范業(yè)鍇，劉玉芳，陶 林，江炎庭，歐陽依娜，張偉峰，洪瓊花*，儲(chǔ)明星*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056001；3.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明 650224）

過去幾千年，人類通過對(duì)野生動(dòng)物的馴養(yǎng)和馴化逐步積累了育種經(jīng)驗(yàn)。山羊是人類最早馴化的野生動(dòng)物之一，也是一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，其分布遍及全世界。山羊按其經(jīng)濟(jì)用途可分為乳用、肉用、絨用3 類。繁殖性能是肉用山羊重要的經(jīng)濟(jì)性狀，但產(chǎn)羔數(shù)、初生窩重和斷奶窩重等繁殖性狀因?yàn)檫z傳力低、分子機(jī)制尚不明確使常規(guī)育種方法進(jìn)程緩慢，難以在短時(shí)間內(nèi)快速改良。分子標(biāo)記輔助育種具有準(zhǔn)確度高、操作性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可以縮短育種年限，加快育種進(jìn)程，提高育種效率。因此，繁殖相關(guān)基因候選分子標(biāo)記的發(fā)掘具有重要意義。

人前列腺6-跨膜上皮抗原（）家族由和組成，它 們具有作為金屬離子還原酶的天然活性，在金屬離子的代謝過程中發(fā)揮重要作用。它們參與了廣泛的生物過程，如胞內(nèi)和胞外途徑中的分子運(yùn)輸以及細(xì)胞增殖和凋亡。1999 年，Hubert 等人發(fā)現(xiàn)前列腺六次跨膜上皮抗原l（Six-Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate 1，）在前列腺癌中該基因高表達(dá)，并指出在其他癌癥細(xì)胞系中存在差異表達(dá)。后續(xù)研究證明，不僅在前列腺惡性腫瘤中異常高度表達(dá)，而且在肺癌、尤文氏肉瘤、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌中亦存在高度表達(dá)。焦志等研究證明在人的卵巢癌細(xì)胞中高度表達(dá)。因此，基因可能在卵巢細(xì)胞異常增殖過程起重要作用。

真核生物起始因子2B（EIF2B）是蛋白質(zhì)合成所必需的一種GTP 交換因子，由5 個(gè)不同的亞基組成（EIF2B1、EIF2B2、EIF2B3、EIF2B4 和EIF2B5），是EIF2B 的第4 個(gè)亞單位，在RNA 到蛋白質(zhì)翻譯過程中發(fā)揮重要功能?；蚩梢源龠M(jìn)GDP 和GTP 的相互轉(zhuǎn)換，該基因主要作用于少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)翻譯過程。因此，基因可能在調(diào)控山羊繁殖性能的主效基因翻譯過程中起重要作用。

課題組前期對(duì)云上黑山羊（以努比山羊?yàn)楦副?、云嶺山羊?yàn)槟副九嘤傻奈覈?guó)第一個(gè)肉用黑山羊品種）重測(cè)序數(shù)據(jù)表明，云上黑山羊群體和基因存在多態(tài)性位點(diǎn)，因此，推測(cè)和基因可能是影響山羊繁殖性能的重要候選基因。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)和基因重測(cè)序結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)了基因突變位點(diǎn)g.72016288 T>G，基因g.45853158 C>T、g.45857371 T>A、g.458 57371 T>A，采用MassARRAYSNP 分型技術(shù)對(duì)和的基因型進(jìn)行檢測(cè)，分析候選基因多態(tài)性位點(diǎn)與山羊繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性。本研究通過分析和基因在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊群體中的遺傳多態(tài)性及其與繁殖性能的關(guān)聯(lián)性，以期為通過分子標(biāo)記輔助選擇選育多羔山羊新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和表型記錄 本研究共采集了768 只母羊（2～5 歲，544 只云上黑山羊、133 只濟(jì)寧青山羊和91只遼寧絨山羊）的頸靜脈血液（10 mL/只），用酚-氯仿法提取基因組DNA。云上黑山羊來源于云南紅河哈尼族彝族自治州，擁有至少1 胎產(chǎn)羔數(shù)記錄，部分擁有產(chǎn)羔窩重和斷奶窩重（3 月齡）記錄。濟(jì)寧青山羊來源于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部濟(jì)寧青山羊保種基地（山東省嘉祥縣），遼寧絨山羊來源于遼寧絨山羊育種中心（遼寧省遼陽市）。濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊沒有具體產(chǎn)羔數(shù)記錄。本研究將濟(jì)寧青山羊視為高繁殖力群體，將遼寧絨山羊視為低繁殖力群體。

1.2 基因分型 利用MassARRAY技術(shù)對(duì)和基因候選多態(tài)性位點(diǎn)（g.45853158 C>T、g.45857371 T>A、g.45857371 T>A 和g.72016288 T>G）進(jìn)行分型。分型引物信息見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 群體遺傳學(xué)參數(shù)的計(jì)算方法參考Zhang等。計(jì)算產(chǎn)羔數(shù)和窩重的平均數(shù)后，基因型的效應(yīng)采用單因素方差分析。多重比較采用Tukey 法。云上黑山羊低產(chǎn)和高產(chǎn)基因型差異顯著性檢驗(yàn)、Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)、候選基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型與品種（高繁品種：濟(jì)寧青山羊，低繁品種：遼寧絨山羊）之間的關(guān)系檢驗(yàn)、產(chǎn)羔數(shù)和窩重的基因型效應(yīng)分析等數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析由SPSS（V.20.0）完成，產(chǎn)羔數(shù)和窩重用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

1.4 山羊和基因的生物信息學(xué)分析 山羊的基因序列和翻譯蛋白序列來自NCBI（登錄號(hào)：XM_005679303.3，XP_005679360.3）。山羊的基因來自NCBI（登錄號(hào)：XM_018055503.1，XP_017910992.1）。利用Param tool（https://web.expasy.org/protparam/）用于預(yù)測(cè)目的蛋白理化性質(zhì)；利用Prot Scale 在線工具（https:∥web.expasy.org/protscale/）對(duì)其目的蛋白的疏水性進(jìn)行分析；采用NopoPro 在線工具（https://www.novopro.cn/tools/signalp）進(jìn)行目的蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)；采用Detaibio 在線工具（http://www.deta ibio.com/tools/index.php?r=transmembrane%2Findex）進(jìn)行目的蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)；SCRATCH Protein Predictor（http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/index.html）用于預(yù)測(cè)目的蛋白的二硫鍵；NetOGlyc 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）用于預(yù)測(cè)目的蛋白的糖基化；NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）用于預(yù)測(cè)目的蛋白的磷酸化位點(diǎn)。采用SOPMA 在線工具（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/ npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）進(jìn)行目的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果

2.1和基因多態(tài)性分析 基因分型結(jié)果表明，4 個(gè)候選位點(diǎn)均存在多態(tài)性（圖1）。群體遺傳學(xué)分析表明，基因g.45857345 C>T 位點(diǎn)在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊、遼寧絨山羊群體中均為中度多態(tài)（0.25T 位點(diǎn)在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊、遼寧絨山羊群體中均為低度多態(tài)（PIC<0.25）；基因g.45857371 T>A 在云上黑山羊中為中度多態(tài)（0.25G 在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊、遼寧絨山羊群體中均為低度多態(tài)（PIC<0.25）（表2）?？ǚ綑z驗(yàn)表明，基因g.45857345 C>T 在3 個(gè)群體中不處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)（<0.05），基因g.45857371 T>A 在云上黑山羊中不處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)（<0.05），基因g.72016288 T>G 在濟(jì)寧青山羊中不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（<0.05），基因g.45853158 C>T 在3 個(gè)品種中均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)（>0.05）。

表2 STEAP1、EIF2B4 基因4 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在不同山羊品種中的群體遺傳學(xué)分析

圖1 基因分型結(jié)果

2.2 候選多態(tài)性位點(diǎn)與繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析 如表3 所示，g.45853158 C>T 和g.72016288 T>G 在不同繁殖力品種（濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊）中的基因型分布存在極顯著差異。g.45857345 C>T、g.45857371 T>A 在不同繁殖力品種（濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊）中的基因型分布差異不顯著。

表3 候選位點(diǎn)基因型與不同繁殖力品種的卡方檢驗(yàn)

由表4 可知，云上黑山羊高產(chǎn)群體和低產(chǎn)群體中所有候選多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率均無顯著差異。

表4 STEAP1、EIF2B4 基因多態(tài)位點(diǎn)在云上黑山羊高產(chǎn)、低產(chǎn)中的基因型頻率和等位基因頻率

表5 中，所有基因候選多態(tài)性位點(diǎn)均對(duì)產(chǎn)羔數(shù)無顯著影響，所有基因候選多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)初生窩重和斷奶窩重?zé)o顯著影響。

表5 STEAP1 和EIF2B4 對(duì)云上黑山羊繁殖性能的影響（均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

2.4 STEAP1 和EIF2B4 蛋白的生物信息學(xué)分析STEAP1 蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)表明：該蛋白由339 個(gè)氨基酸組成，其分子量為40.03 KDa，等電點(diǎn)為9.928 2，分子式為CHNOS，總原子數(shù)為5 479；從蛋白組成來看，其主要由20 種氨基酸組成，其中亮氨酸（Leu）含量最高為13.9%，而半胱氨酸（Cys）含量最低為0.3%，蛋白在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為51.60，脂溶性指數(shù)為114.13，親水平均值為0.103，故該蛋白是一種不穩(wěn)定脂溶性的疏水蛋白；從信號(hào)肽和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白屬無信號(hào)肽結(jié)構(gòu)（圖2A），存在6 個(gè)跨膜區(qū)（圖2B）；二硫鍵預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白存在3 個(gè)半胱氨酸（Cys），蛋白序列沒有形成二硫鍵。

圖2 山羊STEAP1 蛋白的信號(hào)肽（A）和跨膜結(jié)構(gòu)域（B）預(yù)測(cè)

EIF2B4 蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)表明，該蛋白由539個(gè)氨基酸組成，其分子量為58.89 KDa，等電點(diǎn)為9.41，分子式為CHNOS，總原子數(shù)為8 357；從蛋白組成來看，其主要由20 種氨基酸組成，其中亮氨酸（Leu）含量最高為11.1%，而色氨酸（Trp）含量最低為0.4%，蛋白在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為48.44，脂溶性指數(shù)為87.05，親水平均值為-0.378，故該蛋白是一種不穩(wěn)定脂溶性的親水蛋白；從信號(hào)肽和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白屬無信號(hào)肽結(jié)構(gòu)（圖3A）、無跨膜區(qū)（圖3B）；二硫鍵預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白存在11 個(gè)半胱氨酸（Cys），蛋白序列沒有形成二硫鍵。

圖3 山羊EIF2B4 蛋白的信號(hào)肽（A）和跨膜結(jié)構(gòu)域（B）預(yù)測(cè)

基因的3 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)均為錯(cuò)義突變，基因的多態(tài)位點(diǎn)屬于同義突變?；蚨鄳B(tài)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)蛋白變化為g.45853158 C>T 使295 位Val>Lle，g.45857345 C>T 使49 位Arg>His，g.45857371 T>A 使40 位Gln>His，3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中只有g(shù).45853158 C>T 符合Hardy-Weinberg 平衡且在不同繁殖力品種羊中差異極顯著，為探究g.45853158 C>T 基因突變前后蛋白功能和結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)其突變前后糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：突變前后STEAP1 編碼蛋白的糖基化和磷酸化位點(diǎn)未發(fā)生變化，突變前（圖4A）和突變后（圖4B）STEAP1 編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中突變后-轉(zhuǎn)角區(qū)域減少，-螺旋區(qū)域增多，延伸鏈區(qū)域減少，無規(guī)卷曲區(qū)域減少。

圖4 山羊STEAP1 突變前編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（A）和突變后編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（B）

3 討論

山羊的產(chǎn)羔性能受微效多基因控制，遺傳機(jī)理尚未明確?；蚨鄳B(tài)性指同一物種的不同基因組DNA等位序列之間的差異，多態(tài)性位點(diǎn)可能造成mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)翻譯水平發(fā)生改變，進(jìn)而影響生物性狀。前人研究發(fā)現(xiàn)，基因在人卵巢中高度表達(dá)，推測(cè)該基因可能對(duì)山羊的繁殖性能有著重要影響，本研究對(duì)課題組前期重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析發(fā)現(xiàn)，基因在山羊中存在g.45853158 C>T、g.45857371 T>A 和g.45857371 T>A 3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，且均為錯(cuò)義突變，對(duì)該基因多態(tài)性位點(diǎn)和山羊繁殖性能進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)基因g.45853158 C>T 突變?cè)诓煌敝承阅苋后w中有顯著差異。李曉琴等研究發(fā)現(xiàn)，mRNA 到蛋白質(zhì)的翻譯速率與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)之間有一定關(guān)系：高翻譯速率時(shí)編碼螺旋、無規(guī)卷曲較多；低翻譯速率時(shí)編碼無規(guī)卷曲較多、編碼螺旋較少；折疊結(jié)構(gòu)則隨翻譯速率表現(xiàn)出明顯的振蕩。同時(shí)，密碼子的使用在不同片段內(nèi)一般也是不均勻的：在螺旋片段內(nèi)，結(jié)構(gòu)尾部偏向使用高翻譯速率密碼子；中部?jī)A向使用中翻譯速率密碼子；而頭部使用的密碼子翻譯速率偏低。

對(duì)山羊基因突變前后蛋白理化性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)，g.45853158 C>T 使山羊基因編碼蛋白空間二級(jí)結(jié)構(gòu)-轉(zhuǎn)角區(qū)域減少，-螺旋區(qū)域增多，延伸鏈區(qū)域減少，無規(guī)卷曲區(qū)域減少，推測(cè)其為影響基因g.45853158 C>T 在不同繁殖力群體有顯著差異的重要因素。

前人研究發(fā)現(xiàn)，基因是真核細(xì)胞翻譯起始因子，對(duì)人體所有細(xì)胞中啟動(dòng)蛋白質(zhì)合成過程中RNA 到蛋白質(zhì)的翻譯有著重要作用且基因可以促進(jìn)GDP 和GTP 的相互轉(zhuǎn)換，推測(cè)該基因可作為繁殖相關(guān)細(xì)胞的翻譯起始因子；對(duì)重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析發(fā)現(xiàn)，基因在山羊中存在g.72016288 T>G，為同義突變；對(duì)位點(diǎn)和對(duì)應(yīng)繁殖性能進(jìn)行整合分析后發(fā)現(xiàn)，g.72016288 T>G 突變對(duì)山羊繁殖性能無顯著影響。

4 結(jié)論

基因的位點(diǎn)g.45853158 C>T 在不同繁殖性能群體中有顯著差異，突變?cè)斐蒘TEAP1 編碼蛋白二級(jí)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可作為云上黑山羊產(chǎn)羔性能的分子標(biāo)記，但不適合進(jìn)行窩選。