呂青青，秦 琴，涂治驍，肖世平，楊彩梅，劉玉蘭，肖 勘*

（1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023；2.浙江惠嘉生物科技股份有限公司，浙江安吉 313307）

腸道不僅承擔(dān)著消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要功能，同時(shí)還作為機(jī)體內(nèi)表面積最大的器官與外界環(huán)境有著直接的接觸，隨時(shí)受到內(nèi)外環(huán)境中不利因素的刺激，從而引起腸上皮損傷、腸道功能障礙，最終誘發(fā)腸道疾病。腸道屏障完整對(duì)于抵御內(nèi)源性和外源性有害物質(zhì)的入侵十分重要。腸道的物理屏障由一層柱狀上皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白組成，腸上皮細(xì)胞是構(gòu)成腸道黏膜的關(guān)鍵成分，通過與緊密連接蛋白相互作用共同防止有害抗原、微生物及其毒素侵入機(jī)體。已有許多研究通過培養(yǎng)豬小腸上皮細(xì)胞系（IPEC-1）構(gòu)建體外腸道模型。腸上皮細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子-（TNF-）等炎性細(xì)胞因子十分敏感，因此本試驗(yàn)采用TNF-刺激來構(gòu)建IPEC-1 細(xì)胞損傷模型。

腸道損傷與細(xì)胞死亡有密切關(guān)系。隨著生命科學(xué)研究領(lǐng)域的不斷進(jìn)展，細(xì)胞程序性壞死逐漸引起人們的注意。程序性壞死主要是由受體相互作用蛋白激酶1（RIP1）、受體相互作用蛋白激酶3（RIP3）和混合系激酶樣結(jié)構(gòu)域蛋白（MLKL）介導(dǎo)的，它結(jié)合了細(xì)胞凋亡和壞死的特征。近年來，程序性壞死被證明在多種因素引起的組織損傷中發(fā)揮重要作用，如心臟、腦缺血再灌注和腸道炎癥，但有關(guān)豬腸道程序性壞死的研究報(bào)導(dǎo)較少。因此，本試驗(yàn)旨在探究TNF-刺激是否能激活I(lǐng)PEC-1 細(xì)胞程序性壞死信號(hào)通路，同時(shí)誘導(dǎo)IPEC-1 細(xì)胞損傷、細(xì)胞間緊密連接的破壞和屏障功能障礙，探索關(guān)于腸道損傷和腸上皮細(xì)胞死亡的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 IPEC-1 細(xì)胞來自德克薩斯農(nóng)工大學(xué)；DMEM/F-12 培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone 公司；TNF-、熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖4（FITC-dextran，F(xiàn)D4）購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司。乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；Cell Counting Kit（CCK8）試劑盒購(gòu)自武漢丁香園生物科技有限公司；臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自Solarbio 公司。

1.2 培養(yǎng)基的配制 在DMEM-F12 培養(yǎng)基中按比例加入5%的胎牛血清（FBS）、1%的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-X（ITS-X）、1%的青鏈霉素混合液（PSF）和0.5‰的表皮生長(zhǎng)因子（EGF），配制成完全培養(yǎng)基，經(jīng)無菌過濾操作后使用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇IPEC-1 細(xì)胞，在含有5%CO、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每2 d 更換1 次培養(yǎng)基。當(dāng)貼壁細(xì)胞量達(dá)到90%～95%時(shí)，用胰酶消化。終止消化后，1 500 r/min 離心5 min，棄上清重懸，適當(dāng)稀釋細(xì)胞懸液、鋪板培養(yǎng)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 細(xì)胞活力 將細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，當(dāng)貼壁細(xì)胞量達(dá)到70%后，用含有50 ng/mL TNF-的培養(yǎng)液刺激細(xì)胞，對(duì)照組培養(yǎng)液中加入等量的磷酸鹽緩沖液（PBS）作為溶劑對(duì)照，培養(yǎng)細(xì)胞48 h。刺激結(jié)束后，用含有CCK8 的培養(yǎng)基（CCK8 和完全培養(yǎng)基按1:9 配制），置于37℃恒溫避光孵育1.5 h 后，立即用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm 處測(cè)吸光度。

1.4.2 LDH 活性 將細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞處理同上。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用LDH 試劑盒檢測(cè)上清液中的LDH 活性。

1.4.3 細(xì)胞數(shù)量 將細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞處理同上。刺激結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，用PBS 清洗2 遍，每孔加入500 μL 胰酶消化離心后加入1 mL PBS 吹打混勻。取10 μL 細(xì)胞懸液與 90 μL 0.5% 臺(tái)盼藍(lán)染液混合均勻，點(diǎn)樣于血球計(jì)數(shù)板上，放在低倍鏡下（10×10 倍）觀察，計(jì)數(shù)4 個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。

1.4.4 跨上皮電阻（TEER）和FD4 通透性 將細(xì)胞接種于12 孔Transwell 板中，上室加入0.5 mL 細(xì)胞懸液，下室加入1.5 mL 全培。第4 天后，每天用Milicell-ERS 電阻儀測(cè)量電阻值并記錄，培養(yǎng)至細(xì)胞TEER 值趨于穩(wěn)定，再用50 ng/mL TNF-+1 mg/mL FD4 共同處理48 h，測(cè)定TEER，在每個(gè)下室中吸取50 μL 培養(yǎng)基至96 孔板中，用全功能酶標(biāo)儀測(cè)定培養(yǎng)基中FD4 的發(fā)光度，最后計(jì)算FD4 的濃度。

1.4.5 緊密連接蛋白的分布 將細(xì)胞接種于共聚焦小皿中，每孔加入1 mL 細(xì)胞懸液，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%后，用含50 ng/mL TNF-的培養(yǎng)液刺激細(xì)胞48 h，參照Xiao等的方法制備樣品后放于激光共聚焦顯微鏡下拍照并進(jìn)行熒光定量。

1.4.6 程序性壞死信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA 表達(dá)量 將細(xì)胞接種于12 孔板中，細(xì)胞處理同上，刺激結(jié)束后用RNA 裂解液收取細(xì)胞，用于程序性壞死關(guān)鍵基因mRNA 表達(dá)的測(cè)定。RNA 提取、定量和分析方法參照李佩等。相關(guān)基因的引物序列見表1。

表1 相關(guān)基因的引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以<0.05 為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，0.05<<0.10 為具有顯著性趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TNF-對(duì)IPEC-1 細(xì)胞生長(zhǎng)和損傷的影響 由圖1可知，與對(duì)照組相比，TNF-刺激使IPEC-1 細(xì)胞活力下降（<0.001），細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 活性升高（<0.05），IPEC-1 細(xì)胞數(shù)量減少（<0.05）。

圖1 TNF-α 對(duì)IPEC-1 細(xì)胞活力、LDH 活性和細(xì)胞數(shù)量的影響

2.2 TNF-對(duì)IPEC-1 細(xì)胞上皮屏障功能的影響 由圖2可知，與對(duì)照組相比，TNF-刺激使IPEC-1 細(xì)胞跨上皮電阻降低（<0.05），F(xiàn)D4 通透性增加（<0.05）。

圖2 TNF-α 對(duì)IPEC-1 細(xì)胞TEER 值（a）和FD4 通透性（b）的影響

2.3 TNF-對(duì)IPEC-1 細(xì)胞緊密連接蛋白分布的影響由圖3 可知，對(duì)照組細(xì)胞間的緊密連接蛋白Occludin和ZO-1 均勻地分布于細(xì)胞的邊界，但TNF-處理導(dǎo)致細(xì)胞膜上Occludin 和ZO-1 分布紊亂，表現(xiàn)為緊密連接蛋白的斷裂和邊界模糊變淡。對(duì)Occludin 和ZO-1 的熒光強(qiáng)度定量也同樣表明，與對(duì)照組相比，TNF-刺激使Occludin（<0.001）和ZO-1（<0.05）的表達(dá)量降低。

圖3 TNF-α 刺激IPEC-1 細(xì)胞48 h 對(duì)Occludin（a）和ZO-1（b）蛋白表達(dá)和分布的影響

2.4 TNF-對(duì)IPEC-1 細(xì)胞程序性壞死關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)量的影響 由圖4 可知，與對(duì)照組相比，TNF-刺激增加了和的mRNA 表達(dá)量（<0.05），但對(duì)的mRNA 表達(dá)量無顯著影響。

圖4 TNF-α 對(duì)IPEC-1 細(xì)胞程序性壞死關(guān)鍵基因RIP1（a）、RIP3（b）和MLKL（c）mRNA 表達(dá)的影響

3 討論

腸道在維持機(jī)體健康方面發(fā)揮著重要作用，腸道屏障可以選擇性地吸收對(duì)機(jī)體有利的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、水分和電解質(zhì)等，而將對(duì)機(jī)體有害的病原體等物質(zhì)阻攔在外。大量研究表明，TNF-與包括腸上皮細(xì)胞在內(nèi)的多種類型細(xì)胞的損傷有關(guān)。本研究使用TNF-誘導(dǎo)的IPEC-1 細(xì)胞損傷模型來探索TNF-對(duì)IPEC-1 細(xì)胞程序性壞死的影響。

細(xì)胞活力、細(xì)胞上清液中LDH 活力和細(xì)胞數(shù)量可反映細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況和細(xì)胞損傷程度。LDH 是一種細(xì)胞內(nèi)酶，當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，胞內(nèi)的LDH 會(huì)大量釋放到胞外。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-刺激導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著下降，同時(shí)使細(xì)胞上清中LDH 活力顯著升高，表明TNF-刺激誘導(dǎo)了IPEC-1 細(xì)胞損傷。腸上皮細(xì)胞大量死亡會(huì)導(dǎo)致腸上皮結(jié)構(gòu)和屏障的破壞，而腸上皮屏障的完整性和通透性可以通過TEER 值和FD4 的通透性來反映。當(dāng)腸道受損時(shí)，腸上皮細(xì)胞會(huì)失去其選擇透過性，使一些小分子物質(zhì)能夠輕易穿過上皮層。因此通過測(cè)量下室培養(yǎng)液中FD4 濃度可用來反映TNF-刺激后IPEC-1 細(xì)胞通透性改變的情況。本試驗(yàn)中TNF-刺激使IPEC-1 細(xì)胞跨上皮電阻顯著降低，同時(shí)FD4 通透性顯著增加，表明TNF-可以損害IPEC-1的屏障功能。

腸上皮細(xì)胞間的緊密連接依靠Occludin 和ZO-1 等蛋白間的相互作用來發(fā)揮其屏障功能，因此，緊密連接蛋白的任何改變都會(huì)直接導(dǎo)致屏障功能的損害。據(jù)報(bào)道，TNF-可通過許多信號(hào)通路誘導(dǎo)緊密連接蛋白損失，與Xiao 等、Mankertz 等研究結(jié)果一致的是，本試驗(yàn)中TNF-刺激使Occludin 和ZO-1 蛋白表達(dá)量降低，蛋白分布紊亂，表明TNF-破壞了IPEC-1 細(xì)胞間的緊密連接。

當(dāng)細(xì)胞受到TNF-刺激后，TNF-會(huì)與膜上相應(yīng)的受體TNFR1 結(jié)合，進(jìn)而在胞質(zhì)端募集一系列的蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，在合適的條件下，這些復(fù)合體會(huì)使磷酸化的RIP1、RIP3 和MLKL 進(jìn)一步募集而形成壞死復(fù)合體，進(jìn)而引發(fā)程序性壞死。在程序性壞死信號(hào)通路激活的過程中，RIP1、RIP3 和MLKL 是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)量升高表明它們將大量聚集而促進(jìn)程序性壞死的發(fā)生。有研究證明，通過敲除RIP 激酶基因能阻止程序性壞死的形成或激活。本試驗(yàn)中TNF-刺激增加了和的mRNA 表達(dá)量，表明TNF-刺激誘導(dǎo)了IPEC-1 細(xì)胞程序性壞死信號(hào)的激活。

TNF-與腸道損傷密切相關(guān)，本研究結(jié)果顯示TNF-刺激激活了IPEC-1 細(xì)胞程序性壞死信號(hào)通路中和的表達(dá)，為研究腸道損傷機(jī)制提供了新的方向，為后續(xù)通過營(yíng)養(yǎng)調(diào)控腸道程序性壞死奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，TNF-刺激可導(dǎo)致IPEC-1 細(xì)胞活力下降和細(xì)胞損傷、細(xì)胞間緊密連接破壞以及屏障功能障礙，激活了細(xì)胞程序性壞死信號(hào)通路。