抗壞血酸對(duì)銅脅迫蠶豆種子萌發(fā)和根尖細(xì)胞損傷的緩解作用

秦永燕，王雪婷，班子茹，宋曉丹

（長治學(xué)院生命科學(xué)系，山西長治 046011）

重金屬污染環(huán)境是當(dāng)今環(huán)境學(xué)、生物科學(xué)交叉領(lǐng)域備受關(guān)注的焦點(diǎn)。銅作為植物生長必需的微量元素，可以激活多酚氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶及抗壞血酸氧化酶等多種酶類參與植物體內(nèi)的生理代謝。研究表明低濃度的銅可促進(jìn)植物生長，高濃度會(huì)抑制植物生長，產(chǎn)生毒害作用。近年來，隨著工業(yè)、農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和采礦業(yè)等的開發(fā)，含銅物質(zhì)的大量排放，致使土壤中銅離子的濃度逐日增加，造成環(huán)境污染。

目前，土壤修復(fù)技術(shù)主要包括物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)等，其中生物修復(fù)周期長，見效慢；物理修復(fù)和化學(xué)修復(fù)見效快，但容易造成二次污染?？箟难幔ˋscorbic Acid，AsA）即維生素C，不僅是植物重要的非酶抗氧化劑，還是一種綠色環(huán)保的還原劑，它可以降低外界環(huán)境對(duì)植物造成的傷害如病害、紫外線輻射、干旱等。研究表明，少量的抗壞血酸能夠使植物增強(qiáng)脅迫環(huán)境下的抵抗能力；能夠有效地緩解高濃度的鉛或汞對(duì)植物的毒害，而且，在一定程度上減輕銅脅迫對(duì)廣藿香幼苗生長的毒害作用。

目前對(duì)水環(huán)境污染的監(jiān)測(cè)方法有物理、化學(xué)和生物等手段，其中生物手段可以直接評(píng)估出水環(huán)境污染的生物學(xué)效應(yīng)，并且對(duì)污染物的污染程度有直接的指示作用。蠶豆（）根尖細(xì)胞微核技術(shù)應(yīng)用于水質(zhì)污染監(jiān)測(cè)具有良好的指示作用。該技術(shù)已經(jīng)被世衛(wèi)組織、聯(lián)合國環(huán)境署、美國國家環(huán)保局等多個(gè)機(jī)構(gòu)確定為水環(huán)境污染的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。1986 年，我國也將蠶豆根尖微核技術(shù)列入水環(huán)境測(cè)試的技術(shù)規(guī)范。研究表明蠶豆根尖微核率與重金屬、生物堿等的毒性具有較好的相關(guān)性?？箟难嶙鳛橹参矬w內(nèi)一種重要的小分子非酶抗氧化物。近年來，利用外源AsA 提高植物抵御外界脅迫方面有了一定的研究和應(yīng)用，如減輕Al脅迫對(duì)水稻幼苗的氧化損傷，緩解蠶豆根尖細(xì)胞由于Pb、Hg脅迫而引起的遺傳毒性效應(yīng)。因此，本試驗(yàn)以蠶豆為試驗(yàn)材料，比較銅單獨(dú)處理和銅與抗壞血酸聯(lián)合處理后蠶豆種子萌發(fā)，胚根長、胚芽長、根系活力、以及蠶豆根尖有絲分裂指數(shù)、染色體畸變率和微核千分率，研究抗壞血酸對(duì)銅脅迫蠶豆種子萌發(fā)和根尖細(xì)胞遺傳毒性效應(yīng)的影響，旨在為緩解重金屬銅污染提供一種可靠的理論依據(jù)和可行的實(shí)驗(yàn)方案。

1 材料與方法

1.1 材料

蠶豆（），品種為北斗七星，來源于山東省臨沂市（2020 年8 月收獲的種子）。

1.2 方法

挑選沒有病害的蠶豆種子，先用蒸餾水漂洗2次，再用2%HO浸泡消毒10 min，蒸餾水中浸泡24 h 備用。

1.2.1 蠶豆種子萌發(fā)

選擇同一批購買的飽滿一致的蠶豆種子放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，于（23±1）℃條件下萌發(fā)。處理一（T1）：分別加入不同濃度的硫酸銅溶液10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L 進(jìn)行處理，記作T1-1，T1-2，T1-3，T1-4，T1-5，以蒸餾水培養(yǎng)為對(duì)照組（記作T1-CK）。處理二（T2）：以加入20 mg/L 抗壞血酸溶液培養(yǎng)為對(duì)照組（T2-CK），其余處理分別為10 mg/L CuSO+20 mg/L AsA、20 mg/L CuSO+20 mg/L AsA、40 mg/L CuSO+20 mg/L AsA、60 mg/L CuSO+20 mg/L AsA、80 mg/L CuSO+20 mg/L AsA混合溶液處理，分別記作T2-1，T2-2，T2-3，T2-4，T2-5。抗壞血酸的濃度參照李賀勤等的研究結(jié)果以及前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果綜合選擇。培養(yǎng)期間每天補(bǔ)充相應(yīng)濃度的處理液。各濃度處理每皿10 粒種子，每次10皿，重復(fù)3 次。從對(duì)照組種子萌發(fā)（胚芽的長度大于等于種子長度的1/2 且胚根與種子長度相等視為萌發(fā)）開始，每天上午9 點(diǎn)記錄各處理種子的發(fā)芽數(shù)，連續(xù)統(tǒng)計(jì)7 d。整個(gè)發(fā)芽試驗(yàn)參照國際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)制定的種子檢驗(yàn)規(guī)程（1996），用游標(biāo)卡尺測(cè)量胚根長和胚芽長，用TTC 法測(cè)定其根系活力。

發(fā)芽勢(shì)（%）=正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100

發(fā)芽率（%）=正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100

發(fā)芽指數(shù)（）=∑/，式中，為時(shí)間的發(fā)芽數(shù)，Dt 為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

活力指數(shù)（）=×，式中，為幼苗高度。

1.2.2 蠶豆根尖細(xì)胞學(xué)觀察

按照1.2.1 中方法處理20 h 后，用蒸餾水恢復(fù)培養(yǎng)24 h，剪取根尖，于Carnoy 固定液中固定12～24 h，置于70%乙醇冰箱保存，備用。

常規(guī)壓片鏡檢，每個(gè)處理觀察1000 個(gè)分生區(qū)細(xì)胞，設(shè)5 個(gè)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)其微核率、有絲分裂指數(shù)和染色體畸變率。其中，有絲分裂指數(shù)MI（%）及微核千分率MCN（‰）的計(jì)算方法如下：

MI（%）=（樣品有絲分裂發(fā)生細(xì)胞數(shù)/樣品觀察到的細(xì)胞數(shù)）×100；

MCN（‰）=（樣品MCN 發(fā)生細(xì)胞數(shù)/樣品觀察到的細(xì)胞數(shù)）×1000；

染色體畸變率（%）=（畸變細(xì)胞數(shù)/分裂期細(xì)胞總數(shù)）×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)處理均采用SPSS 25.0 進(jìn)行分析，并用檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異檢驗(yàn)，以＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅對(duì)蠶豆種子萌發(fā)的影響

由圖1 可知，T1 和T2 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著銅離子處理濃度的增加，蠶豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)逐漸下降，且均低于對(duì)照。當(dāng)銅離子濃度低于20 mg/L 時(shí)，與各對(duì)照相比差異不顯著（＞0.05），當(dāng)銅離子濃度高于40 mg/L 時(shí)，與各對(duì)照相比差異顯著（＜0.01），表現(xiàn)出一定的抑制作用。

圖1 銅與抗壞血酸對(duì)蠶豆萌發(fā)的影響

T2 組與T1 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，在相同銅離子處理濃度下，聯(lián)合處理后，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均有不同程度的增加。當(dāng)銅離子濃度為40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L 時(shí)，蠶豆種子的發(fā)芽率分別增加了3.80%、4.62%、5.05%；發(fā)芽勢(shì)分別增加了2.95%、6.70%、6.75%；發(fā)芽指數(shù)分別增加了4.44%，9.11%，14.10%；活力指數(shù)分別增加了21.54%、28.72%、52.96%。以上結(jié)果表明聯(lián)合處理有一定的促進(jìn)作用，且濃度越高，促進(jìn)作用越大。

2.2 銅對(duì)蠶豆幼苗早期生長的影響

由圖2 可知，T1 和T2 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨銅離子處理濃度的增加，蠶豆胚根長、胚芽長和根系活力均呈先增加后下降趨勢(shì)。當(dāng)銅離子濃度為40 mg/L、60 mg/L 和80 mg/L 時(shí)，T1 組中根系活力的抑制率分別為28.23%、43.53%和62.35%；胚根長的抑制率分別為0.39%、31.98%和46.90%；胚芽長的抑制率分別33.48%，37.10%和51.58%；T2 組中根系活力的抑制率分別為2.15%，16.13%和38.71%；胚根長的抑制率分別為0.14%、26.64%和43.41%，胚芽長的抑制率分別為25.10%、29.67%和40.46%；均低于T1 組的抑制率，表明聯(lián)合處理對(duì)銅抑制蠶豆早期生長有一定的緩解作用。

圖2 銅與抗壞血酸對(duì)蠶豆生長的影響

T2 與T1 組相比，當(dāng)銅離子濃度為40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L 時(shí)，蠶豆根尖根系活力分別增加49.18%、62.5%和78.13%；胚根長分別增加了35.60%，45.86%，44.16%；染色體胚芽長分別增加了22.79%，21.94%，34.11%。因此，聯(lián)合處理可以緩解銅對(duì)蠶豆根尖的損傷作用，且銅離子濃度越高，聯(lián)合處理的促進(jìn)作用越強(qiáng)。

2.3 蠶豆根尖微核率、有絲分裂指數(shù)和染色體畸變率的變化

由圖3 可知，T1 組中，隨著銅離子處理濃度的增加，蠶豆根尖有絲分裂指數(shù)（M）I 呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)銅離子濃度為20 mg/L 和40 mg/L時(shí)，有絲分裂指數(shù)最高，分別為8.51%和7.34%，與對(duì)照相比，分別提高了49.36%和28.81%，差異顯著（＜0.05），說明低濃度可促進(jìn)細(xì)胞分裂。其余處理組有絲分裂指數(shù)與對(duì)照差異不顯著（＞0.05）。隨著處理濃度的增加，微核率和染色體畸變率逐漸增加，當(dāng)銅離子濃度為80 mg/L 時(shí)，微核率最高，為19.56‰，是對(duì)照組的3.15 倍；染色體畸變率最高，為4.77%，是對(duì)照組的1.73 倍。表明高濃度的銅離子對(duì)蠶豆根尖有一定的損傷作用。

圖3 蠶豆根尖細(xì)胞微核率及染色體畸變率的變化

T2 組中隨著處理濃度的增加有絲分裂指數(shù)呈先上升后下降趨勢(shì)，各處理組均高于對(duì)照組，且差異顯著（＜0.05）。當(dāng)銅離子濃度為20 mg/L 時(shí)，有絲分裂指數(shù)最高為9.05%，高于對(duì)照59.61%；蠶豆根尖微核率和染色體畸變率隨處理濃度的增大而增加。當(dāng)銅離子濃度為80 mg/L 時(shí)，微核率最高，為17.79‰，是對(duì)照組的2.86 倍；當(dāng)銅離子濃度為80 mg/L 時(shí)，染色體畸變率最高，為4.45%，是對(duì)照（2.75%）的1.62 倍。

T2 與T1 組相比，當(dāng)銅離子濃度為10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L 和80 mg/L 時(shí)，蠶豆根尖有絲分裂指數(shù)分別提高了4.14%，6.35%，14.58%、19.77%和20.21%；T2 組微核率和染色體畸變率與均比T1 組低，隨著處理濃度的增加，微核率分別下降了6.72%，7.09%，14.87%，14.75%，9.05%；染色體畸變率分別下降了2.08%，3.46%，5.42%，5.21%，6.71%。因此，聯(lián)合處理可以緩解銅對(duì)蠶豆根尖的損傷作用。除微核率外，銅離子濃度越高，聯(lián)合處理的促進(jìn)作用越明顯。

3 討論與結(jié)論

利用蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)研究不同濃度銅離子對(duì)蠶豆根尖的損傷效應(yīng)。結(jié)果表明，當(dāng)銅離子濃度為10 mg/L 時(shí)，蠶豆發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)，根長、根系活力、根尖有絲分裂指數(shù)、微核率和染色體畸變率都與對(duì)照差異不顯著。當(dāng)銅離子濃度為20 mg/L 時(shí)，蠶豆根長、株高、根系活力、有絲分裂指數(shù)顯著高于對(duì)照，說明該濃度下銅可以顯著促進(jìn)蠶豆生長。此時(shí)，微核率低于10‰，根據(jù)微核率與污染程度的判定標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為該濃度基本無污染。當(dāng)銅離子濃度為80 mg/L 時(shí)，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚根長、根系活力、均顯著低于對(duì)照，微核率和染色體畸變率顯著高于對(duì)照，對(duì)蠶豆根尖生長造成損傷。這與重金屬可抑制根的伸長，出現(xiàn)植株矮小等狀況相一致。這可能是因?yàn)檫^量銅富集在根部，抑制酶活性，損傷根部組織，影響植物生長。也可能是高濃度下銅進(jìn)入植株體內(nèi)后，與核酸、蛋白質(zhì)和酶等大分子物質(zhì)結(jié)合，或者取代某些酶和蛋白質(zhì)行使其功能時(shí)所必需的特定元素，使其變性或活性降低，造成生理功能紊亂，抑制根尖細(xì)胞有絲分裂，增加微核率和染色體畸變率，此時(shí)，微核率為19.56‰，屬于中度污染。茍本富研究表明隨著Cu 濃度增大，蠶豆幼苗根尖中基因組DNA 損傷也越來越嚴(yán)重，本文與之研究結(jié)果相一致。

銅作為植物生長必需的微量元素，既會(huì)產(chǎn)生有益于對(duì)植物生長有利的亞鐵氧化酶等，同時(shí)也會(huì)使植物體內(nèi)的強(qiáng)氧化劑活性氧升高。因此，當(dāng)銅離子濃度低時(shí)，對(duì)植物體產(chǎn)生的益處要大于活性氧產(chǎn)生的危害，表現(xiàn)出促進(jìn)作用；當(dāng)銅離子濃度高時(shí)，可導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），使得DNA、蛋白質(zhì)、膜脂及細(xì)胞其它組分嚴(yán)重受損，故染色體畸變率和微核率明顯上升。此外，仲昭朝等研究表明活性氧可能介導(dǎo)銅脅迫造成根尖生長抑制，是植物在遭受重金屬銅脅迫時(shí)細(xì)胞凋亡和線粒體膜損傷的重要生理信號(hào)。因此，高濃度的銅對(duì)蠶豆根尖生長會(huì)造成一定的毒害。

近年來，抗壞血酸作為植物體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，在植物抵抗各種脅迫過程中起著非常重要的保護(hù)功能。本文研究表明20 mg/L 抗壞血酸與銅聯(lián)合處理與銅單獨(dú)處理相比，胚根長、胚芽長、根系活力、有絲分裂指數(shù)均升高了，微核率和染色體畸變率均下降了。當(dāng)銅離子濃度為80 mg/L 時(shí)，聯(lián)合處理后（T2），有絲分裂指數(shù)顯著高于對(duì)照，微核率下降，低于18‰，將中度污染降為輕度污染，說明20 mg/L 抗壞血酸可修復(fù)銅對(duì)蠶豆根尖的損傷。其原因可能是AsA 在植物細(xì)胞分裂與生長、細(xì)胞壁組成和光合作用等生長發(fā)育代謝活動(dòng)以及抵御逆境脅迫的抗氧化保護(hù)等方面具有重要的調(diào)控功能有關(guān)；也可能是抗壞血酸發(fā)揮類似于休眠的作用來抑制細(xì)胞的有絲分裂從而使得活性氧水平下降而達(dá)到修復(fù)的作用。

綜上所述，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，當(dāng)銅離子濃度為0～20 mg/L 時(shí)，對(duì)蠶豆生長有促進(jìn)作用，當(dāng)銅離子濃度高于40 mg/L 時(shí)，銅對(duì)蠶豆根尖有不同程度的毒害損傷。聯(lián)合處理后，20 mg/L 抗壞血酸可不同程度地緩解銅對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞的毒害作用，而且銅離子濃度越高，緩解毒害作用越明顯，具體緩解的機(jī)理仍需進(jìn)一步探究。