水稻類病斑突變體lmm7的鑒定與基因定位

孫志廣 代慧敏 陳庭木 李景芳 遲銘 周振玲 劉艷 劉金波 徐波 邢運高 楊波 李健 盧百關(guān) 方兆偉 王寶祥, * 徐大勇, *

水稻類病斑突變體的鑒定與基因定位

孫志廣1代慧敏2陳庭木1李景芳1遲銘1周振玲1劉艷1劉金波1徐波1邢運高1楊波1李健1盧百關(guān)1方兆偉1王寶祥1, *徐大勇1, *

（1連云港市農(nóng)業(yè)科學院/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 連云港 222006;2連云港市生產(chǎn)力促進中心, 江蘇 連云港 222006,*通信聯(lián)系人, E-mail: wbxrice@163.com; xudayong3030@sina.com）

【目的】對水稻類病斑突變體的研究有助于解析其與植物生長和防御反應(yīng)的關(guān)系。【方法】本研究在粳稻品系FI135胚培養(yǎng)過程中獲得了1個類病斑突變體()。通過對其進行系統(tǒng)的表型鑒定、農(nóng)藝性狀考查、超微結(jié)構(gòu)觀察、生理學特性分析，闡明基因?qū)χ参锷L的調(diào)控。通過病原菌抗性鑒定，明確對植物防御反應(yīng)的影響。利用9311B與突變體雜交所得F2群體對該突變體進行了遺傳分析和基因精細定位?！窘Y(jié)果】該突變體苗期表型正常，分蘗初期，植株基部葉片從葉尖開始不斷出現(xiàn)褐色斑點，并向整株擴散，且斑點數(shù)目隨植株生長不斷增加。與野生型相比，突變體的株高、穗長、有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實率及劍葉長寬都顯著降低，但籽粒性狀和抽穗期沒有顯著性差異。遮光處理表明，突變體的表型受到光照誘導(dǎo)，抽穗期突變體葉肉細胞嚴重失綠，光合色素含量顯著降低。組織化學分析表明，突變體病斑處的H2O2含量顯著升高。透射電鏡觀察結(jié)果表明，突變體葉肉細胞的葉綠體數(shù)目減少，葉綠體類囊體片層結(jié)構(gòu)嚴重受損，細胞器腫脹解體，并出現(xiàn)大量嗜鋨小體，同時病斑內(nèi)部和周圍區(qū)域積累了大量的ROS。抗性鑒定結(jié)果顯示突變體稻瘟病抗性水平顯著高于野生型。遺傳分析表明的突變表型受單個隱性基因控制。利用圖位克隆的方法，目的基因被定位于水稻第7染色體短臂兩InDel標記7B35和7B43之間，區(qū)間范圍約260 kb。測序結(jié)果表明該區(qū)間內(nèi)候選基因第2891位堿基T發(fā)生了單堿基缺失，導(dǎo)致后續(xù)移碼突變及翻譯提前終止。【結(jié)論】與互為等位基因，其突變抑制了植株的生長，同時增強了對稻瘟病的抗性。

水稻；類病斑突變體；表型鑒定；基因定位

植物類病斑突變體是指在沒有病原菌侵染、環(huán)境脅迫或機械損傷時，植物組織上自發(fā)形成與病原菌侵染引起過敏性反應(yīng)(hypersensitive response, HR)介導(dǎo)的細胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)類似病斑的這一類突變體[1-3]。類病斑的產(chǎn)生是一種典型的植物自發(fā)防御反應(yīng)，該反應(yīng)涉及活性氧(reactive oxygen species, ROS)積累、病程相關(guān)基因的表達、細胞壁的增厚和細胞程序性死亡等多種生理生化過程[4-5]，而這些過程往往和植物免疫反應(yīng)以及細胞凋亡相關(guān)聯(lián)。大多數(shù)類病斑突變體在沒有病原侵染的情況下組成性激活植物免疫反應(yīng)，增強植物對一種或多種病原菌的抗性[6]。因此，加強對植物類病斑突變體的研究有助于對植物抗病分子機制的理解。

目前已在多種植物中發(fā)現(xiàn)了類病斑突變體，比如擬南芥[7]、玉米[8]、小麥[9]、番茄[10]、大麥[11]和水稻[12]等。近年來，水稻類病斑突變體被大量報道，這些類病斑基因編碼不同的功能蛋白，如膜相關(guān)蛋白[13-16]、離子通道家族成員[17-19]、鋅指蛋白[20]、熱激轉(zhuǎn)錄因子[21]、E3泛素連接酶[22]、格網(wǎng)蛋白相關(guān)接頭蛋白[23]、脂肪酸/脂類生物合成相關(guān)蛋白[24-25]、卟啉[26-27]和酚醛樹脂等[28]。這些蛋白涉及不同的防御信號途徑，比如ROS產(chǎn)生、病蟲害抗性、鈣調(diào)信號、蛋白質(zhì)泛素化或磷酸化以及脂肪酸代謝等，其中有些類病斑基因不僅影響過敏性反應(yīng)介導(dǎo)的植物對病原菌的抗性，還通過不同的生理途徑影響了植物對非生物脅迫的響應(yīng)[29-30]。因此，調(diào)控植物類病斑細胞死亡和抗性的分子機制十分復(fù)雜。挖掘更多的類病斑突變體，并克隆相關(guān)基因，可為水稻抗病防御體系和細胞程序性死亡機制的研究提供借鑒，同時可為抗性育種提供有用的種質(zhì)資源。

本研究在粳稻品系FI135胚培養(yǎng)過程中，鑒定到一個穩(wěn)定遺傳的類病斑突變體，該突變體苗期葉片表現(xiàn)正常，分蘗期初期基部葉片開始出現(xiàn)褐色圓形斑點，并不斷向整株擴散。本研究對該突變體進行表型鑒定、農(nóng)藝性狀考查、超微結(jié)構(gòu)觀察、生理學特性分析、病原菌抗性鑒定，并對該突變體進行了遺傳分析和精細定位，以期為該基因的克隆、功能分析及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與種植條件

突變體是連云港市農(nóng)業(yè)科學院選育的粳稻高世代品系FI135在胚培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的類病斑突變體，經(jīng)多代自交，突變體類病斑表型能穩(wěn)定遺傳。2019年將野生型FI135（WT）、突變體、秈稻9311B以及突變體和9311B衍生的F1、F2群體均種植于連云港市農(nóng)業(yè)科學院東辛農(nóng)場試驗基地（E 119°32′，N 34°56′），種子均來源于連云港市農(nóng)業(yè)科學院水稻種質(zhì)資源庫。

1.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查

將野生型和突變體種植于田間，每小區(qū)6行，每行10株，3次重復(fù)，隨機從野生型和突變體小區(qū)中央選擇10株進行農(nóng)藝性狀考查：在抽穗期調(diào)查的有株高、劍葉長、劍葉寬、有效穗數(shù)、抽穗期；籽粒成熟后調(diào)查的有穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、粒長、粒寬、粒厚和千粒重，并作檢驗統(tǒng)計分析。

1.3 光合色素含量測定

在抽穗期，選取野生型和突變體的劍葉、倒2葉和倒3葉的平展部分進行光合色素含量的測定：用剪刀去除葉脈，剪碎后稱取樣品25 mg，浸泡于5 mL 95%乙醇中，置于4℃下避光保存，期間多次震蕩，浸提48 h后，以95%乙醇為空白對照，利用UV759紫外可見分光光度計分別測定665 nm、649 nm和470 nm下的吸光值，每組樣品重復(fù)測量5次。參照Lichtenthaler等[31]計算光合色素含量。

1.4 透射電鏡觀察

分別選取成熟期突變體劍葉中部及野生型對應(yīng)位置葉片，置于2.5%的戊二醛溶液中固定，避開葉脈區(qū)域?qū)⑷~片切成3 mm×3 mm的方塊狀，抽真空使材料沉于管底，固定24 h后4℃下避光保存。參照Fang等[32]的方法進行樣品制備，隨后置于高反差型透射電子顯微鏡（日立H-7800）下對葉片細胞進行觀察并拍照記錄。

1.5 遮光處理

在田間自然條件下，于水稻抽穗期，用寬約2 cm的錫箔紙對突變體僅在葉尖出現(xiàn)少量病斑的葉片中間部位進行錫箔紙遮光處理，在野生型相同位置進行同樣處理，1周后除去遮光處理，觀察病斑變化，并拍照記錄。

1.6 組織化學分析

為檢測突變體在類病斑形成過程中是否存在細胞死亡和過氧化氫積累，在抽穗期取突變體出現(xiàn)病斑葉片以及野生型對應(yīng)部位葉片，利用南京森貝伽生物科技有限公司DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒進行染色，利用臺盼藍染色液（0.4%）染色，顯微鏡下觀察葉片染色情況并拍照記錄。

1.7 稻瘟病和水稻黑條矮縮病抗性鑒定

在連云港市農(nóng)業(yè)科學院東辛農(nóng)場試驗基地溫室內(nèi)對野生型和突變體分別進行稻瘟病和水稻黑條矮縮病抗性鑒定。稻瘟病鑒定參照劉永峰[33]的方法，在水稻孕穗初期，用注射器吸取1 mL菌液在幼穗中上部緩緩注入稻苞內(nèi)，每品種接種20株，每株接種1個穗子。稻瘟病菌菌液為ZB7、ZC11、ZD7、ZF1、ZG1共5種菌株的混合菌液(引自江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所)，鑒定流程和評價標準參照國際水稻研究所(IRRI)水稻稻瘟病評級系統(tǒng)標準執(zhí)行[34]。參照Zhou等[35]的方法對野生型和突變體進行水稻黑條矮縮病人工接種鑒定。所用毒源取自田間鑒定圃內(nèi)典型的水稻黑條矮縮病病株。選擇饑餓1 d的3齡灰飛虱若蟲，置于水稻黑條矮縮病病株上飼毒3 d，隨后將存活的灰飛虱移入預(yù)先育有蘇御糯幼苗的5 L燒杯中，度過10 d左右的循回期，隨后將野生型和突變體種子催芽播種于周轉(zhuǎn)箱中，每重復(fù)40粒種子，3個重復(fù)。在3葉1心時進行間苗，保留30株整齊一致的健康植株，按10頭/株的蟲口密度接入飼毒水稻黑條矮縮病后的灰飛虱，為保證接毒的均勻一致，用毛筆將灰飛虱驅(qū)散均勻，每天5次，3 d后將灰飛虱導(dǎo)出，接毒完成。接毒后的植株移栽到溫室中，用防蟲網(wǎng)與外界隔離，進行正常的田間肥水管理，在水稻分蘗期進行表型調(diào)查，以發(fā)病率作為表型值進行分析，并作檢驗統(tǒng)計分析。

1.8 遺傳分析與基因定位

2018年以突變體為母本、9311B為父本配制雜交組合，2019年在連云港對F1植株和F2群體進行表型觀察和統(tǒng)計分析，利用卡方測驗檢驗F2群體的分離比，以進行遺傳分析和后續(xù)基因定位。利用分布于水稻12條染色體上的674對SSR/InDel引物，篩選9311B和之間多態(tài)性良好的標記。利用57個類病斑極端個體和11個正常個體完成基因初定位；然后在初定位區(qū)間內(nèi)設(shè)計InDel標記，利用包含1363個單株的/9311B F2群體進行基因的精細定位。

利用MapMaker 3.0分析軟件對所得基因型數(shù)據(jù)進行分析，并將Kosambi函數(shù)轉(zhuǎn)化為遺傳距離（cM），繪制遺傳圖譜，并對交換單株進行后代表型驗證，以確保結(jié)果的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體表型觀察

與野生型相比，突變體苗期葉片表型正常，未出現(xiàn)類病斑。從分蘗初期開始，突變體基部葉片在葉尖處出現(xiàn)褐色小斑點，隨著時間推移，病斑數(shù)量逐漸增多，病斑顏色逐漸加深，并向整株擴散，至成熟期時，整個植株似火燒狀，穎殼、葉鞘等部位也出現(xiàn)病斑（圖1-A～D）。此外，伴隨病斑的出現(xiàn)，突變體的株高受到顯著影響，通過比較成熟期野生型和突變體主莖不同節(jié)間長度，發(fā)現(xiàn)兩者之間越靠近穗部的節(jié)間長度差距越大（圖1-E、F）。

2.2 農(nóng)藝性狀考查

為了分析類病斑表型對植株生長發(fā)育的影響，分別調(diào)查并比較了野生型和突變體的農(nóng)藝性狀（表1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和野生型相比，突變體的株高、穗長、每穗粒數(shù)及葉片長寬都極顯著降低，有效穗數(shù)和結(jié)實率也受到嚴重影響。值得注意的是，突變體的抽穗期和籽粒性狀與野生型沒有顯著性差異。

圖1 野生型（WT）和突變體的表型鑒定

Fig. 1. Phenotypic identification of WT plants and.

A―分蘗期野生型（WT）和突變體（）植株表型，紅色箭頭指示出現(xiàn)類病斑葉片；B―分蘗期野生型（WT）和突變體（）基部葉片；C―大田條件下，野生型（WT）和突變體（）成熟期植株；D―野生型（WT）和突變體（）成熟種子大小的比較；E～F―植株主莖穗和節(jié)間長度的比較。在A中，比例尺為5 cm；在B中比例尺為2 cm；在C和E中，比例尺為10 cm；在D中，比例尺為10 mm。

A, Plants of wild type (WT) andmutant at the tillering stage, red arrows indicate lesion mimic leaves; B, Basal leaves of wild type (WT) andat the tillering stage; C, Plants of wild type (WT) andat the mature period in field conditions; D, Comparisons of the size of mature seeds from WT andplants; E-F: Panicles and internodes of main culms. P, Panicle; I to VI indicate corresponding internodes from top to bottom. Bars =5 cm in A; 2 cm in B; 10 cm in C, E; 10 mm in D.

2.3 光合色素含量分析

在大田環(huán)境下，取突變體及野生型抽穗期葉片進行光合色素含量測定，發(fā)現(xiàn)突變體倒3葉、倒2葉的葉綠素a/b的比值沒有顯著性變化，但葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量及胡蘿卜素含量均顯著下降，而且葉片越靠近基部光合色素含量越低（圖2-B～C），表明在抽穗期突變體的葉片光合色素開始逐漸降解，進入衰老階段，而突變體和野生型劍葉的光合色素含量沒有顯著差異（圖2-A），因為此時突變體的劍葉平展部位尚未出現(xiàn)病斑，說明突變體葉片的光合色素降解是伴隨著類病斑的出現(xiàn)而發(fā)生的。

A―抽穗期野生型(WT)和突變體lmm7的劍葉光合色素含量；B―倒2葉光合色素含量；C―倒3葉光合色素含量。*在0.05水平上差異顯著；**在0.01水平上差異顯著。

Fig. 2. Photosynthetic pigments contents of the wild type and themutant at heading stage.

2.4 細胞超微結(jié)構(gòu)觀察

為了觀察突變體細胞的生理變化，對突變體和野生型成熟期劍葉進行透射電鏡觀察。結(jié)果顯示，野生型的葉肉細胞葉綠體呈橢圓形、數(shù)量較多，具有較多的淀粉粒，輪廓清晰、結(jié)構(gòu)完整（圖 3-B～D）；突變體類病斑部位的葉肉細胞內(nèi)葉綠體數(shù)量較少，細胞松弛，細胞間的空隙增大，細胞膜不同程度受損，細胞質(zhì)空泡化，葉綠體的大小和形態(tài)異常，葉綠體類囊體片層結(jié)構(gòu)模糊、排列疏松。此外，細胞內(nèi)嗜鋨小體的數(shù)量和體積顯著增加（圖 3-F～H）。表明隨著類病斑的產(chǎn)生，突變體的葉肉細胞中的葉綠體結(jié)構(gòu)損傷，葉綠體開始降解，致使其光合色素含量下降，進而導(dǎo)致植株變矮，有效穗數(shù)、穗長等農(nóng)藝性狀顯著降低。

Fig. 3. Ultrastructure of mesophyll cells in the wild type (WT) and themutant at mature period.

表1 野生型（WT）和lmm7突變體的農(nóng)藝性狀比較

表中各性狀的表現(xiàn)以“平均值±標準差”形式呈現(xiàn)。星號代表檢驗的顯著性差異（*< 0.05；**< 0.01）。

Phenotypic performance are listed as means ± standard deviation.**means significant difference at< 0.01 by-test;*means significant difference at< 0.05 by-test.

2.5 lmm7突變體表型受光照誘導(dǎo)

對野生型和突變體抽穗期葉片進行遮光處理后發(fā)現(xiàn)，突變體遮光部位未出現(xiàn)類病斑，鄰近的未遮光部位則出現(xiàn)大量病斑，而野生型無論遮光與否均未出現(xiàn)類病斑（圖4-A），說明突變體類病斑表型受光誘導(dǎo)或暗抑制，顯示該基因可能參與了光呼吸途徑，為光依賴型類病斑突變體。

2.6 活性氧水平檢測

為了明確類病斑突變體中可能發(fā)生的生理生化反應(yīng)，我們利用臺盼藍對突變體和野生型葉片進行染色。結(jié)果顯示，突變體葉片有類病斑的部位及其周圍被染成深藍色，而野生型的葉片較少部位被染成淺藍色，這可能是由于產(chǎn)生類病斑的部位發(fā)生了過敏性反應(yīng)而導(dǎo)致細胞程序性死亡造成的（圖4-B）。DAB染色結(jié)果顯示，突變體的葉片上有大量褐色斑點，而野生型葉片上并未出現(xiàn)類似的斑點（圖4-C），表明突變體在類病斑產(chǎn)生的過程中伴隨著大量H2O2的積累，而H2O2是植物細胞程序性死亡過程中的一種重要信號分子，因此突變體類病斑的形成可能是細胞程序性死亡造成的。

2.7 抗性檢測

類病斑的產(chǎn)生往往伴隨著植株抗性的提高。為了探明突變體是否增強了植物對病原菌的抗性，分別對野生型和突變體進行水稻黑條矮縮病和稻瘟病室內(nèi)人工接種鑒定。結(jié)果表明，突變體和野生型的水稻黑條矮縮病發(fā)病率沒有顯著差異，但相比于野生型，突變體稻瘟病的抗性水平顯著提高（圖5），說明基因的突變提高了植物對稻瘟病病原菌的抗性。

A―遮光處理7 d后野生型(WT)和突變體lmm7的葉片；B―野生型(WT)和突變體lmm7葉片的臺盼藍染色觀察；C―野生型(WT)和突變體lmm7葉片的DAB染色觀察。在A、B、C中，比例尺均為1 cm。

Fig. 4. Shading treatment and histochemical analysis of the wild type andmutant.

A―人工接種鑒定條件下，野生型（WT）和突變體lmm7的水稻黑條矮縮病平均發(fā)病率；B―人工接種鑒定條件下，野生型（WT）和突變體lmm7的稻瘟病病情指數(shù)。*P < 0.05(t檢驗)。

Fig. 5. Resistance evaluation of wild type (WT) andmutant to rice black-streaked dwarf virus disease (RBSDVD) and rice blast under artificial inoculation condition.

圖6 lmm7基因在水稻第7染色體上的分子定位

Fig. 6. Molecular mapping ofon chromosome 7.

2.8 遺傳分析及基因定位

利用突變體和9311B配制雜交組合，表型觀察表明，F(xiàn)1植株葉片未發(fā)生類病斑，F(xiàn)2群體后代出現(xiàn)了明顯的表型分離，正常株數(shù)為1000株，突變株為363株，其比值為2.76∶1，經(jīng)卡方檢驗χ2= 0.63 ＜χ20.05= 3.84，符合理論上的3∶1分離比，這說明突變體的類病斑表型由單個隱性核基因控制。

利用/9311B的F2分離群體進行突變位點的定位。采用極端個體分組法，選取F2群體中的11個病斑型極端個體和11個正常個體進行連鎖分析，在水稻第7染色體短臂上檢測到1個顯著關(guān)聯(lián)位點。進一步利用46個類病斑表型單株，將目的基因初定位于水稻第7染色體的兩個SSR標記RM11307和RM7341之間約3.8 cM的區(qū)間內(nèi)（圖6）。為了進一步縮小區(qū)間范圍，利用F2群體的1363個單株，最終將基因鎖定在InDel標記7B35和7B43之間，物理距離約260 kb。隨后利用Gramene數(shù)據(jù)庫（http://www.gramene.org）、NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）和RiceGAAS (http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)對候選基因進行預(yù)測，在定位區(qū)間內(nèi)共發(fā)現(xiàn)44個注釋基因，其中包含已克隆類病斑基因，因此對該基因進行測序分析。結(jié)果顯示，突變體中基因的第2891位堿基T缺失，導(dǎo)致后續(xù)移碼突變，并在2956堿基位置翻譯提前終止。初步推測該基因可能為控制類病斑產(chǎn)生的目的基因。

3 討論

過敏性反應(yīng)介導(dǎo)的細胞程序性死亡是植物限制病原菌侵染的一種重要防御反應(yīng)，因此，在沒有病原菌侵染條件下自發(fā)產(chǎn)生細胞凋亡的類病斑突變體是研究植物生長和免疫反應(yīng)的理想材料[36]。突變體是由粳稻品系FI135胚培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)的，該突變體在水稻分蘗期時基部葉片開始產(chǎn)生褐色斑點，隨著水稻的生長，突變體病斑的數(shù)量不斷增多，顏色逐漸加深，在穎殼和葉鞘部位也出現(xiàn)病斑，最后整個植株呈現(xiàn)火燒狀。盡管所有類病斑突變體都表現(xiàn)出自發(fā)的細胞凋亡現(xiàn)象，但是類病斑出現(xiàn)的時間卻不盡相同，比如在播種10 d以后就出現(xiàn)淡褐色病斑[37]，[38]、[39]分別在苗期和花期后葉片開始出現(xiàn)圓形病斑，而本研究中突變體在分蘗期基部葉片開始出現(xiàn)類病斑，而且不會導(dǎo)致植株更早產(chǎn)生類似病斑。因此，過敏性反應(yīng)介導(dǎo)的細胞程序性死亡引起的類病斑依賴于一定的生長發(fā)育過程，這在擬南芥、玉米等植物的類病斑突變體中也得到印證。

是一個典型的水稻類病斑突變體，表現(xiàn)為光合色素含量顯著下降，株高等農(nóng)藝性狀顯著降低。電鏡結(jié)果顯示，葉片中的葉綠體數(shù)量較少、細胞質(zhì)空泡化，葉綠體的大小和形態(tài)異常，表明該突變體葉綠體結(jié)構(gòu)損傷，葉綠體開始降解，并伴隨有大量的活性氧積累和細胞程序性死亡。前人研究表明隨著類病斑突變體病斑的產(chǎn)生可能會激活植物的防御反應(yīng)基因，有助于提高植物對生物或非生物的抗性，比如，（）是一個轉(zhuǎn)錄激活因子，編碼植物系統(tǒng)獲得抗性（systemic acquired resistance, SAR）中的一個關(guān)鍵蛋白，的過表達能夠組成性激活水稻的免疫反應(yīng)，增強水稻植株對稻瘟病和白葉枯病的抗性水平，并在葉片上產(chǎn)生HR介導(dǎo)的病斑[40]。（）編碼一個典型的CC-NB-LRR蛋白，缺失能夠組成性地自激活的R蛋白，激活SA和NPR1依賴的防御反應(yīng)[41]；此外，在類病斑突變體中，線粒體GTP酶相關(guān)蛋白1E (OsDRP1E) 通過控制線粒體結(jié)構(gòu)和細胞色素的釋放負調(diào)控細胞死亡和免疫反應(yīng)，在突變體中，植株對真菌和細菌的抗性均有所增強[42]。因此，我們對突變體進行了抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)基因的突變提高了水稻對稻瘟病的抗性水平，這可能是由于突變體病斑產(chǎn)生過程中激活了植物病程相關(guān)基因，進而引起了植物防御反應(yīng)。

本研究利用/9311B F2群體進行遺傳分析和基因定位，發(fā)現(xiàn)突變體的類病斑表型受到一個單隱性基因控制，并將基因定位于水稻第7染色體短臂兩InDel標記7B35和7B43之間約260 kb范圍內(nèi)。目前已報道的定位于水稻第7染色體上的類病斑基因有6個，分別為[43-44]、spl[45]、[46]、[47]、[48]和[49]，其中、和均位于水稻第7染色體長臂上，而位于水稻第7染色體短臂上，因此，與、和不是相同基因。spl和被定位于第7染色體短臂上，突變體spl表現(xiàn)出與相似的病斑癥狀和稻瘟病抗性水平，基因芯片顯示突變體spl植株內(nèi)許多病程相關(guān)基因上調(diào)表達，此外該突變體還組成性自激活SA下游信號途徑，這可能是突變體spl增強稻瘟病抗性的原因，經(jīng)過位置比對發(fā)現(xiàn)，spl與有較遠的物理距離，表明兩者不是同一個基因。突變體是由粳稻品種農(nóng)林8號經(jīng)γ射線輻射誘變而來，在播種15～20 d后，葉片出現(xiàn)較小的紅色類病斑，區(qū)別于其他類病斑突變體，編碼一個特定的剪切因子3b亞基3（SF3b3），通過調(diào)節(jié)突變體中的RNA剪切來負調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子、鄰氨基苯甲酸合成酶、色氨酸合酶和色氨酸脫羧酶的表達，促進5-羥色胺的積累，進而來調(diào)節(jié)細胞程序性死亡和抗性反應(yīng)。經(jīng)過比對，發(fā)現(xiàn)的定位區(qū)間內(nèi)包含（）。為了驗證兩者是否為等位基因不同位點突變導(dǎo)致，進行測序分析，發(fā)現(xiàn)突變體在基因第2891位堿基T缺失，導(dǎo)致后續(xù)移碼突變，并在2956堿基位置翻譯提前終止，導(dǎo)致翻譯后的蛋白質(zhì)失去其原有的生物學功能，引起類病斑表型出現(xiàn)，而的類病斑表型則是由該基因第2386位堿基G缺失引起的，因此，和互為等位基因但兩者表型出現(xiàn)時間、病斑顏色、大小以及對農(nóng)藝性狀的影響都有明顯區(qū)別，這可能是由于遺傳背景及突變位點不同造成的。

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Phenotypic Identification and Gene Mapping of a Lesion Mimic Mutantin Rice

SUN Zhiguang1, DAI Huimin2, CHEN Tingmu1, LI Jingfang1, CHI Ming1, ZHOU Zhenling1, LIU Yan1, LIU Jinbo1, XU Bo1, XING Yungao1, YANG Bo1, LI Jian1, LU Baiguan1, FANG Zhaowei1, WANG Baoxiang1, *, XU Dayong1, *

(1Lianyungang Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Corp Production, Lianyungang 222006, China;2Lianyungang Productivity Promotion Center, Lianyungang 222006, China;*Corresponding author, E-mail: wbxrice@163.com; xudayong3030@sina.com)

【Objective】The study of lesion mimic mutants (LMMs) is helpful to understand the interaction between growth and defense response in plants.【Method】We herein reported a novel() derived from arice variety FI135 by embryo culture. For deciphering the effect ofon plant growth, phenotype and agronomic traits were compared between the wild type (WT) andplants. The ultrastructure of mesophyll cells and histochemical characterization was done in WT andplants. Evaluation of WT andwas observed for resistance to pathogens was employed to explore the underlying effect ofon plant defense response. An F2population derived from the cross betweenmutant and 9311B was used for genetic analysis and gene mapping.【Result】The seedlings ofwere normal at the seedling stage, but the basal leaves began to exhibit brown spots at the initial tillering stage, which then spread to the whole plant, and the number of mosaic spots increased along with the development ofplants. Compared with the wild type, agronomic traits including plant height, panicle length, effective panicle number, grain number per panicle, and seed setting rate were significantly decreased in themutant. However, no significant difference in seed traits and heading date was observed between WT andplants. The shading assay indicated that lesion formation inwas induced by light. The mesophyll cells ofmutant were seriously chlorotic, and the photosynthetic pigment contents of the mutant were significantly decreased at the heading stage. Histochemical analysis showed that a large amount of hydrogen peroxide (H2O2) accumulated at the lesion sites. The observation with a transmission electronic microscope (TEM) demonstrated that the number of chloroplasts in mesophyll cells ofplants was decreased, the lamellar structure of chloroplasts was seriously damaged, and osmiophilic granules were obviously increased in the mutant. Moreover, the levels of reactive oxygen species (ROS) were increased in the internal and surrounding regions of the lesions. Theplants displayed higher resistance to rice blast compared to the wild type. Genetic analysis revealed that inthe mutation was controlled by a single recessive gene. Using a map-based cloning strategy,was narrowed down to a 260 kb region between InDel markers 7B35 and 7B43 on the short arm of chromosome 7 in rice. Sequencing analysis revealed that a deletion of T base at 2891 nucleotide position occurred in the DNA sequence of, resulting in a frame-shift mutation and a premature stop codon.【Conclusion】The results reveal the target gene is allelic to, and the mutation ofenhances resistance to rice blast, while it curbs the growth and development ofplants.

L.; lesion mimic mutants; phenotypic identification; gene mapping

10.16819/j.1001-7216.2022.210711

2021-07-30；

2021-08-30。

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助項目(CARS-01-61); 江蘇省農(nóng)業(yè)重大品種創(chuàng)制計劃資助項目(PZCZ201704); 江蘇省自然科學基金面上項目(BK20201214); 蘇北科技專項(LYG-SZ201930, LYG-SZ202040); 連云港市財政專項資金資助項目(QNJJ1902, QNJJ2001)。