• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      新疆海島棉胚性愈傷組織培養(yǎng)體系

      2022-07-13 08:02:36王為然朱家輝寧新民阿里甫艾爾西
      新疆農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年6期
      關(guān)鍵詞:海島棉菌苗胚軸

      楊 靜,王為然,王 萌,朱家輝,寧新民,阿里甫·艾爾西,閔 玲,孔 杰,3

      (1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,烏魯木齊 830091;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070; 3.國家棉花工程技術(shù)研究中心,烏魯木齊 830091)

      0 引言

      【研究意義】棉花基因工程育種中組織再生是關(guān)鍵環(huán)節(jié),其包括愈傷組織誘導(dǎo)增殖、體細(xì)胞胚形成和植株再生3個重要階段[1],而高質(zhì)量的愈傷細(xì)胞對獲得胚性愈傷及再生植株非常重要。圍繞海島棉胚性愈傷組織培養(yǎng)體系開展研究,篩選出增殖能力好的海島棉材料,對新疆海島棉育種提供新策略具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】1971年Beasley利用陸地棉胚珠珠孔誘導(dǎo)出愈傷組織[2];1983年Davidonis獲得第一株體細(xì)胞再生植株[3];1996年利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù),第一代轉(zhuǎn)基因的抗蟲和抗除草劑的棉花誕生[4]。而后隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展,近年來,棉花再生體系得到不斷的完善和提升。但相比油菜,玉米,大豆等作物,仍存在體細(xì)胞發(fā)生率低、培養(yǎng)周期長,成苗率低,畸形胚高等[5]。獲得體細(xì)胞胚的野生棉種有:擬似棉[6]、克勞茨基棉[7]、戴維遜氏棉[8-9]、旱地棉、異常棉、瑟伯氏棉、雷蒙德氏棉、斯篤克氏棉、比克氏棉[9]、灰白棉、澳洲棉[10]、奈爾遜氏棉[11]、陸地棉[3]等部分棉花種。其中僅有克勞茨基棉、斯篤克氏棉、擬似棉、戴維遜氏棉、雷蒙德氏棉、奈爾遜氏棉、陸地棉[3]等中的少量品種,獲得正常的再生植株。在海島棉中,Sakhanokh實(shí)現(xiàn)了體細(xì)胞的再生培養(yǎng),但試驗(yàn)品種單一,無法應(yīng)用推廣[10]。大多數(shù)研究是以海島棉的莖尖[12],叢生芽[13]等部位進(jìn)行的組織培養(yǎng),通過嫁接[14]的手段獲得再生植株,這種方法會存在嵌合體,需要對轉(zhuǎn)化苗多次篩選[14],增加了后期驗(yàn)證的次數(shù),也存在假陽性,并不適用于后續(xù)研究?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過組織培養(yǎng)篩選出再生能力強(qiáng)的基因型品種,不斷拓寬棉花基因工程中轉(zhuǎn)化受體的范圍,是重要的研究方向。目前在棉花體細(xì)胞再生的研究中,對新疆海島棉再生體系研究很少,制約了基因工程技術(shù)改良新疆海島棉品種改良中的應(yīng)用。開展高質(zhì)量的愈傷細(xì)胞培養(yǎng),篩選再生能力強(qiáng)的基因型品種非常必要?!緮M解決的關(guān)鍵問題】以新疆海島棉為材料,研究不同基因型品種的再生能力及其對激素誘導(dǎo)的響應(yīng),篩選出愈傷增殖好、且能夠轉(zhuǎn)化的海島棉材料,完善新疆海島棉再生體系,培育再生能力強(qiáng)的品種,為新疆海島棉基因工程育種提供支持。

      1 材料與方法

      1.1 材 料

      選取 105份國內(nèi)外海島棉材料,品種均進(jìn)行連續(xù)多年自交,遺傳穩(wěn)定。海島棉種子由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供,Jin668作為陸地棉對照由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花團(tuán)隊(duì)提供。試驗(yàn)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。表1

      表1 海島棉試驗(yàn)材料Table 1 The experiment accessions of island cotton

      1.2 方 法

      1.2.1 新疆海島棉棉胚性愈傷組織誘導(dǎo)

      種子處理:選取籽粒飽滿的無損種子,剝?nèi)シN殼。用75%NaAC(V/V)消毒3次,每次消毒8~10 min,無菌蒸餾水快速清洗3次,之后用無菌蒸餾水泡3次,直至種子充分吸脹,每次5~8 min。

      無菌苗培養(yǎng):將吸脹后的種子接種于1/2MS + 1.5%(W/V)葡萄糖的培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)36~48 h后,扶苗。隨后繼續(xù)避光培養(yǎng)生長3~5 d,獲得黃化的無菌苗。

      農(nóng)桿菌浸染:帶有紅色熒光蛋白的載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化參考金雙俠等[15-16]實(shí)驗(yàn)方法。將活化之后的農(nóng)桿菌離心收集菌株,懸浮于MGL活化培養(yǎng)基(胰蛋白胨5 g/L+NaCl 5 g/L +MgSO4·7H2O 0.1 g/L+KH2PO40.25 g/L+甘露醇5 g/L+甘氨酸1 g/L)中,并加入0.1%的As(乙酰丁香酮),以300 r/min,28℃搖床活化30 min。將去除根部和子葉的無菌苗下胚軸,切成0.5~0.7 cm的小段作為外植體,置于活化好的農(nóng)桿菌菌液中攪勻,靜置8~10 min,倒掉菌液,濾紙吸干殘余菌液,置于超凈臺10min,吹干表面菌液。

      共培養(yǎng):將干燥好的下胚軸切段分散布于墊有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基+1%(V/V)MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽+ 0.2%(W/V)L-Gly +0.1%(V/V)B5培養(yǎng)基維生素+ 0.60 mg/L 2, 4-D + 0.1 mg/L KT + 3%(W/V)葡萄糖 + 0.26%(W/V)phytagel]中,保證每段下胚軸均接觸到濾紙,隨后置于21℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)36~48 h。

      愈傷組織誘導(dǎo);將浸染共培養(yǎng)后的下胚軸切段接種于2,4-D誘導(dǎo)培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基+1%(V/V)MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽+ 0.2%(W/V)L-Gly +0.1%(V/V)B5培養(yǎng)基維生素+ 0.60 mg/L 2, 4-D + 0.08 mg/L KT + 3%(W/V)葡萄糖 + 0.26%(W/V)phytagel+0.05 mg/mL卡那霉素]上,愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖在溫度(28±2)℃,光照強(qiáng)度1 600 lx,置于光照培養(yǎng)室,每天光照14 h進(jìn)行培養(yǎng)。

      1.2.2 誘導(dǎo)再生變化

      表型:當(dāng)下胚軸兩端有膨大之后,愈傷組織開始增殖時,進(jìn)行拍照。

      重量:當(dāng)下胚軸兩端有膨大突起的細(xì)胞生長時,定期稱量其重量。

      1.2.3 紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)化

      對生長良好的下胚軸進(jìn)行紅色熒光蛋白細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并觀察。將下胚軸從培養(yǎng)基中取出,置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。對兩端膨大組織細(xì)胞,取少許加水后的細(xì)胞懸浮液置于載玻片上形成薄層,置于熒光顯微鏡下檢測,發(fā)紅色熒光的為轉(zhuǎn)入紅色熒光蛋白的細(xì)胞,若不發(fā)熒光則為未轉(zhuǎn)入成功。

      如果說隱喻是利用事物之間的相似性促動范疇的擴(kuò)展,那么轉(zhuǎn)喻就是利用事物的相關(guān)性促動的擴(kuò)展。有些范疇化既包含著隱喻又包含著轉(zhuǎn)喻,兩者共同作用。圖式是人們在認(rèn)識客觀世界的過程中基于身體經(jīng)驗(yàn)而形成的固定的認(rèn)知結(jié)構(gòu)模式,如路徑圖式、終點(diǎn)圖式,圖式與圖式之間存在著轉(zhuǎn)換關(guān)系,由于這種轉(zhuǎn)換關(guān)系促動的多義現(xiàn)象就是圖式轉(zhuǎn)換因素。規(guī)約意象是人腦中反映的客觀事物和情景的形象和印記,它在量詞范疇擴(kuò)展方面發(fā)揮了極其重要的作用,文中也詳細(xì)的以日語中的量詞“本”為例解釋了圖式轉(zhuǎn)換和規(guī)約意象的作用。

      1.2.4 細(xì)胞形態(tài)

      將正常增殖的下胚軸愈傷組織取出,對其進(jìn)行分離,用1%的甲苯胺藍(lán)染色30 s,置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 利用2,4-D培養(yǎng)基對海島棉愈傷組織誘導(dǎo)

      研究表明,滅菌吸脹后的種子,在無菌苗培養(yǎng)基中經(jīng)過5~7 d的培養(yǎng)后,海島棉無菌苗下胚軸長勢較強(qiáng),粗壯,對照陸地棉Jin668的無菌苗下胚軸較為纖細(xì)。將無菌苗下胚軸切段作為外植體,浸染農(nóng)桿菌后,置于2,4-D誘導(dǎo)培養(yǎng)基上愈傷誘導(dǎo)、增殖。培養(yǎng)28 d后,海島棉下胚軸兩端開始膨大生長,切口處的愈傷組織細(xì)胞增多,且不同品種間表現(xiàn)出質(zhì)地、顏色及形態(tài)上的差異。對照J(rèn)in668的下胚軸表面光滑,兩端切口處慢慢變?yōu)樽厣蚝谏D1

      注:A.陸地棉Jin668無菌苗(CK);B.Jin668下胚軸;C.海島棉無菌苗;D~F.923、971、962下胚軸。Bars 值均為1 cm

      2.2 海島棉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)后的表型

      研究表明,利用農(nóng)桿菌浸染的海島棉下胚軸置于2,4-D培養(yǎng)基中培養(yǎng)4個月后,愈傷組織的質(zhì)地、顏色、增殖體積呈現(xiàn)明顯差異。

      第一種為不能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的材料,表現(xiàn)為3種形態(tài)。一是能產(chǎn)生愈傷組織,增殖較慢,顏色為棕褐色,下胚軸兩端呈硬質(zhì)化,該類型愈傷組織最后逐漸死亡,代表性材料有923等39份;二是愈傷組織呈米色或無色,部分呈褐色,質(zhì)地松軟呈稀泥狀,增殖較慢,且后期無增殖跡象,代表性材料有1 007等42份;三是下胚軸兩端呈蓬松狀,長時間培養(yǎng)得到米黃色絮狀,后期基本不再增殖,并逐漸死亡,代表性材料有972等15份。

      第二種是能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的材料。愈傷組織呈黃綠色或棕紅色,質(zhì)地疏松,且下胚軸兩端不斷膨大增殖明顯,代表材料為986等共9份材料;對照J(rèn)in668也呈現(xiàn)出這種表型,而未浸染的Jin668愈傷則發(fā)生褐化,變黑,最后死亡,基本未發(fā)生增殖。圖2

      注:A.未浸染農(nóng)桿菌的陸地棉Jin668(CK)的愈傷組織;B~C,E~F.培養(yǎng)4個月后的愈傷組織;D.Jin668浸染農(nóng)桿菌后培養(yǎng)4個月的愈傷組織。Bars值均為1 cm

      2.3 不同培養(yǎng)時間海島棉材料誘導(dǎo)增殖變化

      圖3 海島棉材料下胚軸增殖變化Fig.3 Variation of hypocotyledonary axis proliferation different accessions of island cotton

      2.4 海島棉材料愈傷增殖質(zhì)量變化

      研究表明,隨著培養(yǎng)時間變化,不同海島棉材料增殖速率和質(zhì)量呈現(xiàn)出差異性。不同品種間愈傷組織大致呈現(xiàn)出淺黃、綠色、棕色、淺紅色4種顏色,質(zhì)地主要分為疏松、僵硬、硬、較軟及稀泥狀等類型,愈傷細(xì)胞的形態(tài)多為長柱形和近球形。愈傷呈現(xiàn)出的顏色、質(zhì)地、細(xì)胞形態(tài)等指標(biāo)篩選出962、964、986、1010、1011、1025、1052、1086、1103共9份愈傷增殖較好的材料。表2,圖4

      表2 不同誘導(dǎo)時間下胚軸愈傷組織質(zhì)量(部分)Table 2 Callus quality of hypocotyl at different induction time

      注:A~H分別為962,964,1010,1011,1025,1052,1086和1103培養(yǎng)4個月后的愈傷組織。Bars值均為1 cm

      2.5 海島棉農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后細(xì)胞特征

      研究表明,以964為代表的2份材料轉(zhuǎn)化效果好,經(jīng)誘導(dǎo)之后下胚軸增殖較快愈傷顏色呈黃綠或米黃色,質(zhì)地松散,且轉(zhuǎn)化成功的紅色熒光的細(xì)胞多而聚集;以1010為代表的3份材料轉(zhuǎn)化效果一般,雖然下胚軸長勢良好,但紅色熒光蛋白細(xì)胞,熒光信號較弱。且細(xì)胞呈圓球形、橢球形,細(xì)胞較為分散;以1103為代表的2份材料轉(zhuǎn)化效果差,主要表現(xiàn)為愈傷呈棕紅色、淡綠色,部分則無色,能夠轉(zhuǎn)化的細(xì)胞較少,熒光信號較弱。細(xì)胞多呈圓柱形或橢球形,較為聚集;以1052為代表的2份材料,轉(zhuǎn)化效率極低,愈傷呈棕色或無色,質(zhì)地軟,如稀泥的,紅色熒光蛋白的細(xì)胞極少,多呈圓柱形、橢球形及部分不規(guī)則細(xì)胞,且較為分散。圖5,圖6

      注:A~D.Jin668、964、1086和1052培育4個月后的愈傷組織;E~H.Jin668、964、1086和1052培育4個月愈傷組織中的紅色熒光蛋白;I~L.Jin668、964、1086和1052培育4個月后愈傷組織的細(xì)胞形態(tài)(甲苯胺藍(lán)染色).A,B,C,D的bars值為1cm,E、F、G、H、I、J、K、L為100 μm

      注:A,D.海島棉1010和1103培育4個月后的愈傷組織;B,E.1010和1103培育4個月后愈傷組織中的紅色熒光蛋白;C,F:1010和1103培育4個月后愈傷組織的細(xì)胞形態(tài)(甲苯胺藍(lán)染色).A和D的bars值為1 cm,B、C、E、F為100 μm

      在2,4-D誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,篩選出964和1086兩份海島棉材料能夠獲得較高質(zhì)量的愈傷組織和轉(zhuǎn)化效果。

      3 討 論

      3.1 海島棉愈傷組織細(xì)胞對2,4-D培養(yǎng)基的誘導(dǎo)響應(yīng)

      植物組織再生中愈傷組織的誘導(dǎo)增殖、體細(xì)胞胚的形成和植株再生3個階段尤為重要[1],而高質(zhì)量的愈傷細(xì)胞是獲得胚性愈傷及再生植株的前提。通過向培養(yǎng)基中添加適宜濃度的2,4-D,能夠使細(xì)胞快速分化,過高或過低則會使細(xì)胞無法增殖或者死亡。研究利用改良后的2,4-D培養(yǎng)基進(jìn)行海島棉愈傷組織誘導(dǎo)和紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)化。在相同培養(yǎng)時間,海島棉比陸地棉Jin668的愈傷組織增殖更快。但不同海島棉品種愈傷組織對2,4-D濃度的響應(yīng)程度差異很大,這可能由于品種基因型的不同對2,4-D要求有差異,也與新疆海島棉某些關(guān)鍵的特異基因在其特定組織中的表達(dá)量不同有關(guān)[17]。棉花作為一種較難獲得體細(xì)胞培養(yǎng)的作物,體胚發(fā)生能力受基因型影響較大[18-19]。

      3.2 影響棉花愈傷組織表型和增殖速度的因素

      研究中,不同海島棉材料愈傷組織表型各有差異,其中淡黃色疏松的愈傷組織明顯比棕色或者褐色的材料增殖快,這與前人的研究結(jié)論一致[18];并且增殖較快的品種,其熒光蛋白的轉(zhuǎn)化率相對較高。而部分品種出現(xiàn)了褐化的現(xiàn)象,可能與受外植體本身遺傳物質(zhì)、生理狀態(tài)及培養(yǎng)條件有關(guān)。因?yàn)椴牧现性|(zhì)體酶的活性和棉酚的含量都會影響愈傷組織的表型,褐化會導(dǎo)致SOD酶、 IAA氧化酶和CAT酶活性的降低,以及蛋白合成的減少[20],從而減緩或阻礙愈傷組織發(fā)育速度,最終導(dǎo)致無法形成體細(xì)胞胚。導(dǎo)致棉花愈傷組織生長緩慢、褐化的主要誘因與培養(yǎng)基氮源配比也有關(guān)[21]。品種的基因型、培養(yǎng)基配比、激素條件等,都會影響海島棉愈傷組織的增殖。

      3.3 海島棉愈傷組織增殖過程培養(yǎng)時間

      細(xì)胞培養(yǎng)時間過長會引起再生植株發(fā)生畸變[22]。在研究中,利用OD值為0.6的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅色熒光蛋白浸染海島棉下胚軸,浸染8~10 min,于2,4-D培養(yǎng)基上培養(yǎng)4~7個月后,發(fā)現(xiàn)愈傷組織的誘導(dǎo)增殖過程,與培養(yǎng)時間并不呈正相關(guān);超過4個月,部分材料的愈傷組織增殖緩慢,甚至停滯或者死亡,可能與選取的培養(yǎng)組織,菌液濃度及浸染時間有一定關(guān)系[23],同時還受到材料自身愈傷細(xì)胞的活性的影響。這些影響過程,還需要后期進(jìn)一步進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

      4 結(jié) 論

      海島棉下胚軸經(jīng)改進(jìn)后的組織轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)28 d后,下胚軸兩端呈現(xiàn)不同的質(zhì)地,顏色和狀態(tài);改良后的2,4-D誘導(dǎo)培養(yǎng)基可有效用于海島棉下胚軸愈傷組織再生。培養(yǎng)4個月是愈傷組織快速增殖的最佳時期,此時有60.86%的海島棉材料愈傷增重可達(dá)到0.201~0.5 g。當(dāng)培養(yǎng)時間延長,愈傷組織增殖緩慢;隨著培養(yǎng)時間增加,愈傷會呈現(xiàn)不同的顏色和質(zhì)地。愈傷增殖較快的材料其紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)化率也比較高。根據(jù)培養(yǎng)時間,增殖速率和轉(zhuǎn)化效率,篩選出9份愈傷增殖較快的海島棉材料。

      猜你喜歡
      海島棉菌苗胚軸
      不同鮮重秋茄胚軸形態(tài)及其對幼苗生長的影響
      控制水稻中胚軸伸長的QTL 定位
      中國稻米(2019年6期)2019-12-05 03:34:22
      布氏桿菌病的疫苗種類
      轉(zhuǎn)Bt基因海島棉分子檢測及抗蟲性鑒定
      利用重測序和集團(tuán)分離分析鑒定水稻中胚軸延長相關(guān)染色體區(qū)域
      水稻中胚軸伸長研究進(jìn)展
      仔豬白痢的臨床表現(xiàn)及免疫方法
      棉花陸海雜交親本及子代光合葉綠素?zé)晒鈪?shù)分析
      新疆海島棉生產(chǎn)現(xiàn)狀與發(fā)展建議
      海島棉染色體片段代換系BC4F4產(chǎn)量及纖維品質(zhì)主成分分析
      长丰县| 嘉鱼县| 屏南县| 绥江县| 稻城县| 乌鲁木齐市| 朝阳县| 柳州市| 鄂托克旗| 监利县| 深泽县| 广德县| 南漳县| 社旗县| 汤原县| 闽清县| 元氏县| 沾益县| 乌兰县| 皮山县| 永胜县| 泌阳县| 海南省| 尉氏县| 微博| 花垣县| 得荣县| 德州市| 华容县| 神农架林区| 濉溪县| 兴业县| 兴山县| 大理市| 怀宁县| 怀化市| 上犹县| 策勒县| 右玉县| 沁阳市| 桑植县|