李軍偉,趙文明，朱家橋，鞠輝明，劉宗平

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009）

使用17℃液態(tài)保存豬精液進(jìn)行人工授精加速了優(yōu)質(zhì)公豬的基因擴(kuò)散和品種改良，便利了優(yōu)秀種質(zhì)基因跨地區(qū)交流，也促進(jìn)了疾病控制和優(yōu)質(zhì)精液的高效利用。隨著快遞物流的發(fā)展，從商業(yè)化公豬站向全國發(fā)送精液樣品一般不超過2d 即可到達(dá)。而為了充分利用優(yōu)質(zhì)精液，保存3～5 d 的精液也會用于人工授精。精液稀釋液一般能夠?yàn)榫犹峁┠芰?、適宜的pH 和滲透壓環(huán)境，抑制細(xì)菌增殖。然而，在液態(tài)保存過程中豬精子的質(zhì)量和功能持續(xù)下降，保存過程中過量活性氧（ROS）累積引起的氧化應(yīng)激可能是造成精子損傷的重要原因。豬精子膜中膽固醇/磷脂的比例較低，使得豬精子對氧化應(yīng)激更為敏感。氧化應(yīng)激主要通過引起脂質(zhì)過氧化，誘導(dǎo)DNA 氧化損傷以及生成蛋白加合物等造成精子損傷。很多研究致力于向稀釋液中添加一些抗氧化物質(zhì)以減少精子氧化應(yīng)激。然而，目前液態(tài)保存過程中氧化應(yīng)激的來源及發(fā)揮作用的機(jī)制仍不明確。已有證據(jù)顯示，在精液冷凍前和冷凍過程中，高比例死精子的存在會引起細(xì)胞內(nèi)ROS 顯著升高以及DNA 損傷，而精漿中的抗氧化物可能在對抗保存過程中的氧化應(yīng)激中發(fā)揮積極作用。因此，本研究擬從死精子與活精子相互作用的角度來探究17℃保存過程中豬精液質(zhì)量隨保存時(shí)間持續(xù)下降的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 豬精液樣品的獲得和處理 實(shí)驗(yàn)使用的48 份精液和精漿樣品來自9 頭成熟、健康和繁殖性能好的公豬，公豬購買自河南精旺種豬有限公司。采集的豬精液使用BTS 等體積稀釋后，在17℃密閉泡沫盒中經(jīng)24～30 h運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。精子質(zhì)膜完整性>85%、活率>70%且畸形率<15%的精液樣品用于本實(shí)驗(yàn)。

精漿（Seminal Plasma，SP）樣品制備：將精液樣品離心兩次（17℃，2 400×g，3 min），取上清（為精漿和稀釋液混合物），在顯微鏡下觀察，確認(rèn)無精子存在后，于-80℃冰箱保存。

豬精液樣品的處理：將豬精液樣品分為3 份進(jìn)行處理。將其中的1 份（50 mL）直接浸入液氮中冷凍，然后在37℃水浴中解凍，反復(fù)3 次后離心（2 400 ×g，3 min）取上清為稀釋液A；將另1 份（50 mL）離心（2 400×g，3 min）棄掉上清后，使用等體積的ddHO重懸精子，隨后再次離心（2 400×g，3 min）取上清為稀釋液B。使用流式細(xì)胞儀檢測確認(rèn)A 和B 2 種方法處理后精子質(zhì)膜全部破裂。將第3 份精液樣品（50 mL）等分為10 份，離心（2400×g，3 min）后棄掉上清，分別使用不同體積比例的BTS :精子（4:1），稀釋液A :精子（1:1、4:1 和19:1），稀釋液B :精子（1:1、4:1和19:1）和SP :精子（1:1 和4:1）重懸精子（Spermatozoa，SPZ）。最終得到5 倍稀釋的精液樣品BTS+SPZ，2倍、5 倍和20 倍稀釋的精液樣品A+SPZ，2 倍、5 倍和20 倍稀釋的精液樣品B+SPZ 及2 倍和5 倍稀釋的精液樣品SP+SPZ，原精液樣品和BTS 及SP 稀釋的精液樣品作為對照。將所有精液樣品于17℃恒溫冰箱中保存3 d，在0、1、2 和3 d 時(shí)間點(diǎn)檢測精子質(zhì)量和功能，同時(shí)保存懸浮液樣品檢測總氧化物水平（Total Oxidant Status，TOS）和總抗氧化物水平（Total Antioxidant Capacity，TAC）。

1.2 主要試劑和設(shè)備 所使用的精液稀釋液為BTS（實(shí)驗(yàn)室配制）。精子質(zhì)量與功能檢測涉及的染料中，Hoechst 33342（H42）和異硫氰酸熒光素共軛花生凝集素（FITC-PNA）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，碘化丙啶（PI）、CM-H2DCFDA、BODIPY 581/591 C11（BODIPY）和Annexin-V-FITC 購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

主要儀器設(shè)備有：CASA（ISASV1；Proiser R+D，Paterna，Spain）、SQS（V1.0，ZOITECHLAB，S.L.Spain）、流式細(xì)胞儀（CytoFLEX S，Beckman Coulter Inc，Brea，CA，USA）、精液專用冰箱（BC 70，世博(青島)畜牧設(shè)備有限公司）、超低溫冰箱（Ultra-Low Freezer，Haier，China）、自動生化分析儀（AU480，Beckman Coulter Inc，Brea，CA，USA）。

1.3 精子活率和活力的檢測 利用精子質(zhì)量分析系統(tǒng)CASA 檢測精子活率和活力：將精液樣品于38℃預(yù)熱3～5 min，吸取5 μL 精液樣品加到Markler 精子計(jì)數(shù)板上，隨機(jī)抓取4～5 個(gè)清晰視野（300～400 個(gè)精子）。手動修正系統(tǒng)錯(cuò)誤標(biāo)記的精子，記錄結(jié)果。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測精子質(zhì)膜完整性、細(xì)胞內(nèi)ROS 水平、膜脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞凋亡 精子質(zhì)膜完整性的具體檢測方法：將100 μL 精液樣品（25×10/mL）加入到含有3 μL H42（0.05 mg/mL），2 μL PI（0.5 mg/mL）和2 μL PNA-FITC（200 μg/mL）的流式管中，將樣品混勻并置于37℃避光孵育10 min。結(jié)果以H42 陽性、PI和PNA-FITC 陰性的活精子比例表示質(zhì)膜完整性。

細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生通過測定細(xì)胞內(nèi)HO含量來評估，具體檢測方法：將50 μL 精液樣品（25 × 10/mL）加入到含有950 μL PBS，1.25 μL H42（0.05 mg/mL），1 μL PI（0.5 mg/mL）和1 μL CM-H2DCFDA（稀釋在DMSO 中，1 mmol/L）的流式管中。在流式細(xì)胞儀分析之前，將所有樣品置于37℃避光孵育30 min。結(jié)果表示為ROS 陽性的活細(xì)胞比例（H42 陽性，PI 陰性和DCF 陽性）。

利用 BODIPY581/591 C11 檢測精子細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，具體操作步驟參考Koppers 等并稍作改 動。將1 mL 精液樣 品（20×10/mL）和 2.5 μL BODIPY581/591 C11（等體積稀釋于乙醇）在37℃下共孵育30 min。之后，利用離心（300×g，7 min）的方法洗滌1 次精液樣品。棄掉上清液，將精子稀釋于1 mL 的PBS 中。隨后，將100 μL 精液樣品和1.3 μL PI（0.5 mg/mL）及2 μL H42（0.05 mg/mL）于37 ℃下共孵育10 min。H42 陽性、PI 陰性且BODIPY 陽性的精子細(xì)胞群被記錄為膜脂質(zhì)過氧化的活精子。

利用Annexin-V 檢測精子凋亡水平：向45 μL的精液（20×106/mL）中加入180 μL Annexin-V 緩沖液，5 μL H42（0.05 mg/mL），1 μL PI（0.5 mg/mL）以及3 μL Annexin V-FITC。室溫下孵育15 min 后，檢測前向流式管中加入200 μL Annexin-V 緩沖液。PI 陰性且Annexin V-FITC 陽性的精子細(xì)胞群被記錄為有早期凋亡變化的活精子。

1.5 精液中TOS 和TAC 水平檢測 將精液樣品離心后取上清，使用自動生化分析儀檢測精液TAC 和TOS 水平，TAC 檢測方法參考Erel，結(jié)果以Trolox（mmol/L）當(dāng)量抗氧化能力來表示，即mmol Trolox/L。TOS 檢測方法參考，結(jié)果以μmoL HO/L 表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 使用IBM SPSS 分析軟件（Version 19,IBM SPSS）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用一般線性模型分析不同精子懸浮液，稀釋倍數(shù)和保存時(shí)間之間的相互作用。Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布。使用One-Way ANOVA 或非參 數(shù)Kruskal-Wallis one-way ANOVA 進(jìn)行組間差異分析。使用Pearson 相關(guān)性分析探索懸浮液中氧化和抗氧化水平對精液保存效果的影響。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示?；盥?，活力和質(zhì)膜完整性標(biāo)準(zhǔn)化公式：標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值=檢測值/樣品起始值×100%。

2 結(jié)果

2.1 保存時(shí)間對不同處理的豬精子質(zhì)量和功能的影響保存時(shí)間和稀釋液及稀釋倍數(shù)之間沒有交互作用。如表1 所示，17℃液態(tài)保存3d 的過程中，與0 d 相比，隨著保存時(shí)間的延長，精子活率和活力急劇下降（<0.01），質(zhì)膜完整性下降（<0.05）。而精子細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，脂質(zhì)過氧化水平和細(xì)胞凋亡水平，以及稀釋液中氧化物和抗氧化物水平均沒有顯著變化。

表1 17℃液態(tài)保存保存時(shí)間對豬精子質(zhì)量和功能的影響

2.2 不同稀釋液和稀釋倍數(shù)對液態(tài)保存的豬精子質(zhì)量和功能的影響 不同稀釋液與稀釋倍數(shù)在精子活率、質(zhì)膜完整性、膜脂質(zhì)過氧化水平、早期凋亡的活精子比例以及稀釋液中TOS 水平上沒有交互影響。如表2 所示，不同方法獲得的稀釋液與豬精子混合后保存于17℃對精子的質(zhì)量和功能產(chǎn)生了顯著影響。與BTS+SPZ 組相比，稀釋液A/B/SP+SPZ 處理降低了精子活率（>0.05）。SP+SPZ 處理組的精子質(zhì)膜完整性較其他處理組降低（<0.05）。A+SPZ 組的精子脂質(zhì)過氧化水平比BTS+SPZ 和B+SPZ 組降低（<0.05），SP+SPZ 處理發(fā)生凋亡的精子比例和精液TOS 水平低于其他處理組（>0.05）。如表3 所示，以不同倍數(shù)稀釋精子，5 倍稀釋組的精子細(xì)胞內(nèi)ROS 水平（<0.05）和脂質(zhì)過氧化水平（<0.05），以及發(fā)生凋亡的精子比例和精液TOS 水平低于（>0.05）其他處理組。

表2 不同稀釋液處理對17℃液態(tài)保存的豬精子質(zhì)量和功能的影響

表3 不同稀釋倍數(shù)對17℃液態(tài)保存的豬精子質(zhì)量和功能的影響

結(jié)果顯示，不同處理與稀釋倍數(shù)在精子活力，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平和精液TAC 水平上存在交互影響。如表4 所示，5 倍稀釋精子，B+SPZ 處理組精子活力低于BTS+SPZ 組（<0.05），A+SPZ 組ROS 陽性的活精子比例低于B+SPZ 組（<0.05），A+SPZ 組精液TAC 水平高于B+SPZ 組（<0.05）。2 倍稀釋精子，B+SPZ 組精液TAC 水平低 于A+SPZ 和SP+SPZ 組（<0.05）。20 倍稀釋精子，A+SPZ 組精液TAC 水平低于B+SPZ 組（<0.05）。BTS+SPZ 處理，與原精液相比，5 倍稀釋細(xì)胞內(nèi)ROS 水平更高（<0.05），精液中TAC 水平更低（<0.05）。A+SPZ 處理，20 倍稀釋組ROS 陽性的活細(xì)胞比例高于其他組（<0.05），精液TAC 水平低于其他組（<0.05）。B+SPZ 處理，5 倍稀釋組的精子活力低于其他組（<0.05），5 倍稀釋組和2 倍稀釋組精液TAC 水平?jīng)]有顯著差異，但二者均顯著低于20 倍稀釋組。SP+SPZ 處理，2 倍稀釋組精液中TAC 水平高于5 倍稀釋（<0.05）。

表4 不同稀釋倍數(shù)和處理方法對17℃液態(tài)保存的豬精子活力、細(xì)胞內(nèi)ROS 和精液TAC 水平的影響

2.4 精液TOS 和TAC 水平對精子液態(tài)保存效果的影響Pearson 相關(guān)性分析表明,精液TAC 水平與精子質(zhì)膜完整性（R=0.147，<0.05）和細(xì)胞凋亡（R=-0.183，<0.05）顯著相關(guān)。TOS 水平和TAC 水平顯著相關(guān)（R=0.171，<0.05）。TAC 水平還和不同處理呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（R=-0.292，<0.01）。

3 討論

17℃液態(tài)保存過程中豬精子質(zhì)量和功能會持續(xù)下降，進(jìn)而顯著降低豬精子的受精能力，影響人工授精效果。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是造成這一結(jié)果的重要原因。要克服氧化應(yīng)激造成的損傷，首先要明確ROS 的來源及發(fā)揮作用的方式。本試驗(yàn)表明，17℃液態(tài)保存的精子在死亡過程中所釋放出來的物質(zhì)對活精子產(chǎn)生了不利的影響。死精子可能通過引起活精子細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高或脂質(zhì)過氧化造成活精子質(zhì)量和功能的損傷，而精液中的TAC 能在在一定程度上對抗死精子造成的損傷。

3.1 保存時(shí)間對不同處理的豬精子質(zhì)量和功能的影響本試驗(yàn)中，反復(fù)凍融和低滲處理獲得的死精子釋放物（A和B）和對照組（SP 和BTS）均造成豬精液中活精子運(yùn)動參數(shù)和質(zhì)膜完整性的損傷，且隨保存時(shí)間的變化趨勢一致。豬精液17℃液態(tài)保存過程中精子質(zhì)量和功能持續(xù)下降的現(xiàn)象已有報(bào)道，試驗(yàn)中使用兩種方法獲得的死精子釋放物保存精子觀察到了類似效應(yīng)。精子運(yùn)動參數(shù)和質(zhì)膜完整性與人工授精后的分娩率和窩產(chǎn)仔數(shù)等密切相關(guān)，因此探明液態(tài)保存中豬精子質(zhì)量下降的原因?qū)τ谔岣哓i繁殖效果非常有意義。氧化應(yīng)激是造成液態(tài)保存豬精子質(zhì)量損傷的重要因素，因此推測死精子釋放物可能通過影響精液中的氧化應(yīng)激水平造成活精子質(zhì)量和功能的損傷。

3.2 不同稀釋液和稀釋倍數(shù)對液態(tài)保存的豬精子質(zhì)量和功能的影響 本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，死精子釋放物A 和B對豬精子運(yùn)動參數(shù)的影響與BTS 及SP 沒有明顯差異，但對質(zhì)膜的損傷比SP 更小。液態(tài)保存中大量精漿的存在往往造成精子質(zhì)量的損傷，這可能是精漿中某些蛋白成分與精子膜的結(jié)合或分離改變了膜的穩(wěn)定性。死精子釋放物A 比B 引起的精子膜脂質(zhì)過氧化水平更低，原因可能是使用死精子釋放物A 重懸精子后精液中的TAC 水平比B 更高。死精子釋放物的添加比例對精液保存效果產(chǎn)生顯著影響。5 倍稀釋精子精液中活精子膜脂質(zhì)過氧化水平更低，這可能與活精子細(xì)胞內(nèi)更低水平的ROS 和更高水平的TAC 有關(guān)。使用死精子釋放物B 稀釋精子，5 倍稀釋比2 倍和20 倍造成的精子活力損傷更大，這可能與5 倍稀釋后精液中TAC 水平更低有關(guān)。使用死精子釋放物A 對精子進(jìn)行5 倍稀釋比2倍和20 倍引起的活精子細(xì)胞內(nèi)ROS 水平更低，而TAC水平更高，精液中的TAC 可能降低了細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。5 倍稀釋精子時(shí)，死精子釋放物A 比B 引起的活精子細(xì)胞內(nèi)ROS 水平更低，精液中TAC 水平更高。有研究表明，精子凍亡后的釋放物比死精子本身對活精子質(zhì)量的損傷似乎更大，死精子主要通過升高細(xì)胞內(nèi)ROS 水平和脂質(zhì)過氧化水平造成液態(tài)和冷凍保存的豬精液質(zhì)量下降，這與本研究觀察到的現(xiàn)象一致?？偟膩砜?，死精子釋放物A 比B 對液態(tài)保存的豬精子質(zhì)量和功能的損傷更小，精液中的TAC 可能是關(guān)鍵因素。

3.3 精液TOS 和TAC 水平對豬精子液態(tài)保存的影響本試驗(yàn)相關(guān)性分析結(jié)果表明，精液TAC 水平與精子質(zhì)膜完整性的維持和精子凋亡的抑制相關(guān)，精液中TAC與TOS 水平可能存在著一種平衡，不同精子處理方式會影響這種平衡的維持。引起豬精子氧化應(yīng)激的ROS主要是HO，這是一種膜通透性過氧化物。線粒體和精子細(xì)胞膜是ROS 產(chǎn)生的主要部位，反復(fù)凍融或低滲處理致死精子的過程中會產(chǎn)生大量ROS，精液中存在的死精子或受損精子很可能是ROS 的重要來源。本試驗(yàn)結(jié)果提示，死精子造成活精子損傷的方式可能是通過引起活精子細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化或細(xì)胞內(nèi)ROS 的過量累積，并降低精子環(huán)境中TAC 的水平。死精子釋放物的添加比例也影響死精子釋放物的作用效果，適宜的稀釋倍數(shù)對液態(tài)保存效果非常重要。比較低滲和反復(fù)凍融2 種處理發(fā)現(xiàn)，二者對液態(tài)保存效果的影響主要體現(xiàn)在稀釋液TAC 水平上。由于精子本身所含有的抗氧化物水平及其有限，精子所在環(huán)境的抗氧化物水平可能是對抗氧化應(yīng)激的主要因素，有報(bào)道稱向精液中添加抗氧化物能夠幫助精子在保存過程中維持自身質(zhì)量和功能。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示，死精子釋放物不利于豬精液的17℃液態(tài)保存，死精子釋放物的來源（精子損傷的方式：低滲或反復(fù)凍融）及稀釋倍數(shù)對液態(tài)保存的豬精子質(zhì)量和功能產(chǎn)生不同的影響。精液中的死精子可能通過引起活精子氧化應(yīng)激造成17℃液態(tài)保存中豬精子質(zhì)量和功能的持續(xù)下降，精液中的抗氧化物在對抗死精子引起的損傷中起到積極的作用。