邵焱焱，楊 恒，牟 健，朱夢婷,3，南 穎，趙宗勝*

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；2.西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460；3.省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆石河子 832000）

黃體是一種能夠分泌孕酮且在雌性動物體內(nèi)形成的臨時性器官。母體正常繁殖周期內(nèi)，如果卵子受精，黃體將分泌P等激素來參與調(diào)節(jié)受精卵宮內(nèi)著床和妊娠的早期維持。如果卵子未受精或在妊娠末期（或分娩后），黃體將會正常退化開啟新一輪生殖周期。因此，黃體的維持與退化對雌性動物的性周期連續(xù)性至關(guān)重要。

microRNA（miRNA）是一種小型非編碼的內(nèi)源性RNAs，其長度片段大小一般為18～24 個核苷酸，廣泛參與血管生成、纖維化修復(fù)、細(xì)胞凋亡、子宮粘連及炎癥反應(yīng)等生理過程。其中，miR-665 被認(rèn)為是miRNA 大家族中不可或缺的成員。目前，關(guān)于miR-665 的相關(guān)報道較少，主要是集中在一些疾病方面，如miR-665 可以通過靶向免疫球蛋白樣受體抑制脊髓損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，同時，miR-665 可以調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡和黏附和抑制膀胱癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的增殖。目前有關(guān)miR-665 在母畜黃體細(xì)胞中的表達及其具體作用未見報道。因此，本實驗通過miR-665 模擬物和陰性對照物轉(zhuǎn)染綿羊黃體細(xì)胞，檢測類固醇急性應(yīng)激調(diào)節(jié)蛋白（）、3-羥基類固醇脫氫酶（）的mRNA、蛋白表達水平及P分泌水平變化，分析miR-665 可能對綿羊黃體細(xì)胞內(nèi)分泌功能的調(diào)控影響，為進一步闡明miRNAs 在母畜黃體維持與退化中的作用及其相關(guān)分子調(diào)控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 黃體來自新疆石河子屠宰場成年健康的哈薩克母羊；20×PBS 購自生化Sangon Biotench 公司；細(xì)胞培養(yǎng)液、胰蛋白酶、雙抗購自北京博奧托大科技有限公司；SiCHECKTM-2 Vector 購自Promega 公司；突觸素（SYP）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；miR-665 模擬物、miR-665 陰性對照購自廣州銳博生物科技有限公司；Gene TranIII 轉(zhuǎn)染試劑購自BioMIGA，ELISA（P）試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司；提取RNA 到熒光定量的染料的所有試劑均購自天根生化科技（北京）有限公司和康為世紀(jì)生物科技公司；兔源多克隆抗體羊抗兔IgG 二抗、SDS-PAGE、PVDF 膜、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒等購自索萊寶生物科技有限公司和美國Millipore 公司。

1.2 黃體細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定 取自哈薩克母羊的中期黃體組織，去除脂肪和結(jié)締組織。將組織切成1 mm塊，切碎的黃體組織使用膠原酶II 在37℃下消化1 h。然后將1 000 r/min 離心5 min 得到的細(xì)胞接種在培養(yǎng)基中，并在常溫并含有少量CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3～4代后獲得純化的母羊黃體細(xì)胞，使用突觸素（SYP）免疫細(xì)胞化學(xué)染色用于鑒定母羊黃體細(xì)胞。

1.3 miRNA-665 轉(zhuǎn)染黃體細(xì)胞 待傳代黃體細(xì)胞長滿80%～90%接種到6 孔板中，當(dāng)黃體細(xì)胞密度長滿85%左右，觀察細(xì)胞形態(tài)良好的情況下，使用PBS 清洗干凈，饑餓2 h 后進行分組轉(zhuǎn)染，即空白對照組（未添加任何試劑）、miR-665 模擬物組（轉(zhuǎn)染miR-665 模擬物）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照物），每組3 個重復(fù)。

1.4 qRT-PCR 測定 參照總RNA 提取試劑盒說明書提取轉(zhuǎn)染48 h 后綿羊黃體細(xì)胞中總RNA，通過Nanodrop 2000 儀器測定RNA 的純度和濃度。將RNA 反轉(zhuǎn)錄并測定cDNA 的純度及濃度，合格后保存于-20℃。qRTPCR 檢測3 個引物（表1），其中miR-665 引物（5'-3'）為ACCAGTAGGCCGAGGCC，由Sangon Biotech公司合成。qRT-PCR 檢測（反應(yīng)體系為20 μL）：染料10 μL，上引物1 μL，下引物1 μL，DNA 2 μL，無酶水6 μL。PCR 擴增程序為：預(yù)變形 95℃ 30 s；55 個循環(huán)，95℃ 5 s，56℃ 30～34 s。

表1 引物序列信息

1.5、蛋白鑒定 收集每組轉(zhuǎn)染48 h 的黃體細(xì)胞，并使用RIPA 強細(xì)胞裂解液分層提取總蛋白。使用BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，然后一定量的蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE 操作，并在1.5 h 后放置PVDF膜上。接著加入配置好的脫脂牛奶常溫下避光30 min，將膜與一抗在低溫下避光孵育12 h。將膜清洗幾次后，加入IgG 常溫孵育2 h。使用ECL 化學(xué)發(fā)光觀察蛋白質(zhì)不同條帶，并使用Quantity One 軟件量化條帶強度。

1.6 黃體細(xì)胞液收集及P水平測定 細(xì)胞培養(yǎng)板轉(zhuǎn)染綿羊黃體細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后采集1 次細(xì)胞培養(yǎng)液，做好標(biāo)記保存于-20℃?zhèn)溆?。利用酶?lián)免疫測定（ELISA）試劑盒檢測血清中的P濃度，分析不同試驗組中P分泌差異水平。

1.7 統(tǒng)計分析 實時熒光定量數(shù)據(jù)以2法處理；使用SPSS Statistics 20.0 軟件ANOVA 分析比較基因、蛋白表達量差異，<0.01 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃體細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 通過選取顏色呈肉紅色，直徑大于0.5 cm 的卵巢（黃體）作為處理對象（圖1-A）；膠原酶II 消化分離的黃體細(xì)胞呈單一分散狀態(tài)，胞體呈透明、圓形或多邊形細(xì)胞，體積較?。▓D1-B）；培養(yǎng)24 h 后，黃體細(xì)胞開始貼壁，呈不規(guī)則形狀，分散比較均勻，逐漸開始相連（圖1-C）；培養(yǎng)48 h 后，細(xì)胞進入對數(shù)生長期，細(xì)胞完全貼壁，呈梭形或不規(guī)則形狀（圖1-D）。其中，綿羊黃體組織屬于彌散性神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，SYP 是一種較為全面的神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物；利用免疫組化法鑒定黃體細(xì)胞SYP 陽性率達90%以上（圖1-E,F），表明用于本實驗分離培養(yǎng)的細(xì)胞為綿羊黃體細(xì)胞。

圖1 篩選的黃體組織和分離培養(yǎng)后不同時間段的黃體細(xì)胞

2.2 miR-665 在轉(zhuǎn)染前后黃體細(xì)胞中的表達分析 如圖2 所示，與空白對照組和陰性對照組相比，miR-665 模擬物組中黃體細(xì)胞的miR-665 表達量極顯著升高，說明轉(zhuǎn)染miR-665 模擬物后可顯著增加黃體細(xì)胞中miR-665 的表達水平。

圖2 不同組別中黃體細(xì)胞miR-665 的表達水平

2.3 過表達miR-665 對、表達的影響 如圖2 顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，miR-665模擬物組中黃體細(xì)胞的、mRNA 表達水平極顯著增加；同時，關(guān)鍵合成基因、的蛋白表達水平也極顯著增加。

圖3 孕酮關(guān)鍵合成酶StAR、3β-HSD mRNA（A）和蛋白表達量（B 和C）

2.4 過表達miR-665 對綿羊黃體細(xì)胞P分泌水平的影響如圖4 顯示，與空白對照組相比，miR-665 模擬物組中黃體細(xì)胞內(nèi)分泌P分泌水平極顯著增加，而陰性對照組的黃體細(xì)胞中的P分泌水平?jīng)]有明顯變化，說明在綿羊黃體細(xì)胞中上調(diào)miR-665 表達能夠促進黃體細(xì)胞分泌P，可能參與其黃體細(xì)胞的內(nèi)分泌功能調(diào)控。

圖4 不同轉(zhuǎn)染組別中綿羊黃體細(xì)胞孕酮激素分泌水平

3 討論

3.1 綿羊黃體細(xì)胞鑒定 黃體的主要生理功能是合成分泌類固醇激素P，以調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的變化來適應(yīng)受精卵著床和妊娠的維持。其中，在哺乳動物黃體合成和分泌P過程中涉及3 個重要因素，即將膽固醇運輸至線粒體上，然后油膽固醇側(cè)鏈裂解酶促進膽固醇分解成孕烯醇酮，最終促進孕烯醇酮轉(zhuǎn)換為P。張家驊報道，抑制劑可以降低血清中的P濃度，且抑制劑在細(xì)胞中呈陽性表達，使細(xì)胞分泌類固醇激素，顯示可以作為黃體細(xì)胞區(qū)分內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定方法。同時，蘆習(xí)研究證實在mRNA 水平上也可作為黃體細(xì)胞鑒定的方法。然而，廣泛分布于甾體激素生成組織（如卵母細(xì)胞和子宮），在其區(qū)別鑒定黃體細(xì)胞方面仍存在一定局限、缺乏說服力。近期，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)黃體屬于彌散性神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，并具有4 種神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物，即神經(jīng)特異性烯醇化酶（NSE）、突觸素（SYP）、五羥色胺（5-HT）和S100B 蛋白（S100B）。其中，SYP 廣泛存在于周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的所有內(nèi)分泌細(xì)胞中，但SYP 不在神經(jīng)膠質(zhì)和白質(zhì)細(xì)胞中出現(xiàn)；SYP 的合成分泌可以用來區(qū)分黃體細(xì)胞與其他細(xì)胞，是一種較為全面的神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物，相比NSE、5-HT 和S100 更具有特異性。因此，本試驗通過免疫組化檢測黃體組織培養(yǎng)的細(xì)胞SYP 陽性表達情況，證實了分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞為綿羊黃體細(xì)胞，為后續(xù)研究提供了保障。

3.2 miR-665 對綿羊黃體細(xì)胞內(nèi)分泌關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因及其功能的影響 黃體作為母畜生殖活動調(diào)控的重要組織，涉及一系列細(xì)胞信號級聯(lián)事件。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)，在黃體組織中存在大量的miRNAs，而且這些miRNAs參與黃體組織的形成、維持和退化過程，并在其中發(fā)揮著重要作用。例如，miR-21 表達升高有利于卵泡存活，并影響卵泡的黃體化過程；類似地，miR-96 表達增加能夠促進黃體細(xì)胞的存活和P生成。然而，黃體組織中表達的miR-665 相關(guān)的研究未見報道。本研究首次采用了miR-665 模擬物進行黃體細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃體細(xì)胞的內(nèi)源性miR-665 顯著增加；同時，miR-665 模擬物組中P含量處于較高水平，提示miR-665 過表達后能夠明顯增強黃體細(xì)胞的內(nèi)分泌功能、促進P的合成與分泌。目前，愈來愈多的研究證實miRNA 作為內(nèi)源性的非編碼RNA，它對細(xì)胞生理學(xué)產(chǎn)生著廣泛影響，幾乎涉及所有的細(xì)胞調(diào)控過程。和被證實是孕酮生成的關(guān)鍵合成酶基因，本研究分別檢測了和的表達水平，結(jié)果顯示miR-665 在黃體細(xì)胞中過表達后，其內(nèi)和的mRNA 和蛋白表達水平均呈顯著增加，這進一步論證了miR-665 確實參與了黃體細(xì)胞內(nèi)P的合成與分泌過程，并在此過程中能夠通過上調(diào)和mRNA 和蛋白表達以增強黃體的內(nèi)分泌功能。因此，基于以上結(jié)果和分析，推斷miR-665在綿羊黃體維持與退化過程中的作用很可能主要是促進黃體細(xì)胞功能的穩(wěn)定和維持黃體組織結(jié)構(gòu)的完整。

4 結(jié)論

本研究通過在黃體細(xì)胞中過表達miR-665 后，發(fā)現(xiàn)miR-665 能夠極顯著促進黃體細(xì)胞中P合成與分泌，即通過上調(diào)孕酮關(guān)鍵合成酶和的表達，以促進黃體細(xì)胞功能的穩(wěn)定，這為進一步完善哺乳動物黃體組織的維持與退化調(diào)控分子機制提供了新的理論依據(jù)，為深入探討黃體組織的過早溶解或衰退奠定了堅實基礎(chǔ)。