見大小不一環(huán)狀紅斑，邊緣區(qū)可見散在綠豆至蠶豆大水皰,水皰消退后不留瘢痕，愈合后伴有褐色色素沉著 圖2 表皮內(nèi)水皰 (HE,×100)

圖3 患者基因檢測(cè)結(jié)果

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 患兒父母簽署知情同意書后，抽取患兒及其父母外周血各2mL，收集于EDTA抗凝管中。

1.2.2 基因組DNA提取 采用常規(guī)方法提取DNA，使用核酸濃度測(cè)定儀 NanoDrop2000進(jìn)行標(biāo)本DNA濃度及純度測(cè)定。

1.2.3 高通量測(cè)序及Sanger測(cè)序驗(yàn)證 樣本送檢至諾禾致源基因檢測(cè)公司進(jìn)行高通量測(cè)序，通過IIIuminalHiSeq 6000平臺(tái)對(duì)基因組文庫(kù)進(jìn)行高通量、高深度測(cè)序。使用TRIMMOMIC v0.38軟件對(duì)檢測(cè)到的變異進(jìn)行過濾，設(shè)計(jì)引物并對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，對(duì)篩選出的突變位點(diǎn)所在的基因序列區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，應(yīng)用primer 5.0設(shè)計(jì)引物序列：KRT5-F：TGTAAACGACGGCCAGTAAGGGGGTCCAGTAGAGT-GC，KRT5-R：CAGGAAACAGCTATGACCATTTGACG-CTGGAGCTGCTA。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，61℃退火45s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、純化后，直接在一代測(cè)序儀上測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與KRT5基因參考序列進(jìn)行分析比對(duì)。

2 結(jié)果

注釋后的結(jié)果顯示：該患者及其父親KRT5基因外顯子9(移碼缺失c.1653_1654delCT)發(fā)生了突變(圖3)，通過Sanger測(cè)序?qū)RT5的新突變進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示：該患者及其父親攜帶同一突變(KRT5 c.1653_1654delCT)，其母親未發(fā)現(xiàn)該突變?；颊咴\斷為伴移行性環(huán)狀紅斑的單純性大皰性表皮松解癥(EBS-Migr)。

3 討論

單純性大皰性表皮松解癥(EBS)是一種較為少見的遺傳性皮膚脆性疾病，極小的創(chuàng)傷即可引起水皰形成，其特征在于表皮內(nèi)水皰[1]。KRT5和KRT14是角質(zhì)形成細(xì)胞中間絲蛋白的重要組成部分，對(duì)于維持基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和抗張力具有重要意義[2]。大多數(shù)EBS病例(75%)源于KRT5或KRT14基因的突變[3]。EBS伴有移行性環(huán)狀紅斑(EBS-Migr)是EBS的一種罕見亞型，其特征為環(huán)狀紅斑，伴有水皰形成和愈合后色素沉著。根據(jù)報(bào)道：KRT5中c.1649delG的雜合突變是導(dǎo)致EBS-Migr的特異性突變[4]。然而，根據(jù)既往報(bào)道，相同的突變會(huì)導(dǎo)致EBS的另一種罕見亞型：EBS伴有斑駁樣色素沉著(EBS-MP)[5]。既往報(bào)道指出了EBS-Migr相關(guān)的KRT5外顯子9的突變(c.1637del4[6],c.1638_1641del-CTAG[7],c.1649delG[4,8,9], and c.1650delC[10])。本研究中，我們收集到一家系并通過二代測(cè)序確定了KRT5基因的新突變：c.1653_1654delCT的雜合突變。

KRT5基因突變?cè)贓BS發(fā)病中起著十分重要的作用。KRT5為中間絲蛋白的重要組成部分，主要表達(dá)于表皮基底細(xì)胞層中，最終構(gòu)成細(xì)胞骨架，使表皮基底細(xì)胞與基底膜帶連接緊密[11]。KRT5基因的細(xì)胞遺傳學(xué)位置為12號(hào)染色體長(zhǎng)臂(12q13.13)。在大皰性表皮松解癥患者中已發(fā)現(xiàn)超過130個(gè)KRT5基因突變，這導(dǎo)致皮膚脆性增加及水皰形成。

當(dāng)環(huán)境因素(主要是外部創(chuàng)傷)觸發(fā)時(shí)，突變類型及其在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)水平?jīng)Q定了該疾病表型譜的總體嚴(yán)重程度[12]。KRT5的mRNA和蛋白質(zhì)水平在EBS患者細(xì)胞中沒有降低[13]，移碼突變可能由于異常的尾部區(qū)域延伸而干擾正常的蛋白質(zhì)折疊。

KRT5敲除小鼠模型的轉(zhuǎn)錄組分析顯示EBS患者病變皮膚內(nèi)IL-6和IL-1β的表達(dá)升高，免疫組化研究表明炎癥細(xì)胞和分子浸潤(rùn)[14]。雙醋瑞因(下調(diào)IL-1β的小分子)的局部應(yīng)用已被證明可以穩(wěn)定角蛋白中間絲并減少重度EBS患者的水皰[15]，表明EBS發(fā)病與炎癥相關(guān)。

c.1653_1654delCT的堿基缺失突變導(dǎo)致KRT5的C肽端缺失，表明C端框架移位有助于產(chǎn)生EBS-Migr在嬰兒期特征性的炎癥表型，這可能觸發(fā)了免疫反應(yīng)[8,16]。該表型的潛在機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

EBS的病理學(xué)機(jī)制從結(jié)構(gòu)蛋白擴(kuò)展到酶、信號(hào)受體、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和泛素化等[12]。這些類型的病理學(xué)不是EBS獨(dú)有的，因此，其他遺傳疾病療法的進(jìn)步很可能為EBS治療打開新的思路。