miR-34a在過敏性鼻炎小鼠中表達(dá)及治療的作用研究

謝偉偉，林秀聯(lián)，龍 綺，孟 光，劉 碩

過敏性鼻炎屬于鼻黏膜的變應(yīng)性和炎癥性疾病。其主要發(fā)病機(jī)制為患者暴露于變應(yīng)原，從而介導(dǎo)IgE釋放介質(zhì)，激活多種免疫活性細(xì)胞釋放細(xì)胞因子參與發(fā)病過程[1]。臨床表現(xiàn)為鼻癢、鼻塞、打噴嚏和流清涕等，顯著影響患者生活質(zhì)量。然而目前尚不完全明確發(fā)病機(jī)制，藥物治療僅能緩解患者80%左右的癥狀。加之過敏性鼻炎極易復(fù)發(fā)，病情反復(fù)，給臨床治療帶來一定障礙[2]。因此，深入探索過敏性鼻炎的特異性標(biāo)志物及尋找可靠有效的治療靶點(diǎn)顯得極為重要。近年研究[3]顯示微小RNA(microRNA，miR)參與了過敏性鼻炎發(fā)生發(fā)展過程。其中，miR-34是一類研究較多的miR分子，在多種炎性疾病發(fā)病中發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)炎癥反應(yīng)失衡[4-5]，促炎因子表達(dá)上升，抑炎因子表達(dá)下調(diào)[6]，但miR-34在過敏性鼻炎中表達(dá)罕見報道。因此，該研究旨在通過qRT-PCR檢測過敏性鼻炎小鼠外周血miR-34a的表達(dá)水平，并采用miR-34抑制劑及陰性對照干預(yù)過敏性鼻炎小鼠，觀察其對小鼠癥狀及炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料40只5～6周齡的SPF級BALB/c 小鼠，雌雄各20只，體質(zhì)量18～22 g；該研究中的動物實驗得到武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)。卵清蛋白(OVA)購自美國Sigma公司，ELISA試劑盒購自美國R&D公司，血漿/血清RNA純化試劑盒(GenEluteTM Plasma/Serum RNA Purification Mini Kit)購自美國Sigma公司，兩步法實時定量PCR試劑盒(QuantiTect Reverse Transcription Kit)購自美國Qiagen公司，miR-34a抑制劑購自廣州銳博生物科技有限公司，NanoDrop 微量分光光度計購自美國Thermo Fisher Scientific公司，ABI 7500 qRT-PCR購自美國Applied BioSystems公司，流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司，miR-34a和炎癥因子的引物序列購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 動物分組及模型制備選取10只作為空白對照組，余下30只BALB/c 小鼠進(jìn)行建模，建模方法為：500 μg OVA溶于10 μl生理鹽水配制成OVA溶液，腹腔注射隔天1次，連續(xù)7 次。第15 天開始激發(fā)實驗，以5% OVA溶液雙側(cè)鼻腔點(diǎn)鼻，0.02 ml/側(cè)，1 次/d，連續(xù)7次[7-8]?？瞻讓φ战M注射等量生理鹽水，模型組于激發(fā)實驗結(jié)束15 min 內(nèi)小鼠抓鼻次數(shù)明顯增加，表明成功建立模型，將造模成功的30 只小鼠隨機(jī)分為模型組、miR-34a抑制劑組及陰性對照組(NC組)。

1.3 干預(yù)方法miR-34a抑制劑組：造模結(jié)束后，小鼠尾部靜脈注射100 μl miR-34a抑制劑載體混合溶液，均連續(xù)給藥10 d；NC組在小鼠尾部靜脈注射100 μl陰性轉(zhuǎn)染質(zhì)粒；模型組給予100 μl生理鹽水。

1.4 小鼠臨床癥狀評分干預(yù)結(jié)束后采用錄像觀察小鼠30 min的打噴嚏、撓鼻、鼻涕等癥狀。標(biāo)準(zhǔn)[9]中① 鼻癢，1 分：輕搔鼻 1～2 次；3分：劇烈抓撓鼻面不止；2 分：介于二者之間。② 噴嚏，1 分：1～3 個；2 分：4～10 個；3 分：11 個以上。③ 流涕，1 分：流至前鼻孔；2 分：超出前鼻孔；3 分：涕流滿面，均采用疊加量化記分法。

1.5 血清IgE檢測干預(yù)后于眼眶靜脈取血2 ml。血樣靜置后離心，取上層血清ELISA檢測IgE水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作進(jìn)行。

1.6 血清總RNA的提取與qRT-PCR檢測運(yùn)用GenEluteTMPlasma/Serum RNA Purification Mini Kit提取各組小鼠的血清的總RNA。采用NanoDrop 微量分光光度計測定總RNA濃度，同時計算A260/A280比值，計算純度；通過RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品RNA完整性。采用QuantiTect Reverse Transcription Kit合成第一鏈互補(bǔ)cDNA，采用miScript SYBR GreenPCR Kit進(jìn)行qRT-PCR檢測。采用U6作為miR-34a的內(nèi)參，采用GAPDH作為炎性因子的內(nèi)參，最后通過2-△△Ct公式計算miR-34a 和炎癥因子mRNA的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 流式細(xì)胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)干預(yù)結(jié)束后在無菌條件下于股靜脈采集肝素靜脈血2 ml。各流式管中加入50 μl全血，振蕩混勻，避光靜置15 min后加0.5 ml溶血劑避光靜置10 min后加入250 μl PBS。1管加4色標(biāo)記單克隆熒光抗CD45-FITC/CD3-PCS/CD4-RD1/CD8-ECD 5 μl，CD45+設(shè)門，分析CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)率。

1.8 Western blot檢測鼻黏膜組織中IL-2、IFN-γ表達(dá)各組小鼠鼻黏膜組織加入少量胰蛋白酶消化后，加入蛋白裂解液快速混勻，運(yùn)轉(zhuǎn)離心機(jī)后保留上清液，放置在75 ℃水浴10 min使蛋白變性后放入樣孔中，每組取5 μg蛋白進(jìn)行電泳實驗。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜TBS浸泡10 min，反復(fù)PBS沖洗，5 min/次，加入1抗IL-2、IFN-γ抗體(1 ∶1 000)孵育過夜，后放入2抗辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，(1 ∶1 000)雜交沖洗。浸入ECL工作液，檢測、顯色等步驟，成像系統(tǒng)對印跡條帶的吸光度進(jìn)行分析。β-actin 作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠癥狀評分比較與空白對照組相比，模型組評分增加(P<0.05)，miR-34a抑制劑組則降低，仍高于空白對照組，但顯著低于NC組(P<0.05)，NC組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠癥狀評分比較

2.2 各組血清IgE水平與空白對照組相比，模型組血清IgE水平增加(P<0.05)，miR-34a抑制劑組則降低，仍高于空白對照組，但低于NC組(P<0.05)，NC組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組血清IgE水平

2.3 各組炎癥因子 mRNA表達(dá)情況與空白對照組相比，模型組IL-6、IL-8、IL-10、MMP-2、MMP-9及VCAM-1 mRNA增加(P<0.05)，IL-35下降(P<0.05)，與模型組相比，miR-34a抑制劑組IL-6、IL-8、IL-10、MMP-2、MMP-9及VCAM-1 mRNA下降，但miR-34a抑制劑組低于NC組(P<0.05)，IL-35上升，但miR-34a抑制劑組高于NC組(P<0.05)，NC組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組炎癥因子 mRNA表達(dá)情況

2.4 各組小鼠CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)與空白對照組相比，模型組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+下降，與模型組相比，miR-34a抑制劑組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+增加，但miR-34a抑制劑組高于NC組(P<0.05)，NC組與模型組無差異(P>0.05)。見表3及圖3、4。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測圈門策略 ×20A、B：圈門策略圖；C、D：CD3+、CD4+、CD8+表達(dá)情況

表3 各組小鼠CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)

2.5 Western blot檢測各組小鼠鼻黏膜組織中IL-2、IFN-γ表達(dá)與空白對照組相比，模型組IL-2、IFN-γ水平下降(P<0.05)，與模型組相比，miR-34a抑制劑組IL-2、IFN-γ水平升高，miR-34a抑制劑組高于NC組(P<0.05)，模型組與NC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖5。

圖5 各組小鼠鼻黏膜組織中IL-2、IFN-γ表達(dá)

表4 各組小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平

3 討論

過敏性鼻炎是患者暴露于致敏原后導(dǎo)致的鼻黏膜慢性非感染性炎性疾病，主要由IgE介導(dǎo)釋放組胺及免疫和細(xì)胞因子引起。過敏性鼻炎發(fā)病受到基因和環(huán)境等多重因素的影響，基因表達(dá)異常是主要病理機(jī)制[10]，但其機(jī)制尚未完全闡明清楚，microRNAs是一類長度約19～23 nt的非編碼RNA分子，但到近年來，其廣泛的生物學(xué)調(diào)控功能才逐漸被揭示出來，可與靶基因mRNA堿基配對引導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，參與多種細(xì)胞增殖、分化和凋亡等諸多生理過程[11]。

miR-34屬于一類在哺乳動物中廣泛分布的高度保守miRNA家族。miR-34a定于lp36.22，目前發(fā)現(xiàn)miR-34a在氣道變應(yīng)性疾病中發(fā)揮重要作用，

圖4 各組流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果代表圖 ×20A：空白對照組； B：模型組； C：miR-34a抑制劑組； D：NC組；1：各組CD3+表達(dá)情況；2：各組CD4+、CD8+表達(dá)情況

Solbcrg et al[12]研究顯示miR-34s(miR-34c-5p、miR-34b-5p)在哮喘患者的支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著下調(diào)。該研究采用 OVA 造模過敏性鼻炎小鼠，小鼠均表現(xiàn)出明顯的撓鼻、噴嚏和流涕，疊加各項分?jǐn)?shù)計算總分大于 5 分，說明造模成功。隨后通過qRT-PCR檢測小鼠外周血miR-34a的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與空白對照組小鼠比較，模型組小鼠的miR-34a相對表達(dá)水平增加(P<0.05)。提示miR-34a可能參與過敏性鼻炎的病理過程，由于血清中都穩(wěn)定存在大量特異性表達(dá)的microRNAs，外周血可重復(fù)快速獲得，使得qRT-PCR檢測結(jié)果更快獲取到，技術(shù)成本較低，可操作性高，為了進(jìn)一步探討特異性 miR-34a對小鼠過敏性鼻炎的治療作用，該研究采用特異性miR-34a抑制劑及任意序列的陰性對照物滴鼻干預(yù)小鼠過敏性鼻炎，首先評估對臨床癥狀的改善情況，結(jié)果顯示，miR-34a抑制劑治療過敏性鼻炎組小鼠的臨床癥狀評分顯著下降，低于模型組，但仍高于空白對照組(P<0.05)。接下來筆者繼續(xù)比較各組血清IgE水平，結(jié)果顯示，模型組血清IgE水平增加(P<0.05)，miR-34a抑制劑組則降低，但仍高于空白對照組(P<0.05)，血清IgE 升高是過敏性疾病最有力的提示，過敏原刺激產(chǎn)生的IgE 與肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等表面相應(yīng)受體結(jié)合，誘導(dǎo)過敏性炎癥[13]。已經(jīng)有研究[14]顯示IL-4及IL-2在過敏性鼻炎中也起到關(guān)鍵性的作用，IFN-γ分泌的下調(diào)會增加過敏性疾病發(fā)病的可能,患嚴(yán)重哮喘的患者接觸過敏原后常呈現(xiàn)出的IFN-γ下調(diào)。該研究表明抑制miR-34a表達(dá)可有效緩解變應(yīng)性免疫反應(yīng)，炎癥反應(yīng)是過敏性鼻炎發(fā)病的主要特征。該研究表明模型組小鼠促炎因子IL-6、IL-8、IL-10、MMP-2、MMP-9及VCAM-1 mRNA上調(diào)，抑炎因子IL-35下調(diào)，在注射miR-34a抑制劑后則逆轉(zhuǎn)了促炎因子和抑炎因子的變化。IL-6和IL-10均為常見的促炎因子，參與免疫耐受維持作用，兩者均在過敏性鼻炎患者中表達(dá)上調(diào)，參與炎性疾病進(jìn)展。IL-35由IL-12a、EB病毒誘導(dǎo)基因3亞基構(gòu)成, 具有免疫抑制/抑炎活性[15]。MMP-2和MMP-9屬于MMP 家族，可促進(jìn)炎癥細(xì)胞向氣道黏膜固有層浸潤激活的炎癥細(xì)胞通過表達(dá)釋放MMP-2和MMP-9，形成正反饋，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。而I型血管細(xì)胞黏附蛋白(VCAM-1)與嗜酸性粒細(xì)胞表面受體結(jié)合從而黏附于血管壁，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的遷移，參與變態(tài)反應(yīng)。該研究表明抑制miR-34a表達(dá)可抑制炎癥反應(yīng)，Tregs在變態(tài)反應(yīng)性疾病的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮十分重要的作用，機(jī)體發(fā)生炎癥后，外周血中CD3+及CD4+降低，提示免疫功能下降，而在抑制miR-34a表達(dá)則可提升CD3+、CD4+、CD4+/CD8+表達(dá)率，表明抑制miR-34a后提高了小鼠免疫功能。

綜上所述，miR-34a抑制劑有效緩解小鼠過敏性鼻炎的臨床癥狀和炎癥水平，提示miR-34a作為基因治療小鼠過敏性鼻炎具有巨大潛力，但該研究尚未觀察其安全性，今后研究中需進(jìn)一步研究安全性。