OsLOX10正調(diào)控水稻對稻瘟病和白葉枯病的抗性

周永林 申小磊 周立帥 林巧霞 王朝露 陳靜 馮慧捷 張振文 陳曉婷, 3, * 魯國東

正調(diào)控水稻對稻瘟病和白葉枯病的抗性

周永林1, 2申小磊1, 2周立帥1, 2林巧霞1, 2王朝露1, 2陳靜1, 2馮慧捷1張振文1陳曉婷1, 2, 3, *魯國東2

（1福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2福建農(nóng)林大學(xué) 生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室，福州 350002；3福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室，福州 350013；*通信聯(lián)系人，E-mail：xiaotingchen@fafu.edu.cn）

【目的】由稻瘟病菌（）引起的稻瘟病和由水稻黃單胞菌（pv，）引起的白葉枯病嚴重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因水稻材料，進行稻瘟菌和白葉枯菌的抗病性分析，有助于揭示其調(diào)控水稻對稻瘟病和白葉枯病的抗性機制。【方法】采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的敲除載體，利用限制性內(nèi)切酶Ⅰ線性化pCXUN-HA，TA連接構(gòu)建的過表達載體，遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因水稻，篩選過表達株系和純合敲除株系進行真菌和細菌的抗病性分析。在稻瘟菌（Guy11）侵染水稻后，對水楊酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）途徑的標志基因進行qRT-PCR分析；在幾丁質(zhì)（chitin）和flg22誘導(dǎo)下，觀測水稻活性氧（reactive oxygen species，ROS）的暴發(fā)情況。【結(jié)果】 qRT-PCR分析表明，接種稻瘟菌和白葉枯菌24 h后，表達量上調(diào)；的純合敲除和過表達水稻轉(zhuǎn)基因株系接種稻瘟病菌Guy11孢子懸浮液，與野生型（日本晴）相比，敲除株系更易感病，過表達株系則無典型的病斑癥狀；接種 6、12、24和36 h時，3個病程相關(guān)蛋白基因、、和SA通路基因，以及JA合成通路上的2個基因、的轉(zhuǎn)錄水平在敲除轉(zhuǎn)基因株系中顯著下調(diào)，而在過表達轉(zhuǎn)基因株系中顯著上調(diào)。對轉(zhuǎn)基因水稻接種白葉枯菌（），發(fā)現(xiàn)敲除的轉(zhuǎn)基因水稻對白葉枯菌更易感病。qRT-PCR分析和以及JA合成通路上的3個基因、和在過表達基因水稻中表達量明顯上調(diào)，而在敲除的轉(zhuǎn)基因水稻中卻保持在較低水平，在接種7 d后表現(xiàn)出顯著性差異。在幾丁質(zhì)和flg22誘導(dǎo)下，敲除株系的ROS水平顯著性降低，而且在幾丁質(zhì)誘導(dǎo)下，ROS的起峰時間推遲?！窘Y(jié)論】稻瘟病菌和白葉枯病菌能夠誘導(dǎo)的表達，通過病原菌分子模式觸發(fā)的免疫途徑（PTI）參與抗病反應(yīng)，其在水稻抵御稻瘟病和白葉枯病中起著正調(diào)控作用。同時，可能通過調(diào)節(jié)SA和JA介導(dǎo)的信號通路來正調(diào)控水稻對稻瘟病和白葉枯病的抗性。

；CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)；抗病性；稻瘟??；白葉枯??；信號途徑

由稻瘟病菌（）引起的稻瘟病和由白葉枯菌（pv，）引起的白葉枯病，是水稻生產(chǎn)上遭遇的兩種嚴重而普遍的病害，影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。當前，化學(xué)防治仍是稻瘟病防治的主要手段，但防治效果依賴于對田間稻瘟病的準確預(yù)報和及時發(fā)現(xiàn)，而且長期大量的施用農(nóng)藥會使病原菌產(chǎn)生耐藥性，降低防治效果，還會對水源、土壤、空氣造成污染。白葉枯病是水稻生產(chǎn)中最嚴重的細菌性病害，水稻整個生育期都會感病，孕穗期最為嚴重。該病是一種維管束病害，化學(xué)防治效果差，導(dǎo)致水稻葉片干枯，從而使籽粒灌漿不飽滿、秕谷率增加[2]。植物在與病原菌的長期互作過程中，形成兩個層次的防衛(wèi)機制，第一層次的基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)是基于病原關(guān)聯(lián)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式，（damage-associated molecular patterns，DAMPs）被植物模式受體蛋白（pattern recognition receptors，PRRs）所識別產(chǎn)生的，稱為PAMP觸發(fā)性免疫（Pattern-triggered immunity，PTI）；面對病原菌的入侵，植物進化出細胞內(nèi)受體蛋白（nucleotide-bind site and leucine-rich repeat domain receptors，NLRs），通過識別效應(yīng)子激活更強烈的效應(yīng)蛋白觸發(fā)性免疫（effector-triggered immunity，ETI）。近期研究表明，PTI和ETI并不是兩條平行的免疫通路。PRRs和NLRs會協(xié)同激活植物免疫；ETI會通過誘導(dǎo)PTI信號成分的轉(zhuǎn)錄來促進PTI，而PTI會通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶信號來保證ETI的完整抗性功能的正常發(fā)揮[3-5]。植物免疫系統(tǒng)的激活不僅包括病原體識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、下游防御相關(guān)基因激活以及不同信號通路之間的聯(lián)絡(luò)，還涉及一些激素信號傳導(dǎo)途徑，例如水楊酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)和乙烯(ethylene, ET)等信號通路。脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)是植物十八碳酸代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶，其功能是催化多不飽和脂肪酸（酯）的加氧反應(yīng)，產(chǎn)生的氫過氧化物和自由基等物質(zhì)，能參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在植物生長發(fā)育和抵抗逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。

水稻基因組中鑒定出14個LOX家族成員。每個LOX在水稻生長發(fā)育的不同階段及應(yīng)對外界的各種逆境脅迫中發(fā)揮各自不同的功能[6-7]，Mizuno等[8]從成熟的水稻種子中克隆了，發(fā)現(xiàn)其與同源性高；Shirasawa等[9]克隆了水稻（），并發(fā)現(xiàn)其與水稻種子貯存過程中質(zhì)量的下降有關(guān)。隨后，陸續(xù)有科學(xué)家利用RNA干擾或TALEN技術(shù)抑制水稻種子LOX1和LOX3的活性，延長貯藏期[10-13]。而LOX2在種子萌發(fā)和貯藏過程中起相反的作用，適當降低的表達量，既可以使種子的萌發(fā)不受影響又能使種子儲藏的時間得到延長，為培育種子耐儲藏的新品種提供了參考[14]；Ohta等[15]發(fā)現(xiàn)水稻受稻瘟菌侵染后，第5葉的LOX和脂質(zhì)過氧化分解酶活性（LHDA）顯著升高，這種誘導(dǎo)效應(yīng)在非親和菌株中表現(xiàn)更為明顯，LOX3受非親和菌株誘導(dǎo)最為顯著。但（LOC_Os11g36719）在水稻抗病中的作用及機制尚未報道。本研究通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻，研究在水稻-稻瘟病菌和水稻-白葉枯病菌互作過程中的功能，為水稻抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用植物材料為日本晴及相應(yīng)的（LOC_Os11g36719）轉(zhuǎn)基因材料。

供試菌株為稻瘟菌菌株Guy11、白葉枯菌株大腸桿菌DH5α為福建農(nóng)林大學(xué)功能基因組研究中心保存，根瘤農(nóng)桿菌購自天根生化科技(北京)有限公司，過表達載體pCXUN-HA由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈，敲除載體pYLCRISPR/ Cas9-MTmono和pYL-U3/U6a-gRNA由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈。研究所用引物見表1。

1.2 敲除載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株靶點測序分析

參照文獻[16]構(gòu)建的CRISPR/Cas9載體，送武漢伯遠生物科技有限公司進行遺傳轉(zhuǎn)化，標記轉(zhuǎn)基因苗，用DNA提取試劑盒提取各株轉(zhuǎn)基因苗DNA。以靶點切點為中心，在兩側(cè)100～150 bp處合成引物（PCR產(chǎn)物200～300 bp）。以各轉(zhuǎn)基因株系DNA為模板進行擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取條帶大小符合的產(chǎn)物進行測序。然后在DSDecodeM網(wǎng)站（http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/）進行比對，獲得基因編輯結(jié)果，選取編輯類型不同的純合突變株系進行繁種，驗證表型。

1.3 過表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株表達量分析

利用限制性內(nèi)切酶Ⅰ對pCXUN-HA載體進行酶切，TA連接構(gòu)建載體[17]。利用菌液PCR進行擴增檢測（上游引物UbiP-seq和下游引物-R），擴增片段大小2 716 bp。利用測序引物UbiP和NosR進行測序確認，送武漢伯遠生物科技有限公司遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因苗，用qRT-PCR方法分析各轉(zhuǎn)基因株系的表達量，選用表達量適宜的株系進行后續(xù)試驗。

表1 本研究所使用引物

1.4 水稻噴霧接種稻瘟菌

以日本晴為對照，對的敲除和過表達轉(zhuǎn)基因植株進行接菌試驗。將稻瘟菌Guy11轉(zhuǎn)接至完全培養(yǎng)基（酵母提取物6 g/L，酸水解酪蛋白6 g/L，蔗糖10 g/L，瓊脂20 g/L）上進行活化，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。然后轉(zhuǎn)至米糠培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，刮掉菌絲，在光照下進行產(chǎn)孢培養(yǎng)，至孢子鋪滿培養(yǎng)皿后，用適量無菌水（含0.02%吐溫）懸浮孢子，顯微鏡下觀察，并統(tǒng)計孢子數(shù)。調(diào)至孢子濃度為1×105cfu/mL，用小噴壺對生長至3葉1心的水稻進行噴霧接種，然后移至暗箱中保濕培養(yǎng)24 h，次日轉(zhuǎn)至接種室（25℃±1℃，相對濕度90%），1周后調(diào)查發(fā)病情況[18]。

1.5 水稻創(chuàng)傷接種稻瘟病菌

用鼠耳打孔器將6周齡稻葉輕微創(chuàng)傷，然后在創(chuàng)傷處接種7 μL孢子懸浮液（5×105cfu/mL）。用透明膠帶密封接種區(qū)域，并將接種的植物放回人工智能培養(yǎng)室培養(yǎng)7 d，然后調(diào)查發(fā)病情況，使用ImageJ軟件測量病斑面積。同時，對侵染稻葉組織中的真菌生物量進行定量分析：從葉子上切下一部分（3.0 cm×1.0 cm）含病斑的葉片，提取DNA，進行定量PCR分析，用e(Ct－Ct)計算相對真菌生長量（：循環(huán)數(shù)，和代表水稻泛素融合蛋白基因和稻瘟菌轉(zhuǎn)座子基因），結(jié)合病斑面積分析突變體的發(fā)病情況[18]。

1.6 水稻接種白葉枯菌

將?80℃保存的白葉枯菌在培養(yǎng)基（酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，蔗糖10 g/L，瓊脂15 g/L，調(diào)pH至6.8）上劃線，置于28℃培養(yǎng)箱中活化。培養(yǎng)3 d，待細菌長成亮黃色，進行轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接2次，用10 mmol/L無菌MgCl2溶液懸浮白葉枯菌，稀釋至600值為0.6。

對5周齡的水稻苗接種，接種時用剪刀蘸取菌液，剪掉距離葉尖2 cm左右的葉片。每個單株至少接種5片葉子，剪刀每次蘸入菌液時需短暫停留片刻，每剪2片葉片需重新蘸取菌液。14 d后調(diào)查病斑長度（從接種部位到枯萎葉中間靜脈邊緣的長度），每個單株至少調(diào)查5片水稻葉片[18]。

1.7 水稻抗病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄豐度分析

利用稻瘟菌孢子懸浮液（濃度為1×105cfu/mL）對轉(zhuǎn)基因水稻及其野生型進行噴霧接種，并在不同時間點（0、6、12、24和36 h）取樣，提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用qRT-PCR分析相關(guān)基因（如、、和等）在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達情況；白葉枯菌接種后于0、1、3、5、7和9 d 取樣分析。均以為內(nèi)參。

1.8 水稻葉片中活性氧的測定

用打孔器將6周齡水稻葉片打下若干小圓片，在無菌水中浸泡過夜。配制10 mLLuminol混合液（10 μL 20 mmol/L L-012、1 μL 10 mg/mL辣根過氧化酶和9989 μL ddH2O），于96孔板中每孔加入反應(yīng)液100 μL，將浸泡過夜的葉片放于其中，浸泡30 min?？焖偌尤霂锥≠|(zhì)（或flg22）至反應(yīng)液中，使其終濃度為400 nmol/L（或500 nmol/L），立即放入酶標儀中測定激發(fā)光。每分鐘測量一次數(shù)據(jù)，持續(xù)檢測50 min，每個樣品至少重復(fù)測定9次。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsLOX10響應(yīng)稻瘟菌和白葉枯菌的侵染

用濃度為1×105cfu/mL的稻瘟菌孢子懸浮液對3周齡的水稻幼苗（野生型日本晴）進行噴霧接菌，以0.02%的吐溫水作對照。在噴霧接種后的不同時間點（0、12、24、48和72 h）取水稻葉片，qRT-PCR分析在稻瘟病菌侵染下表達量的動態(tài)變化（圖1-A），與對照組相比，在接種稻瘟病菌的24 h后，開始上調(diào)表達，48 h發(fā)生回落，而在72 h又上調(diào)，最高上調(diào)了4.5倍。表明它可能在水稻與稻瘟菌的互作中發(fā)揮一定的作用。

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，*、**分別代表處理間在P<0.05和P<0.01水平差異達顯著水平(t-檢驗）。

Fig. 1. Expression profiles ofafter inoculation with(A) and(B) in rice.

對5周齡野生型水稻接種白葉枯菌，接種后0、1、2、4和8 d取病灶處葉片，qRT-PCR分析表達量的動態(tài)變化（圖1-B）。與對照組相比，接種1 d后，表達量顯著上調(diào)，接種2 d后，表達量達到最高（18.3倍），但在接種4和8 d，其表達量均維持在較低水平，說明可能在白葉枯菌浸染的早期發(fā)揮作用。

2.2 OsLOX10敲除載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻的篩選驗證

在的編碼序列中選擇2個靶點，在targetDesign（http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/）中設(shè)計靶點接頭引物，將靶點接頭分別與酶切過的U3-gRNA和U6a-gRNA表達盒連接，在表達盒中進行第1輪和第2輪PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳驗證正確后，將純化回收的第2輪產(chǎn)物與CRISPR/Cas9載體連接，將構(gòu)建好的載體進行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，菌液PCR驗證正確后，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，進行水稻遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因水稻。

在靶點附近設(shè)計引物，以轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板，擴增目的片段，測序結(jié)果采用在線分析工具DSDecode進行比對。U3靶點純合突變體中4個為缺失突變，3個為插入突變，U6a靶點純合突變體中2個為插入，1個為缺失突變。因為基因編輯的不確定性，使得U3與U6a兩個靶點并不一定能同時表現(xiàn)出純合突變，試驗中僅選擇CDS序列中較前的U3靶點，考慮到堿基的替換只是個別氨基酸的改變，并不一定會影響基因功能，僅選擇插入和缺失突變體進行后續(xù)的表型驗證。最終選擇了18#與24#的純合突變體進行后續(xù)的表型分析，其中18#插入1個T堿基，而24#缺失C和T堿基，都使編碼的蛋白提前終止（圖2）。

A－OsLOX10結(jié)構(gòu)和編輯位點；B－OsLOX10 T0代18號植株的突變位點檢測；C－OsLOX10 T0代24號植株的突變位點檢測。

Fig. 2. Identification of homozygous mutant ofby gene editing.

圖3 qRT-PCR分析OsLOX10在其過表達植株中的表達量

Fig. 3. Expression analysis ofby qRT-PCR in overexpressed lines.

圖4 OsLOX10轉(zhuǎn)基因水稻對稻瘟病的抗性分析

Fig. 4. Response oftransgenic rice to

2.3 OsLOX10過表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻的篩選驗證

從日本晴的cDNA中擴增出，長度為2 607 bp，將目的基因與pCXUN-HA載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，菌液PCR驗證正確后，提取質(zhì)粒，測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，送到武漢伯遠公司進行遺傳轉(zhuǎn)化。提取每株轉(zhuǎn)基因水稻的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR分析的表達量（圖3）。得到15個表達量上調(diào)的株系，表達量上調(diào)800～3000倍。基因表達量上調(diào)幅度很大，這與水稻生長過程中該基因的正常表達量很低有關(guān)。有研究表明，主要在水稻乳熟期表達[8]。同時由于表達量高的株系可能會存在不孕的情況，后續(xù)試驗中僅選用種子多且表達量較高的水稻株系（-17# 和LOX10-18#）進行功能分析。

2.4 OsLOX10轉(zhuǎn)基因株系對于稻瘟病菌和白葉枯菌的抗性分析

對敲除（-KO）和過表達（-OE）的轉(zhuǎn)基因水稻以及野生型水稻NPB噴霧接種稻瘟病菌（Guy11），7 d后進行調(diào)查，日本晴中2級病斑居多，并且數(shù)量有限，而-KO中病斑數(shù)量明顯增加，其中3級病斑數(shù)量居多，而且還有一定量的4級病斑存在，部分病斑連接成片。相比之下，-OE水稻中病斑幾乎全為1級病斑，雖然數(shù)量很多，但無典型的病斑癥狀。進一步對-KO和日本晴打孔接種稻瘟病菌，7 d后調(diào)查病情，同時統(tǒng)計病斑面積和相對生物量（圖4），發(fā)現(xiàn)敲除水稻中病斑面積和病葉中的相對生物量都明顯高于野生型，進一步證實了上述噴霧接種的結(jié)果，說明可以正調(diào)控水稻對稻瘟菌的抗性。

圖5 OsLOX10轉(zhuǎn)基因稻接種白葉枯菌的癥狀

Fig. 5. Symptom oftransgenic lines inoculated withby leaf clipping method.

對敲除水稻和日本晴接種白葉枯菌，14 d后調(diào)查病情（圖5），發(fā)現(xiàn)基因敲除水稻的病斑長度是野生型的2.5倍，說明的敲除顯著降低了水稻對白葉枯菌的抗性。

2.5 OsLOX10敲除和過表達轉(zhuǎn)基因水稻中抗病相關(guān)基因表達量的變化

對的敲除和過表達水稻在接種Guy11后一些抗病相關(guān)基因的表達量進行檢測（圖6），發(fā)現(xiàn)3個病程相關(guān)蛋白基因、、和水楊酸(SA)通路基因以及茉莉酸（JA）合成通路上的2個基因和在轉(zhuǎn)基因水稻中表達量均有變化。6個基因在-OE轉(zhuǎn)基因水稻中表達量明顯上調(diào)，而在-KO中卻保持在較低水平，并且在24 h開始出現(xiàn)顯著性變化。與野生型對照相比，SA通路標志基因在過表達轉(zhuǎn)基因水稻中表達量最大提高了2.1倍左右，而JA合成通路中的兩個標志基因和表達量最大提高了12.8倍和8.3倍。推測基因可能同時參與JA和SA介導(dǎo)的抗病反應(yīng)。

對的轉(zhuǎn)基因水稻接種，于0、1、3、5、7、9 d 取樣進行相關(guān)基因的表達量進行檢測（圖7），發(fā)現(xiàn)病程相關(guān)蛋白基因和SA通路基因以及JA合成通路上的3個基因和在轉(zhuǎn)基因水稻中表達量均有變化。5個基因在-OE轉(zhuǎn)基因水稻中表達量明顯上調(diào)，而在-KO中卻保持在較低水平，在7 d表現(xiàn)出顯著性差異。與野生型對照相比，SA通路標志基因在-OE中表達量是日本晴的3.0倍，而JA合成通路中的和表達量提高了4.6倍和3.0倍。

2.6 OsLOX10敲除水稻對幾丁質(zhì)和flg22的響應(yīng)

如圖8所示，在幾丁質(zhì)和flg22誘導(dǎo)后，野生型與基因敲除水稻均有活性氧的暴發(fā)，但是基因敲除水稻（-KO）中的活性氧的積累顯著低于野生型。幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后，野生型水稻在16 min達到峰值，-KO在18 min達到峰值，起峰時間相對滯后。而flg22誘導(dǎo)后野生型和-KO均在15 min達到峰值。KO在幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后ROS積累的峰值僅為野生型的68%，flg22誘導(dǎo)后ROS積累的峰值為野生型的60%。可見，的敲除使水稻對幾丁質(zhì)和flg22的敏感性降低。

圖6 OsLOX10轉(zhuǎn)基因水稻相關(guān)抗病基因在稻瘟病菌侵染早期的qRT-PCR分析

Fig. 6. qRT-PCR analysis of disease resistance-related genes intransgenic lines during the early infection of rice blast fungus.

圖7 OsLOX10轉(zhuǎn)基因水稻相關(guān)抗病基因在白葉枯病菌侵染早期的qRT-PCR分析

Fig. 7. qRT-PCR analysis of disease resistance-related genes intransgenic lines during the early infection of bacterial blight.

3 討論

迄今科學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)數(shù)個能同時改變水稻對稻瘟病和白葉枯病抗性的基因，如[19]、[20-21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、OsACBP5[27]和OsMESL[28]等。

LOX作為JA合成途徑中的關(guān)鍵酶，決定著JA 在植物體內(nèi)的水平，從而間接調(diào)控植物對各種脅迫的響應(yīng)。丙二烯氧合酶（AOS）是JA生物合成途徑中另一個關(guān)鍵酶。OsAOS2 在葉片的表達受稻瘟病菌的顯著誘導(dǎo)。用（受病原菌的強誘導(dǎo)）的啟動子驅(qū)動，轉(zhuǎn)基因株系中積累了較高水平的JA，特別是在受到病原菌侵染之后。過表達激活了其他病程相關(guān)基因（如、和）的表達，增加了抗性[29]。

A－幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因水稻OsLOX10-KO和日本晴中活性氧的暴發(fā)情況，水稻葉片用400 nmol/L的幾丁質(zhì)和水處理；B－flg22誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因水稻OsLOX10-KO和日本晴中活性氧的暴發(fā)情況，水稻葉片用500 nmol/L的flg22和水處理。

Fig. 8. Response of-KO transgenic rice and wild-type Nipponbare to flg22 and chitin.

科學(xué)家對的研究重點是水稻種子貯存等[13-14]，在抗病性方面的研究很少。本研究以為研究對象，該基因與同源性最高[7]，5的表達受到赤霉病菌侵染的誘導(dǎo)[30]。此外，玉米是重要的抗蟲害相關(guān)基因。突變體被害蟲咬食后，通過調(diào)控綠葉揮發(fā)素和茉莉酸酯的產(chǎn)生來抵御害蟲侵害[31]；在擬南芥中異源表達薄皮甜瓜，與轉(zhuǎn)錄因子MYC2結(jié)合，促進茉莉酸積累，誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉來增強擬南芥的耐旱性[32]。

本研究發(fā)現(xiàn)在稻瘟病菌侵染后的24 h和72 h，的表達量被顯著誘導(dǎo)，說明可能在水稻與稻瘟病菌的互作中起作用。在此基礎(chǔ)上獲得了該基因的敲除和過表達水稻，篩選得到純合的突變植株。對轉(zhuǎn)基因水稻噴霧接種稻瘟病菌Guy11，相對于野生型，敲除突變體更感病，而過表達突變體中感病程度很輕。同時打孔接種稻瘟病菌后，發(fā)現(xiàn)敲除突變體的病斑面積及真菌相對生物量明顯高于野生型。為進一步闡明抵抗稻瘟病菌侵染的作用機制，利用qRT-PCR分析了接種稻瘟菌后一些抗病相關(guān)基因在敲除和過表達轉(zhuǎn)基因水稻中的表達水平。結(jié)果顯示，相比野生型，3個基因、和，SA通路基因以及茉莉酸合成相關(guān)基因和的表達量在過表達株系中顯著上調(diào)，相反，敲除株系中的表達水平發(fā)生顯著下降。說明在水稻抵抗稻瘟病菌中起著正調(diào)控的作用，該作用可能同時涉及了水楊酸與茉莉酸通路。

本研究利用qRT-PCR分析白葉枯菌侵染水稻后的實時表達水平，發(fā)現(xiàn)可能參與水稻與白葉枯菌的早期互作中。對敲除水稻接種白葉枯菌，發(fā)現(xiàn)敲除突變體的感病程度明顯高于野生型，說明在水稻與白葉枯菌的互作中確實發(fā)揮一定的作用。

寄主植物的活性氧的暴發(fā)是病原菌成功侵染的標志之一。而植物中活性氧含量的升高會導(dǎo)致葉片中程序性細胞死亡的局部產(chǎn)生，從而防止進一步感染[33]。本研究用幾丁質(zhì)和flg22分別處理的敲除轉(zhuǎn)基因水稻及其野生型，發(fā)現(xiàn)的敲除使水稻被誘導(dǎo)的活性氧顯著性降低，同時還會使起峰時間推遲，說明參與了病原菌分子模式觸發(fā)的免疫途徑，正向調(diào)控水稻對稻瘟菌和白葉枯的抗性并伴隨著抗病相關(guān)基因表達量的上調(diào)，是SA與JA通路協(xié)同作用的結(jié)果。同時還在水稻抵抗白葉枯菌中發(fā)揮著重要作用，然而它們是如何參與到水稻與白葉枯菌的互作中還有待進一步研究。

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Positively Regulates Defense Responses of Rice to rice blast and bacterial blight

Zhou Yonglin1, 2, Shen Xiaolei1, 2, Zhou Lishuai1, 2, Lin Qiaoxia1, 2, Wang Zhaolu1, 2, Chen Jing1, 2, Feng Huijie1, Zhang Zhenwen1, Chen Xiaoting1, 2, 3, *, LU Guodong2

(1College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China;2Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Ministry of Education, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China;3Fujian Key Laboratory for Monitoring and Integrated Management of Crop Pests, Fuzhou 350013, China;*Corresponding author, E-mail: xiaotingchen@fafu.edu.cn)

【Objective】Rice blast caused byand bacterial blight caused bypv() seriously affect rice yield and quality. The transgenic materials ofwere created to evaluate the resistance toandThe possible mechanism ofin regulating the defense responses to rice blast and bacterial blight were elucidated.【Method】The knockout vector ofwas constructed using CRISPR/Cas9 system, and the overexpression vector ofwas constructed by linearizing pCXUN-HA with restriction enzymeⅠ and linking with TA ligation. Transgenic rice was obtained by genetic transformation, and the homozygous transgenic lines were screened for fungal and bacterial resistance analysis. The expression dynamics of SA (salicylic acid) and JA (jasmonic acid) pathway marker genes were analyzed by qRT-PCR after infection withThe outbreak of reactive oxygen species (ROS) induced by chitin and flg22 in rice was also observed. 【Result】qRT-PCR analysis showed that theexpression was up-regulated 24 h after inoculation withand. Theknockout lines were more susceptible to the rice blast than that of the wild type (Nipponbare) when inoculated with the spore suspension ofGuy11, while the overexpressed lines had no typical disease symptoms. At 6, 12, 24 and 36 hours post inoculation, the transcriptional levels of three pathogenesis-related genes,,andand two JA pathway genes,and, and SA pathway gene, were significantly down-regulated in the knockout transgenic lines. However, they were significantly up-regulated in overexpressed transgenic lines. Thetransgenic rice was inoculated with(), and theknockout lines were more susceptible to bacterial blight. qRT-PCR analysis showed that the relative expression levels ofandthe three genes (and) involved in theJA synthesis pathway were up-regulated inoverexpression lines, significantly down-regulated inknockout lines seven days afterinoculation.knockout also significantly reduced the ROS level induced by chitin and flg22 in rice, delayed the peaking time of ROS induced by chitin, and reduced the sensitivity of rice to chitin and flg22.【Conclusion】could be induced by infection withandmay be involved in pathogen-associated molecular patterns triggered immunity, and play a positive regulatory role in rice resistance to rice blast and bacterial blight. Moreover, themay regulate rice resistance toandthrough SA and JA mediated signaling pathways.

; CRISPR/Cas9; disease resistance; rice blast; bacterial blight; signal pathway

2021-06-10;

2021-09-30。

國家自然科學(xué)基金資助項目(31972251)；福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室開放課題(MIMCP-202001)；福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新專項(KFA17308A, CXZX2020152D)；福建農(nóng)林大學(xué)生物學(xué)高原學(xué)科建設(shè)經(jīng)費資助項目(71201800810)。

10.16819/j.1001-7216.2022.210604