持續(xù)光照建立斑馬魚失眠模型及評(píng)價(jià)

冉思邈，夏 婧，夏樂旋，王 平

失眠是以頻繁而持續(xù)的入睡困難和睡眠維持困難并導(dǎo)致睡眠感不滿意為特征的一種睡眠障礙。各種原因?qū)е碌乃卟蛔憔鶎?duì)健康有著負(fù)面影響[1]。嚴(yán)重的睡眠障礙不僅影響患者的身心健康，也影響了患者的生活和工作質(zhì)量，長期失眠對(duì)個(gè)人和社會(huì)造成了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[2]。

斑馬魚與人類基因高度同源，可以通過光照、咖啡因、持續(xù)流動(dòng)水流、感官刺激、電刺激、物理搖晃等方式對(duì)斑馬魚進(jìn)行睡眠剝奪[3-7]，但目前尚未見斑馬魚成魚失眠模型的報(bào)道。該研究探索建立一種斑馬魚成魚失眠模型，并通過比較睡眠剝奪后斑馬魚的運(yùn)動(dòng)行為、學(xué)習(xí)記憶能力、生物鐘基因表達(dá)和腦部超微結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為失眠的機(jī)制和動(dòng)物模型研究提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4月齡同批次野生型AB系雄性斑馬魚160尾，購自國家斑馬魚資源中心，飼養(yǎng)在湖北中醫(yī)藥大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所斑馬魚實(shí)驗(yàn)室，房間內(nèi)溫度為(28.5±1)℃，光照條件為14 h光照，10 h黑暗，用自動(dòng)計(jì)時(shí)器設(shè)置每天8:00開燈，22:00關(guān)燈，養(yǎng)魚水pH值在7.0～8.0之間，導(dǎo)電率在450～500 μs/cm之間。每天早晚飼喂孵化好的豐年蝦各1次。

1.2 主要試劑與儀器熒光定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)，集中式斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(青島金水海洋生物設(shè)備有限公司)，凈水供水單元(上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，斑馬魚行為分析系統(tǒng)、T迷宮行為學(xué)追蹤系統(tǒng)(法國View Point Life Sciences公司)，PCR儀器(美國Bio-Rad 公司)。

1.3 方法

1.3.1造模方法 將160尾雄性斑馬魚隨機(jī)分為對(duì)照組(n=20，記為CK組)和睡眠剝奪組(n=140，記為SD組)，睡眠剝奪組分別設(shè)置不同剝奪時(shí)長(1～7 d)的亞組，即SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和SD7組。CK組斑馬魚保持正常的14 h/10 h光暗周期，SD組的斑馬魚根據(jù)組別給予相應(yīng)時(shí)長的持續(xù)光照。

1.3.2斑馬魚行為學(xué)檢測 光照結(jié)束后，每組隨機(jī)選取6尾斑馬魚進(jìn)行運(yùn)動(dòng)及學(xué)習(xí)記憶能力的檢測。利用斑馬魚行為分析系統(tǒng)追蹤斑馬魚的運(yùn)動(dòng)，設(shè)置追蹤參數(shù)Movement Threshold，Small/Large:25，Inact/Small:5。將4月齡斑馬魚放入直徑為15 cm的養(yǎng)魚缸中，缸中加入養(yǎng)魚水至魚缸的1/3，斑馬魚可以在缸中自由活動(dòng)，行為學(xué)分析系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)追蹤斑馬魚的運(yùn)動(dòng)并給出運(yùn)動(dòng)軌跡和數(shù)據(jù)分析，追蹤時(shí)間為24 h。利用改良后的T迷宮測試各組斑馬魚的學(xué)習(xí)記憶能力，測試前一天，讓斑馬魚在迷宮內(nèi)自由活動(dòng)20 min以適應(yīng)環(huán)境，減少新環(huán)境對(duì)斑馬魚的干擾。測試當(dāng)天，在甬道起點(diǎn)放入測試魚，讓其在T迷宮中自由活動(dòng)，測試時(shí)間為6 min，觀察并記錄魚從起點(diǎn)到找到TA區(qū)(當(dāng)魚找到并停留30 s后才算進(jìn)入了TA區(qū))的潛伏時(shí)間，測試結(jié)束后給予食物獎(jiǎng)勵(lì)。未找到TA區(qū)的魚，在6 min后引導(dǎo)其進(jìn)入TA區(qū)并停留30 s，同樣給予食物獎(jiǎng)勵(lì)。每條測試魚都有一個(gè)對(duì)應(yīng)編號(hào)的獨(dú)立容器, 測試結(jié)束后放回各自容器中。每天測試4次，分別于8:00、12:00、16:00、20:00準(zhǔn)時(shí)測試，記錄每次潛伏時(shí)間，以次日第5次潛伏時(shí)間作為考察其學(xué)習(xí)記憶能力的主要指標(biāo)。

1.3.3qRT-PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá) 光照結(jié)束后，每組隨機(jī)取3尾斑馬魚，在4 ℃冰水混合物中處死斑馬魚，隨即在冰上操作取腦，TRIzol 法提取腦組織總RNA，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。以Gapdh為內(nèi)對(duì)照，以對(duì)照組為外對(duì)照，利用Light Cycler 480熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，以2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。所用引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列表

1.3.4透射電鏡觀察斑馬魚大腦超微結(jié)構(gòu) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組各取1尾斑馬魚，在4 ℃冰水混合物中處死斑馬魚，隨即在冰上斷頭并剝離出完整的大腦，置于電鏡固定液中固定。室溫下固定2 h，再轉(zhuǎn)移至4 ℃保存?zhèn)溆?，制作切片。利用透射電子顯微鏡觀察各組斑馬魚大腦神經(jīng)元，比較不同組斑馬魚腦組織神經(jīng)元細(xì)胞器和超微結(jié)構(gòu)的改變。

2 結(jié)果

2.1 各組斑馬魚運(yùn)動(dòng)情況與CK組斑馬魚對(duì)比，SD1、SD2、SD3組靜息時(shí)間均增多(P<0.05)，SD4～SD7組斑馬魚靜息時(shí)間未見明顯變化(P>0.05)，可能當(dāng)睡眠剝奪時(shí)長超過3 d時(shí)，斑馬魚在持續(xù)光照條件下逐漸耐受，故該實(shí)驗(yàn)選取了SD1～SD3各組斑馬魚進(jìn)行進(jìn)一步的探索。見圖1、2。圖3為各組斑馬魚大、小運(yùn)動(dòng)時(shí)間，大、小運(yùn)動(dòng)距離，大、小運(yùn)動(dòng)計(jì)數(shù)匯總，其中SD3組大運(yùn)動(dòng)時(shí)間及大運(yùn)動(dòng)計(jì)數(shù)較CK組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而各組間大運(yùn)動(dòng)距離、小運(yùn)動(dòng)時(shí)間、小運(yùn)動(dòng)距離、小運(yùn)動(dòng)計(jì)數(shù)對(duì)比則無明顯差異(P>0.05)。

圖1 各組斑馬魚靜息時(shí)間與CK組比較：*P<0.05

圖2 各組斑馬魚運(yùn)動(dòng)軌跡

圖3 各組斑馬魚大小運(yùn)動(dòng)計(jì)數(shù)、時(shí)間及距離與CK組比較：*P<0.05

2.2 各組斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力情況圖4為各組斑馬魚T迷宮5次測試結(jié)果，第5次測試結(jié)果顯示，CK組與SD各組間比較，CK組斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力較SD1組強(qiáng)(P<0.05)，CK組斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力比SD2、SD3組強(qiáng)(P<0.01)；SD各組間對(duì)比，SD1組斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力較SD2、SD3組斑馬魚強(qiáng)(P<0.01)，SD2組斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力較SD3斑馬魚強(qiáng)(P<0.01),見圖4、5。

圖4 各組斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力統(tǒng)計(jì)圖

2.3 各組斑馬魚生物鐘基因變化情況各組斑馬魚腦組織qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，SD3組斑馬魚腦部Per1a、Per2、Bmal1、Cry1b mRNA水平表達(dá)與CK組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而其余各組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組斑馬魚各指標(biāo)mRNA水平表達(dá)

2.4 各組斑馬魚大腦病理變化情況透射電子顯微鏡下可見CK組斑馬魚大腦神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核(N)結(jié)構(gòu)完整，染色質(zhì)顏色稍淺，團(tuán)聚在核內(nèi)，線粒體(M)豐富且結(jié)構(gòu)完整，可見散在分布的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rER)。SD2及SD3組斑馬魚大腦神經(jīng)元出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，鏡下可見細(xì)胞核塌陷，邊界破解甚至溶解，染色質(zhì)固縮，線粒體出現(xiàn)腫脹，甚至大量空泡。見圖6。

圖5 各組斑馬魚T迷宮軌跡圖

圖6 各組斑馬魚大腦神經(jīng)元病理改變 ×1 200A～D：CK組、SD1組、SD2組、SD3組

3 討論

斑馬魚和人類一樣，白天活躍，夜間因褪黑激素達(dá)到頂峰，進(jìn)入睡眠階段，具有明顯的晝夜節(jié)律，研究[8]顯示了其與人類慢波睡眠和快速眼動(dòng)睡眠相似的慢爆發(fā)睡眠和傳播波睡眠，因此，選擇斑馬魚作為失眠動(dòng)物模型具有良好的優(yōu)勢。

光照可以明顯抑制斑馬魚的睡眠，當(dāng)斑馬魚在生物夜晚的最后6 h暴露在150 lux的光線下，睡眠時(shí)間減少90%以上，但長時(shí)間在恒定150 lux光照條件下，1～2周內(nèi)睡眠逐漸恢復(fù)[9]。正如光照影響小鼠的睡眠一樣[10]。該研究觀察到光照4～7 d的斑馬魚靜息時(shí)間與空白組未見差異，這可能是斑馬魚耐受光照開始恢復(fù)睡眠，因此，未選擇此階段的斑馬魚進(jìn)行失眠狀態(tài)的模擬。完全睡眠剝奪24 h后斑馬魚出現(xiàn)認(rèn)知損害[11]，該研究觀察到進(jìn)行光照后的斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力下降。這與人類失眠后出現(xiàn)的健忘、記憶力下降的表現(xiàn)具有相似性，因此，運(yùn)用斑馬魚模擬失眠是切實(shí)可行的。

光照時(shí)間太短可能不能模擬失眠，時(shí)間過長斑馬魚可能出現(xiàn)光照耐受，形成光照條件下的睡眠節(jié)律而恢復(fù)睡眠。該研究在行為學(xué)結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)置了1、2、3 d的不同光照時(shí)間，比較不同光照時(shí)間下斑馬魚的運(yùn)動(dòng)行為、學(xué)習(xí)記憶能力、時(shí)鐘基因以及腦部超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，隨著光照時(shí)間的延長，斑馬魚的學(xué)習(xí)記憶能力持續(xù)下降。而運(yùn)動(dòng)形式和生物鐘基因均在光照3 d時(shí)才出現(xiàn)改變，SD3組斑馬魚大運(yùn)動(dòng)時(shí)間、計(jì)數(shù)均較CK組減少，大運(yùn)動(dòng)指的是斑馬魚在運(yùn)動(dòng)中整個(gè)身體的運(yùn)動(dòng)幅度超過了設(shè)置值的上限，為過度行為，此行為可間接說明其活動(dòng)過度，與人類失眠后焦慮、易激惹、活動(dòng)過度行為相吻合。晝夜節(jié)律的產(chǎn)生和維持與生物鐘基因的周期性表達(dá)有關(guān)，生物節(jié)律是由一組生物鐘基因如Bmal1、Clock、Cry和Per等調(diào)控的，目前人類在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的時(shí)鐘基因Per、Cry、Clock、Bmal對(duì)生物體內(nèi)的生物鐘都起著重要的調(diào)控作用[12]。Perl和Per2基因可能是光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的靶基因，因?yàn)檫@兩個(gè)基因?qū)獾姆磻?yīng)非常強(qiáng)烈，Per基因可以通過自身節(jié)律表達(dá)的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)中樞節(jié)律的調(diào)控，從而對(duì)生物的晝夜節(jié)律產(chǎn)生影響。Bmal1是調(diào)節(jié)生物節(jié)律的重要轉(zhuǎn)錄因子，在時(shí)鐘體系中發(fā)揮著重要的作用。在對(duì)Cry的研究中表明，持續(xù)黑暗的條件下Cry1突變會(huì)使生物體內(nèi)的生物鐘節(jié)律加快，光照條件對(duì)其有較大的影響。該研究選用常見的生物鐘基因Per1a、Per2、Bmal1、Cry1b觀察其mRNA表達(dá)水平來反映光照對(duì)其影響，結(jié)果顯示這些指標(biāo)均在連續(xù)光照3 d時(shí)出現(xiàn)改變。電鏡下觀察到光照2 d后的斑馬魚出現(xiàn)神經(jīng)元損傷和細(xì)胞凋亡，當(dāng)光照時(shí)間延長到3 d時(shí)，神經(jīng)元損傷情況則加重。因斑馬魚腦部體積較小，該次腦部取材為完整大腦，未能單獨(dú)取到與失眠、生物鐘關(guān)系最為密切的相關(guān)腦區(qū)，需要進(jìn)一步研究。