施金虎，孟憲娟，盧立志，許文武，杜喜忠

（1.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧獸醫(yī)與水產(chǎn)研究所，浙江金華 321017；2.浙江省畜牧技術(shù)推廣與種畜禽監(jiān)測(cè)總站，浙江杭州 317599；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310022）

睪丸是公番鴨生殖系統(tǒng)中重要的生殖器官，具有兩大生理功能：一是通過(guò)精子發(fā)生產(chǎn)生精子；二是通過(guò)類固醇發(fā)生產(chǎn)生睪酮。精子發(fā)生是一個(gè)依賴于多種因素的復(fù)雜的細(xì)胞分裂過(guò)程，在睪丸的曲細(xì)精管中產(chǎn)生。雄性動(dòng)物精子的形成受下丘腦-垂體-睪丸軸的調(diào)節(jié)，下丘腦分泌促性腺激素釋放激素（Gonadotropin Releasing Hormone,GnRH），引發(fā)垂體釋放促黃體生成素，促黃體素生成素能夠刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞增生，誘發(fā)睪丸分泌睪酮，影響雄性生殖器官的發(fā)育、刺激生精上皮的發(fā)育和精子發(fā)生，調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌。精子形成的這個(gè)過(guò)程也同樣受到很多基因的調(diào)控，基因家族由23 個(gè)成員組成，其在調(diào)節(jié)包括睪丸在內(nèi)的幾個(gè)生殖器官的生長(zhǎng)和發(fā)育方面發(fā)揮重要作用。是家族的轉(zhuǎn)錄因子之一，已被證明是對(duì)哺乳動(dòng)物的繁殖具有重要作用的基因。Yu 等發(fā)現(xiàn)在雞的睪丸支持細(xì)胞中定位，與在哺乳動(dòng)物中的定位一致，并且發(fā)現(xiàn)是表達(dá)上游支持細(xì)胞的重要標(biāo)記物，是雞胚胎睪丸分化發(fā)育和正常睪丸功能的潛在調(diào)節(jié)因子。Bai 等分別選取了24 只性腺分化前的莆田番鴨和性腺分化后的莆田番鴨進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)有等9 個(gè)基因與睪丸的分化和發(fā)育有關(guān)，并且在性腺分化后，等基因在公鴨中特異性高表達(dá)。

淫羊藿是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥藥材，含有淫羊藿苷、淫羊藿次苷、黃酮、等多種微量元素，對(duì)生殖系統(tǒng)、性激素、性器官以及精液都具有保護(hù)作用。張長(zhǎng)城等通過(guò)建立生精障礙的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在淫羊藿總黃酮的作用下，其睪丸質(zhì)量、附睪質(zhì)量、精子活力和精子密度均得到顯著性提高，睪丸管腔內(nèi)的精子數(shù)量增多，同時(shí)使生殖細(xì)胞形態(tài)得到了改善。韓貴芳等發(fā)現(xiàn)淫羊藿總黃酮使自然衰老大鼠的睪丸組織形態(tài)得到改善，生精細(xì)胞數(shù)量明顯增多，推測(cè)淫羊藿總黃酮可能通過(guò)促進(jìn)AMPK 磷酸化減輕其炎癥反應(yīng)。睪丸生殖功能的減退與支持細(xì)胞的功能衰退有著重要聯(lián)系。

本研究通過(guò)在番鴨飼料中添加1%淫羊藿，首先研究其對(duì)公番鴨睪丸發(fā)育組織形態(tài)的影響以及調(diào)節(jié)體內(nèi)激素分泌的影響，其次利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）挖掘?qū)嶒?yàn)組和對(duì)照組中番鴨睪丸的差異表達(dá)基因與相關(guān)通路，研究結(jié)果為淫羊藿對(duì)番鴨睪丸發(fā)育的影響以及調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與RNA 提取 本實(shí)驗(yàn)將60 只49 周齡公番鴨隨機(jī)分為2 組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為10 只。其中A 組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧，B 為實(shí)驗(yàn)組，飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上添加1%的淫羊藿，基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼喂75 d 結(jié)束后，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選5 只種公鴨進(jìn)行翅下靜脈采血，共采取75 管血液，靜置3～4 h 待血液凝固后，3 000 r/min 離心5 min，收集血清并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中，于-20℃保存?zhèn)溆?，用于測(cè)定血清生殖激素和抗氧化指標(biāo)。另外，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選1 只種公鴨，每組3 只進(jìn)行屠宰。屠宰結(jié)束后，取其左右側(cè)睪丸，統(tǒng)一采集公鴨左側(cè)睪丸組織樣本用于進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察；統(tǒng)一采集公鴨右側(cè)睪丸組織樣本用于進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 睪丸樣本組織形態(tài)學(xué)觀察 為了觀察睪丸樣本的形態(tài)學(xué)，本研究首先對(duì)番鴨睪丸進(jìn)行石蠟切片制作。先將睪丸組織切成2 m的小塊，用Bouin 液固定12 h；接下來(lái)將固定好的組織進(jìn)行脫水，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，再進(jìn)行切片；石蠟切片脫蠟后使用蒸餾水清洗，切片制作完成后分別使用蘇木素和伊紅染色，染色完成后進(jìn)行封片。

1.3 血清生化水平指標(biāo)檢測(cè) 檢測(cè)的血清生殖激素指標(biāo)包括睪酮（T）、雌二醇（E）、促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH），使用酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定，試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供。血清抗氧化指標(biāo)包括超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧能力（T-AOC），使用生化分析儀進(jìn)行分析，試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.4 RNA 的提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 RNA 的提取使用Omega 試劑盒。得到RNA 后本研究使用Nanodrop 2000 檢測(cè)RNA 濃度、純度和完整度，使用Agilent bioanalyzer 2100 記錄樣本的OD 值和RIN 值。RNA 提取后本研究使用PrimeScriptRT regent Kit With gDNA Eraser 試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)使用q-PCR法進(jìn)行定量，以保證文庫(kù)的有效濃度，庫(kù)檢合格后使用Illumina Hiseq 平臺(tái)進(jìn)行150 個(gè)堿基對(duì)配對(duì)的雙末端測(cè)序。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)組裝 將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)使用Fastx_toolkit 軟件進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，包括去除含有接頭的Reads，去除低質(zhì)量的Reads，從而得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)（Clean Reads）。使用Hisat2 軟件將Clean Reads 映射到鴨參考基因組中（CAU_duck1.0）。在已有參考基因組的基礎(chǔ)上本研究使用stringTie 軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝拼接，與已有的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較，獲得沒(méi)注釋的新轉(zhuǎn)錄本。

1.6 差異表達(dá)分析 本研究使用Deseq2 軟件分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間的差異表達(dá)。采用FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）作為衡量基因表達(dá)水平的指標(biāo)，將|log2FoldChange|≥1且value<0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)獲得差異表達(dá)的基因集。實(shí)驗(yàn)組差異基因表達(dá)水平高于對(duì)照組為上調(diào)基因（Up Regulated Gene）,低于對(duì)照組的為下調(diào)基因（Down Regulated Gene）。

部分危險(xiǎn)品碼頭因建造時(shí)間早于《裝卸油品碼頭防火設(shè)計(jì)規(guī)范》（JTJ237-99）實(shí)施時(shí)間，消防改造設(shè)計(jì)時(shí)因充分考慮裝卸貨種和碼頭實(shí)際情況確定危險(xiǎn)品碼頭分類等級(jí)，避免不必要地大規(guī)模改造碼頭，干擾碼頭的日常生產(chǎn)作業(yè)。

1.7 差異表達(dá)基因富集分析 Gene Ontology（GO）分析是大規(guī)?；蚬δ芨患芯恐斜容^常用的方法，包含3 個(gè)主要分支：生物學(xué)過(guò)程（Biological Process）、分子功能（Molecular Function）和細(xì)胞組分（Cellular Component）。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析有助于把基因及表達(dá)信息作為一個(gè)整體，進(jìn)一步解讀基因功能。差異表達(dá)基因的GO 功能注釋采用超幾何分布的GOseq R 包實(shí)現(xiàn)，KEGG 通路分析采用KOBAS 在線網(wǎng)站完成。其中以<0.05 和富集基因數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因顯著富集的GO 條目和KEGG 通路。

2 結(jié)果

2.1 睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察 番鴨睪丸組織的石蠟切片結(jié)果如圖1 所示，對(duì)照組（圖1A、圖1B）生精上皮層數(shù)少，生精細(xì)胞數(shù)量少，管腔內(nèi)的空腔面積大，成熟精子少；淫羊藿組（圖1C、圖1D）生精上皮層數(shù)多，生精細(xì)胞數(shù)量多，管腔飽滿，成熟精子多。

圖1 對(duì)照組和淫羊藿組番鴨睪丸切片

2.2 血清生化指標(biāo)水平 由表2 可見(jiàn)，血清生殖激素中，淫羊藿組睪酮含量、雌二醇含量、促卵泡素含量和促黃體素均要顯著高于對(duì)照組。由表3 可見(jiàn)，血清抗氧化指標(biāo)中，淫羊藿組的超氧化物歧化酶（SOD）含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）含量、總抗氧化（T-AOC）水平均顯著高于對(duì)照組；而丙二醛（MDA）含量顯著低于對(duì)照組。

表2 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組血清生殖激素含量的比較

表3 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組血清抗氧化指標(biāo)的比較

2.3 RNA 數(shù)據(jù)分析 通過(guò)Illimina 測(cè)序平臺(tái)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)睪丸樣本的6 個(gè)cDNA 文庫(kù)進(jìn)行了高通量測(cè)序，經(jīng)過(guò)質(zhì)控后，每個(gè)樣本平均可獲得5.38×10個(gè)Clean Reads（表4）。本研究使用DESeq2 軟件，以value<0.05且|log2FoldChange| ≥1 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。本研究最終得到2 414 個(gè)差異表達(dá)基因，其中1 538 個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)，876 個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá)（圖2）。

圖2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組番鴨睪丸組織中差異表達(dá)基因火山圖

表4 測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

2.4 差異基因的GO 注釋及富集分析 對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能注釋，共發(fā)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組顯著富集的GO 條目有759 條，在生物學(xué)過(guò)程中多注釋到白細(xì)胞激活（GO：0045321）、淋巴細(xì)胞激活（GO：0046649）、單個(gè)多細(xì)胞生物過(guò)程（GO：0044707）等過(guò)程，在細(xì)胞組分中多注釋到受體（GO：0043235）、離子膜（GO：0005886）、細(xì)胞膜（GO：0009986）、細(xì)胞膜突觸（GO：0120025）等，在分子功能上主要集中于轉(zhuǎn)錄因子、RNA 聚合酶II 核心啟動(dòng)子區(qū)域特異性結(jié)合（GO：0000982），轉(zhuǎn)錄激活因子、RNA 聚合酶II 核心啟動(dòng)子區(qū)域特異性結(jié)合（GO：0001077），RNA 聚合酶II 特異性結(jié)合（GO：0000977）（表5）。

表5 差異表達(dá)基因富集的GO 分類條目（前10 位）

KEGG 富集分析用于確定差異表達(dá)基因參與的主要生化代謝途徑和信號(hào)通路。結(jié)果表明，差異表達(dá)基因顯著富集在14 個(gè)通路中（圖3），分別是細(xì)胞因子受體相互作用（ko04060）、鐵死亡（ko04216）、黏附連接（ko04520）、溶酶體（ko04142）、Hippo 信號(hào)通路（ko04391）、軸突引導(dǎo)（ko04360）、礦物質(zhì)吸收（ko04978）、鞘脂生物合成（ko00603）、抗原生成和傳 遞（ko04612）、Rap1 信號(hào)通路（ko04015）、Jak-STAT 信號(hào)通路（ko04630）、Hippo 信號(hào)通路（ko04390）、PI3K-Akt 信號(hào)通路（ko04151）、內(nèi)吞作用（ko04144）。

圖3 差異表達(dá)基因顯著富集通路氣泡圖

3 討論

正常的睪丸組織結(jié)構(gòu)和功能能夠維持動(dòng)物機(jī)體的繁殖能力。本研究通過(guò)制作石蠟切片，觀察到實(shí)驗(yàn)組中生精上皮層數(shù)多，生精細(xì)胞數(shù)量多，管腔飽滿，成熟精子多，說(shuō)明淫羊藿的確可以促進(jìn)番鴨睪丸的發(fā)育，促進(jìn)精子的發(fā)生與成熟。激素調(diào)控在動(dòng)物的繁殖生理過(guò)程中是必不可少的。種公鴨垂體分泌的促卵泡素和促黃體素、睪丸分泌的睪酮和雌二醇激素都是重要的繁殖激素，屬于類固醇激素。本研究顯示飼料中添加淫羊藿可以顯著提高番鴨體內(nèi)睪酮、雌二醇、促卵泡素、促黃體素的含量。有大量研究與本研究的結(jié)果類似，孫業(yè)波發(fā)現(xiàn)淫羊藿可以顯著提高遼寧絨山羊種公羊血液中睪酮、促卵泡素和促黃體素的含量。淫羊藿中發(fā)揮作用的主要成分是淫羊藿苷，其可能是通過(guò)影響下丘腦-垂體-睪丸軸之間的平衡來(lái)誘導(dǎo)激素分泌。本研究還檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)組中血液的抗氧化指標(biāo)，結(jié)果顯示淫羊藿可以提高番鴨體內(nèi)超氧化物歧化酶含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶含量和總抗氧化水平，降低丙二醛含量。淫羊藿苷具有很強(qiáng)的清除二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH）、超氧陰離子自由基，還原力和總抗氧化能力，同時(shí)有較強(qiáng)的清除羥自由基的能力，這些能力賦予了淫羊藿苷顯著的抗氧化活性。

通過(guò)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能注釋，本研究發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在生物學(xué)過(guò)程中的白細(xì)胞激活、淋巴細(xì)胞激活以及single-multicellular 組織進(jìn)程等過(guò)程。相關(guān)研究表明動(dòng)物的睪丸具有特殊的免疫環(huán)境，主要體現(xiàn)在它具有顯著的免疫特權(quán)和有效的局部先天免疫的特性，睪丸炎的發(fā)生可能使免疫平衡受損，而白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞對(duì)維持睪丸免疫平衡至關(guān)重要。郭明明等研究表明淫羊蕾對(duì)雞的免疫功能有一定影響，高煥等研究表明淫羊蕾可提高淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4 和IFN-mRNA 的表達(dá)，從而提高家禽的免疫能力，猜測(cè)淫羊蕾可能通過(guò)對(duì)睪丸免疫系統(tǒng)的改進(jìn)從而提升番鴨的生殖能力。差異表達(dá)基因在細(xì)胞組分中主要注釋到受體復(fù)合物、質(zhì)膜、細(xì)胞膜、溶酶體腔等組分。激素受體在調(diào)節(jié)睪丸形成和雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中有非常重要的作用，Heckert 等人證明FSH 受體mRNA 存在于成年大鼠的睪丸中，并且這種mRNA 水平在生精上皮細(xì)胞的周期中發(fā)生變化，還有如糖皮質(zhì)激素受體和可溶性促性腺激素受體，ALK 受體家族對(duì)雄性睪丸和睪丸生精過(guò)程均具有調(diào)控作用。質(zhì)膜和細(xì)胞膜是精子主要的膜結(jié)構(gòu)，溶酶體腔泡對(duì)精子細(xì)胞和精母細(xì)胞釋放入管腔內(nèi)有重要作用，可能的機(jī)制是淫羊蕾通過(guò)對(duì)質(zhì)膜、細(xì)胞膜、受體復(fù)合物、溶酶體腔等細(xì)胞組分形成的影響來(lái)影響番鴨精子的形成和發(fā)生。差異表達(dá)基因分子功能方面主要注釋到轉(zhuǎn)錄因子活性、RNA 聚合酶特異性結(jié)合，DNA 結(jié)合等。相關(guān)研究表明諸多轉(zhuǎn)錄因子在動(dòng)物睪丸發(fā)育過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，其中轉(zhuǎn)錄因子Sp1通過(guò)調(diào)節(jié)睪丸中細(xì)胞周期蛋白A1（GATA1）特異性表達(dá)，Sox9、Sox5 和Sox13 轉(zhuǎn)錄因子可影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，Semba 等的研究表明由基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子HMG 對(duì)性腺發(fā)育不全有關(guān)。

本研究差異表達(dá)基因主要在細(xì)胞因子受體相互作用、鐵死亡、黏附連接、溶酶體、Hippo 及jak-stat 信號(hào)等通路中富集，表明這些信號(hào)通路與番鴨睪丸發(fā)育和生精能力有關(guān)。Li 等人研究表明細(xì)胞因子和睪酮調(diào)節(jié)原代精母細(xì)胞在血睪屏障和精子形成中的運(yùn)輸中起重要作用，Loveland 等研究表明一些重要的細(xì)胞因子在建立和維護(hù)睪丸的免疫特性方面有重要作用，如細(xì)胞因子SOCS 可通過(guò)jak 信號(hào)通路調(diào)節(jié)睪丸發(fā)育和免疫微環(huán)境建立，腫瘤壞死因子（TNF-a）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）對(duì)睪丸自身免疫同樣起重要作用。陳蕙芳對(duì)淫羊蕾的粗提取物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這些提取物中具有抗炎、雌激素樣、抗衰老等多種生物活性，這與本研究得到的結(jié)果吻合。粘附連接是細(xì)胞和細(xì)胞直接的關(guān)鍵點(diǎn)，其在決定和維持組織結(jié)構(gòu)方面起重要作用，在睪丸中，支持細(xì)胞之間以及支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞之間的連接是由肌動(dòng)蛋白連接的，這些連接對(duì)于精子的發(fā)生非常重要。Hippo 信號(hào)通路和jak-stat 信號(hào)通路在細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用，相關(guān)研究表明Hippo 信號(hào)通路對(duì)鮭魚青春期睪丸支持細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用，jak-stat 信號(hào)通路可以促進(jìn)果蠅成年睪丸中的生殖干細(xì)胞分化。

4 結(jié)論

飼料日糧中添加淫羊藿可提高番鴨血清生殖激素中睪酮含量、雌二醇含量、促卵泡素含量和促黃體素表達(dá)，提高超氧化物歧化酶含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶含量、總抗氧化水平。飼料日糧中添加淫羊藿對(duì)番鴨睪丸發(fā)育有顯著影響，可激活白細(xì)胞和相關(guān)免疫受體表達(dá)，激活細(xì)胞因子受體相互作用、鐵死亡等代謝途徑和信號(hào)通路。本研究結(jié)果對(duì)飼料中添加淫羊藿以提高番鴨的繁殖力具有重要意義。