田沛知，田星哲，李 巖，趙曉雅，陳佳欣，史晨迪，嚴(yán) 慧，張英杰，紀(jì)守坤，劉月琴

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071000）

反芻動(dòng)物由于胎盤屏障的存在，使得新生羔羊或犢牛只能通過采食初乳來建立被動(dòng)免疫，從而保護(hù)其免受外來病原菌的侵襲。被動(dòng)免疫轉(zhuǎn)移不完全將導(dǎo)致幼畜哺乳期免疫力下降，是其哺乳期患病和死亡的主要原因。免疫球蛋白G（IgG）是初乳中主要的免疫球蛋白，新生幼畜的被動(dòng)免疫狀態(tài)取決于攝入IgG 的數(shù)量及吸收效率。新生幼畜的腸上皮細(xì)胞能夠通過胞吞作用吸收初乳中IgG，隨著產(chǎn)后時(shí)間的增加，腸上皮細(xì)胞吸收IgG 的能力迅速下降，直至完全喪失，這種現(xiàn)象被稱為“腸關(guān)閉”。由于腸關(guān)閉現(xiàn)象的存在，新生羔羊只能在產(chǎn)后短時(shí)間內(nèi)將完整的IgG 吸收至血液中，因此明確新生羔羊?qū)Τ跞镮gG 吸收效率的動(dòng)態(tài)變化至關(guān)重要。

Michanek 等研究發(fā)現(xiàn)，將初乳首次飼喂時(shí)間分別延遲至1、8、16 h 和24 h，IgG 吸收效率隨首次飼喂時(shí)間的延遲呈下降的趨勢。前人研究也表明，幼畜腸道對(duì)初乳中IgG 的吸收效率在出生后6 h 內(nèi)最高，從出生后6～12 h 逐漸降低，并在24 h 左右停止吸收。這些研究均表明初乳首次飼喂時(shí)間可顯著影響IgG 吸收效率，但目前的研究均是通過延遲初乳首次飼喂時(shí)間進(jìn)行，這種方法至少存在3 個(gè)問題：①延遲初乳飼喂將導(dǎo)致腸關(guān)閉時(shí)間延后，所測定的IgG 吸收效率不能反映動(dòng)物正常狀態(tài)下的吸收情況；②由于新生羔羊或犢牛在延遲飼喂的過程中長時(shí)間未進(jìn)食，機(jī)體本身已經(jīng)處于虛弱狀態(tài)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果存在一定影響；③新生羔羊初乳飼喂時(shí)間無法延遲太久，否則很難保證新生羔羊的存活。測定自然狀態(tài)下隨母哺乳新生羔羊IgG 吸收效率的動(dòng)態(tài)變化尚未見報(bào)道。

Yvon 等研究表明，羔羊?qū)ε３跞楹脱虺跞橹械腎gG 具有相同的吸收效率，表明羔羊腸道吸收牛源IgG和羊源IgG 具有相同的吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)；Montiel 等通過測定牛奶中牛IgG、綿羊IgG 或山羊IgG 來檢測牛奶中的摻假，發(fā)現(xiàn)牛IgG、綿羊IgG 或山羊IgG 具有抗原特異性。因此，本試驗(yàn)通過給自然哺乳狀態(tài)下的新生羔羊飼喂牛初乳，利用牛源和羊源IgG 的抗原特異性，探究隨母哺乳狀態(tài)下新生羔羊的IgG 吸收效率，明確自然狀態(tài)下新生羔羊IgG 吸收效率的動(dòng)態(tài)變化，為后期制定合理的新生羔羊飼養(yǎng)管理措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn) 試驗(yàn)場地及試驗(yàn)動(dòng)物由河北省張家口市蘭海畜牧養(yǎng)殖有限公司提供，試驗(yàn)時(shí)間為2020年10—2020 年11 月。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理 本試驗(yàn)選取初生重（3.53±0.33）kg、母羊胎次為2～3 胎且當(dāng)次產(chǎn)雙羔、健康狀況良好的新生湖羊公羔羊50 只，隨機(jī)分為5 組，每組10只，分別于羔羊出生后2、6、12、24、36 h 飼喂牛初乳100 mL。羔羊出生后及時(shí)清除羔羊口腔及鼻腔內(nèi)的黏液，使其呼吸順暢，用碘伏在臍帶處消毒，使用干毛巾將羔羊身上黏液擦拭干凈后打上耳號(hào)，做好生產(chǎn)記錄（包括產(chǎn)羔時(shí)間、母羊胎次、產(chǎn)羔數(shù)、羔羊初生重等），在產(chǎn)后1 h 內(nèi)引導(dǎo)羔羊接近乳房并輔助其采食母乳，羔羊均隨母哺乳。

使用牛初乳粉配制的牛初乳進(jìn)行飼喂，牛初乳粉購自南京德居生物科技有限公司。牛初乳粉與溫水（40℃）按照1:7 的比例進(jìn)行配制，攪拌均勻至充分溶解，通過食管用100 mL 注射器進(jìn)行飼喂，配制好的牛初乳中免疫球蛋白G（IgG）含量為5.13 mg/mL。

1.3 樣品采集 羔羊于飼喂牛初乳后24 h 時(shí)，頸靜脈采血，使用5 mL 促凝采血管收集血液，在室溫下靜置2 h，待血清析出后，在室溫下用離心機(jī)以3 500 ×g 離心15 min收集血清，置于-20℃保存。

1.4 單向免疫擴(kuò)散測定

1.4.1 試驗(yàn)材料 標(biāo)準(zhǔn)牛IgG 購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)羊IgG 購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗牛IgG 抗體購自北京蘭博利德商貿(mào)有限公司，效價(jià)為1:32～1:64；兔抗羊IgG 抗體購自北京百奧萊博科技有限公司，效價(jià)為1:16。血清樣品室溫解凍后與0.9%氯化鈉溶液按1:50 稀釋，再進(jìn)行測定。

1.4.2 瓊脂凝膠平板制作 首先稱取適量瓊脂糖，加入生理鹽水配制成濃度為1%的瓊脂溶液，將瓊脂溶液置于沸水中加熱融化，融化后立即置于56℃水浴保溫；然后待抗血清冷卻至室溫后根據(jù)效價(jià)量取適量抗血清（如效價(jià)為1:30，則抗血清與瓊脂溶液的比例為1:30），將抗血清置于30℃水浴中，并在10 min 內(nèi)將溫度緩慢升至56℃，再將抗血清與瓊脂溶液充分均勻混合，混合過程中應(yīng)緩慢搖晃，避免產(chǎn)生氣泡影響沉淀環(huán)擴(kuò)散；最后緩慢傾注于水平臺(tái)上的培養(yǎng)皿或載玻片中，制成厚度約為3 mm、瓊脂濃度約為1% 的瓊脂凝膠平板；待瓊脂凝膠平板冷卻后進(jìn)行打孔，孔徑約為5 mm，孔距不得小于10 mm，挑凈孔中瓊脂，保證孔邊緣垂直，無瓊脂殘留及裂痕，隨后用酒精燈融化瓊脂孔邊緣封底。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 標(biāo)準(zhǔn)IgG 用10×磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.2）稀釋成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 6 個(gè)稀釋度，IgG 的檢測范圍為0.1～1.0 mg/mL，濃度梯度的設(shè)置參考前人的研究結(jié)果。每個(gè)稀釋度設(shè)2個(gè)重復(fù)。每孔加入20 μL 標(biāo)準(zhǔn)IgG 稀釋液，水平放置濕盒中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，觀察記錄沉淀環(huán)的大小，直至其不繼續(xù)擴(kuò)散為止，擴(kuò)散時(shí)間約為24～48 h。使用游標(biāo)卡尺測量各濃度沉淀環(huán)直徑，取相同稀釋度沉淀環(huán)直徑的平均值為測量值，以測量值的平方為橫坐標(biāo)，相應(yīng)孔中IgG 含量為縱坐標(biāo)，使用Excel 表格繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 牛源和羊源IgG 抗原特異性鑒定 首先使用兔抗牛IgG 抗血清分別檢測標(biāo)準(zhǔn)牛IgG 和綿羊初乳樣品，觀察瓊脂凝膠平板是否出現(xiàn)沉淀環(huán)，若檢測標(biāo)準(zhǔn)牛IgG 時(shí)出現(xiàn)沉淀環(huán)而檢測綿羊初乳樣品時(shí)無沉淀環(huán)出現(xiàn)則表明兔抗牛IgG 抗血清對(duì)牛源IgG 具有特異性。然后使用兔抗羊IgG 抗血清分別檢測標(biāo)準(zhǔn)羊IgG 和牛初乳樣品，觀察瓊脂凝膠平板是否出現(xiàn)沉淀環(huán)，若檢測標(biāo)準(zhǔn)羊IgG時(shí)出現(xiàn)沉淀環(huán)而檢測牛初乳樣品時(shí)無沉淀環(huán)出現(xiàn)則表明兔抗羊IgG 抗血清對(duì)羊源IgG 具有特異性。最后分別使用兔抗牛IgG 和兔抗羊IgG 來檢測牛羊混合IgG，觀察沉淀環(huán)出現(xiàn)情況，驗(yàn)證兔抗牛和兔抗羊IgG 抗血清能否對(duì)牛源和羊源IgG 抗原進(jìn)行特異性鑒定。

1.4.5 血清樣品的測定 參照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作進(jìn)行制板，每孔加入20 μL 稀釋后的血清樣品，每個(gè)樣品設(shè)2 個(gè)重復(fù)。使用游標(biāo)卡尺測量各樣品沉淀環(huán)直徑，取相同樣品沉淀環(huán)直徑的平均值為測量值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的IgG 含量再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即為樣品IgG 含量。

1.4.6 新生羔羊IgG 吸收效率的計(jì)算 參考Mcgoern的方法進(jìn)行IgG 表觀吸收率的計(jì)算：AEA（%）=（血清牛IgG 含量×體重×7.5%）/（牛初乳IgG 含量×牛初乳飼喂量）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用Excel2007 進(jìn)行初步整理，利用SPSS 22.0 軟件的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過Duncan's 法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛源IgG 和羊源IgG 的抗原特異性 牛IgG 和羊IgG 的特異性檢測結(jié)果見圖1，用兔抗牛IgG 抗體檢測標(biāo)準(zhǔn)牛IgG 時(shí)，瓊脂板中可見清晰的乳白色沉淀環(huán)（圖1-A），用兔抗羊IgG 抗體檢測牛初乳中IgG 時(shí)，瓊脂板中無沉淀環(huán)（圖1-B）；用兔抗牛IgG 抗體檢測羊初乳中IgG 時(shí)，瓊脂板中無沉淀環(huán)出現(xiàn)（圖1-C），用兔抗羊IgG 抗體檢測標(biāo)準(zhǔn)羊IgG 時(shí)，瓊脂板中可見清晰的乳白色沉淀環(huán)（圖1-D）；用兔抗牛IgG 抗體檢測牛羊混合IgG 時(shí)，瓊脂板中可見清晰的乳白色沉淀環(huán)（圖1-E）；用兔抗羊IgG 抗體檢測牛羊混合IgG 時(shí)，瓊脂板中可見清晰的乳白色沉淀環(huán)（圖1-F）。表明羊源IgG 和牛源IgG 具有抗原特異性，也可以用來檢測牛羊混合IgG。

圖1 牛IgG 和羊IgG 的特異性檢測結(jié)果

2.2 牛源IgG 和羊源IgG 含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖2 可知，牛IgG 濃度在0.1～1.0 mg/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99 以上；羊IgG 濃度在0.1～1.0 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.95 以上。

圖2 單向免疫擴(kuò)散標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 隨母哺乳新生羔羊IgG 表觀吸收率 由表1 可見，隨著牛初乳飼喂時(shí)間的延遲，新生羔羊血清中羊IgG 的濃度在各組間的差異不顯著；于2～12 h 飼喂初乳，新生羔羊血清中牛IgG 的濃度和牛IgG 表觀吸收率均逐漸降低（<0.05），羔羊出生后24 h 和36 h 飼喂牛初乳，血清中牛IgG 濃度為0.00 mg/mL，牛IgG 表觀吸收率為0.00%。

表1 隨母哺乳新生羔羊血清中IgG 濃度和IgG 表觀吸收率

2.4 隨母哺乳新生羔羊IgG 吸收效率的動(dòng)態(tài)變化 由圖3 可見，隨著初乳飼喂時(shí)間延遲，IgG 吸收效率呈線性降低（=0.99，<0.05），其時(shí)間依賴方程為AEA=-1.49×T+35.13，其中AEA 為羔羊IgG 吸收效率，T 為飼喂初乳時(shí)間。在出生后馬上飼喂初乳，新生羔羊IgG吸收效率為35%，每延遲飼喂初乳1 h 羔羊?qū)Τ跞橹蠭gG 吸收效率降低1.5 個(gè)百分點(diǎn)，在產(chǎn)后24 h 飼喂初乳時(shí)IgG 吸收效率降至0。

圖3 羔羊IgG 吸收效率的動(dòng)態(tài)變化

3 討論

3.1 牛源IgG 和羊源IgG 的特異性 由Mancini 等開發(fā)的單向免疫擴(kuò)散方法是目前測量初乳或血清中IgG濃度的金標(biāo)準(zhǔn)，該方法利用抗原抗體反應(yīng)形成沉淀線或環(huán)為理論基礎(chǔ)，具有測定簡單、準(zhǔn)確度高、特異性好、成本低的優(yōu)點(diǎn)，在畜牧生產(chǎn)和科研上得到廣泛應(yīng)用。前人研究表明，不同物種的IgG 在基因和蛋白結(jié)構(gòu)上均有差異，因此抗原性也不同：IgG 分子輕鏈的氨基酸序列可決定IgG 結(jié)合抗原的特異性，輕鏈分為kappa（）和lambda（）2 種亞型，不同物種間輕鏈κ 和λ的比值不同，如在人的血清中鏈:鏈為2:1，在小鼠血清中的比例為20:1，在牛血清中的比例為9:1，在豬血清中的比例為1:1。目前人們基于IgG 物種特異性進(jìn)行了大量研究，Montiel 等報(bào)道了一種用于檢測牛、綿羊和山羊的混合乳中來自牛、綿羊和山羊的IgG 的方法；Sonia 等對(duì)豬肉、雞肉和牛肉中的IgG 進(jìn)行特異性檢測，用于肉類的摻假鑒定。本研究也表明牛源IgG 和羊源IgG 具有抗原特異性，使用兔抗牛IgG 抗體和兔抗羊IgG 抗體可分別特異性定量混合樣品中牛源IgG 和羊源IgG。

3.2 新生幼畜對(duì)初乳IgG 吸收效率測定方法 隨著人們對(duì)新生幼畜被動(dòng)免疫重要性認(rèn)識(shí)逐漸提升，關(guān)于新生幼畜對(duì)初乳IgG 吸收效率的研究也隨之增加，但目前為止，前人研究方法均是通過延遲初乳的飼喂時(shí)間來進(jìn)行的。Hernández 等將新生羔羊分為2 組，分別于羔羊出生后2 h 和14 h 首次飼喂初乳，研究延遲飼喂初乳對(duì)羔羊IgG 吸收效率的影響；Arthington 等在新生犢牛的研究中同樣將初乳飼喂時(shí)間延遲至2 h 和12 h。這種研究方法使新生幼畜與母畜長時(shí)間分離且沒有進(jìn)食，難以保證幼畜的健康和試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。Selman的研究結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)，Selman 將新生犢牛分為2 組，分別隨母哺乳和在6、12 h 時(shí)人工飼喂初乳，結(jié)果顯示隨母哺乳犢牛48 h 血清中IgG 含量顯著高于人工哺乳犢牛。本研究中，利用牛源IgG 和羊源IgG 的特異性，成功測定了新生羔羊在隨母哺乳的自然狀態(tài)下對(duì)初乳IgG 的吸收效率，在試驗(yàn)過程中新生羔羊均處于健康狀態(tài)，很大程度上減少了新生羔羊的應(yīng)激，增加了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，為進(jìn)一步探討提高新生羔羊在自然狀態(tài)下對(duì)初乳IgG 吸收效率的方法奠定良好基礎(chǔ)。

3.3 隨母哺乳新生羔羊?qū)Τ跞镮gG 吸收效率的動(dòng)態(tài)變化新生羔羊小腸上皮細(xì)胞具有完整吸收大分子蛋白質(zhì)的能力，在出生后的短暫時(shí)間內(nèi)，小腸的腸上皮細(xì)胞能通過新生兒Fc 受體（FcRn）介導(dǎo)的胞吞作用非選擇性地吸收各種大分子蛋白質(zhì)。隨著產(chǎn)后時(shí)間的延長，F(xiàn)cRn在小腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)逐漸下降，導(dǎo)致小腸細(xì)胞吸收免疫球蛋白的能力迅速下降，到12～18 h 時(shí)完全喪失從而形成腸關(guān)閉。前人研究表明，新生反芻動(dòng)物在初生時(shí)對(duì)IgG 的吸收效率最高，隨著時(shí)間的延長吸收效率顯著下降。Arthington 等研究了IgG 來源對(duì)新生荷斯坦?fàn)倥gG 吸收效率的影響，結(jié)果表明，犢牛在出生后2～12 h 時(shí)的平均吸收效率約為23%；Michanek 等在對(duì)犢牛出生后第1 次飼喂初乳時(shí)間的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)? 次飼喂時(shí)間為出生后1 h 時(shí)，IgG 吸收效率最高，并隨著第1 次飼喂時(shí)間的延長IgG 吸收效率呈下降趨勢，這與Raul 等的報(bào)道基本一致；而Moretti 等在對(duì)新生羔羊的研究中發(fā)現(xiàn)，新生羔羊產(chǎn)后6 h 內(nèi)IgG的吸收效率變化不大，在產(chǎn)后6 h 時(shí)吸收效率最高。前人關(guān)于新生幼畜對(duì)初乳IgG 吸收效率動(dòng)態(tài)變化的研究結(jié)果存在一定差異，這可能與新生幼畜沒有處于隨母哺乳的自然狀態(tài)有關(guān)，同時(shí)目前關(guān)于新生羔羊腸關(guān)閉的時(shí)間及其對(duì)初乳IgG 吸收效率的動(dòng)態(tài)變化情況尚不明確。本研究結(jié)果表明，新生羔羊牛IgG 表觀吸收率隨出生后時(shí)間的延長顯著降低，其時(shí)間依賴方程為：AEA=-1.49×T+35.13（=0.99；<0.05），其中AEA 為羔羊IgG吸收效率，T 為飼喂初乳時(shí)間；同時(shí)羔羊在出生后24 h時(shí)吸收效率降至0，這一研究結(jié)果可為提高新生羔羊培育水平提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié)論

兔抗牛IgG 抗血清、兔抗羊IgG 抗血清可分別用于定量檢測牛羊混合IgG 中的牛源IgG 和羊源IgG。自然狀態(tài)下隨母哺乳新生羔羊在出生時(shí)對(duì)初乳IgG 的吸收效率最高，隨后迅速下降，在出生后24 h 時(shí)停止吸收，IgG 的吸收效率時(shí)間依賴方程為：AEA=-1.49×T+35.13（=0.99；<0.05），其中AEA 為羔羊IgG 吸收效率，T 為飼喂初乳時(shí)間。因此，隨母哺乳新生羔羊盡早飼喂足量的優(yōu)質(zhì)初乳將有利于促進(jìn)IgG 的吸收，保證新生羔羊被動(dòng)免疫的建立。