韓紅宇，南瑞鵬，王志鵬，崔宇帆，劉佳佳，申 彤，龐全海*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2.中國(guó)輻射防護(hù)研究院，山西太原 030006）

哺乳動(dòng)物的毛色由其體內(nèi)黑色素的數(shù)量、質(zhì)量、分布所決定。黑色素一般分為真黑素和褐黑素，其形成有著復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，從黑色素細(xì)胞的分化、成熟到黑色素的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)過程均有多個(gè)基因參與調(diào)控。作為TRP 家族（Transient Receptor Potential，TRP）的第1 個(gè)成員，在人類眼睛和小鼠B16 轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系中表達(dá)。對(duì)正常黑色素細(xì)胞的色素沉積至關(guān)重要，是色素沉積障礙的潛在靶點(diǎn)，在人的視網(wǎng)膜色素上皮中，主要存在于含有黑色素的色素細(xì)胞中，其表達(dá)與黑色素增殖和沉積相關(guān)。同時(shí)在黑色素細(xì)胞中高度表達(dá)，可作為人類黑色素瘤進(jìn)展的預(yù)測(cè)因子。紫外線B 的輻射也可調(diào)控的表達(dá)，并促進(jìn)黑素細(xì)胞的增殖和分化。眾所周知，小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子（Microphthalmia-associated Transcription Factor，）作為黑色素合成主要信號(hào)通路下游關(guān)鍵因子，在色素細(xì)胞發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。MITF 在黑色素細(xì)胞中可調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄，并在介導(dǎo)皮膚色素形成過程中起著重要作用，介導(dǎo)的離子通道通過黑色素小體調(diào)控黑色素的合成。

目前尚未有相關(guān)研究報(bào)道綿羊毛色調(diào)控通路中的作用機(jī)制。因此，本實(shí)驗(yàn)以0、3、6、12 月齡黑色和白色杜泊綿羊（♂）×蒙古羊（♀）為研究對(duì)象，通過mRNA 和蛋白水平在不同發(fā)育階段的表達(dá)及定位，探討不同發(fā)育階段不同綿羊毛色的調(diào)控中的表達(dá)特性，以期找到在綿羊毛色調(diào)控過程中時(shí)間依賴性的證據(jù)，為后期研究綿羊毛色的作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康的杜泊綿羊（♂）× 蒙古羊（♀）雜交黑白公綿羊48 只，其中黑白各24 只，每種毛色0、3、6、12 月齡各6 只（體重依次為12±1.2、25±1.2、38±1.2、50±1.2 kg），購自山西省太原市清徐縣源森養(yǎng)殖科技園。

1.2 樣品采集 選取臀部區(qū)域，術(shù)部剃毛、碘酊消毒、75% 酒精脫碘，按照外科手術(shù)操作要求，在無菌條件下通過取皮器采取皮膚組織，每只羊取3 塊，每塊直徑1 cm，其中2 塊用無菌錫箔紙包裹、迅速置液氮中凍存，1 塊置4 %多聚甲醛中固定，備用。

1.3 主要試劑和儀器 兔抗（博士德，中國(guó)武漢）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（索萊寶，中國(guó)北京）、免疫組化試劑盒（中杉金橋，中國(guó)北京）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Stratagene，美國(guó)）、核酸蛋白測(cè)定儀（Eppendorf，德國(guó)）、XSP-24N 光學(xué)顯微鏡（麥迪森，中國(guó)南京）。

1.4 不同發(fā)育階段不同毛色綿羊皮膚組織中mRNA 表達(dá)檢測(cè) 從NCBI 中選取目的基因及內(nèi)參的mRNA 序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)熒光定量特異性引物，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，引物信息見表1。

表1 目的基因和內(nèi)參基因相關(guān)信息

提取綿羊皮膚組織總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根 據(jù)SYBRPremix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus）試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，按照反應(yīng)條件構(gòu)建20 μL 體系：SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板（25 ng/μL）2.0 μL，Rox Reference Dye II 0.4 μL，dd HO 6.0 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，59℃退火30 s，72℃延伸20 s，共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3 次，計(jì)算相對(duì)定量結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)利用2法計(jì)算mRNA 在綿羊皮膚中的表達(dá)量。

1.5 不同發(fā)育階段不同毛色綿羊皮膚組織中TRPM1 蛋白表達(dá)檢測(cè) 取液氮中保存的綿羊皮膚組織，按哺乳動(dòng)物總蛋白提取試劑盒（索萊寶）步驟提取總蛋白，通過BCA 測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度，每孔樣品量為20 μg。配制4%分離膠和10%的濃縮膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，在5% 的脫脂奶粉中室溫封閉1 h，TBST 洗膜5 min×3 次，4℃孵育一抗過夜（兔抗1:1 000；內(nèi)參兔抗1:3 500），次日TBST 洗膜10 min×3 次，二抗（1:5 000，HRP-山羊抗兔IgG）室溫孵育1 h，TBST 洗膜10 min×3 次。將適量ECL 發(fā)光液滴在膜上，F(xiàn)luoChemQ 采集分析凝膠圖像。

1.6 不同發(fā)育階段不同毛色綿羊皮膚組織中免疫組化分析 將固定24 h 的皮膚組織從4% 多聚甲醛中取出進(jìn)行修塊，然后置于組織包埋盒水洗24 h，而后經(jīng)梯度酒精（70%、85%、95%、100%）脫水，2 次二甲苯透明，在蠟缸中充分浸蠟后進(jìn)行包埋。將包埋好的蠟塊切成4 μm 的切片，常規(guī)脫蠟至水，3% 去離子水室溫孵育10 min，檸檬酸鈉抗原修復(fù)液熱修復(fù)5 min×2次，滴加5% BSA 封閉液，37℃孵育30 min，滴加一抗（兔抗1:350），陰性對(duì)照組使用PBS 代替一抗，4 ℃孵育過夜，PBS 沖洗5 min×3 次。之后滴加HRP 標(biāo)記抗 兔IgG，37 ℃孵 育30 min，PBS 沖 洗5 min×3 次。DAB 顯色液顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。蘇木素復(fù)染1 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，在XSP-24N 光學(xué)顯微鏡下采集圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)分析基于Anova、Duncan 方法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（S.E.）表示。<0.05 表示差異顯著，<0.01 表示差異極顯著。免疫組織化學(xué)結(jié)果使用Image Pro Plus 7.0 圖像分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊皮膚組織中mRNA 表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果由圖1 可知，mRNA 在綿羊不同毛色不同發(fā)育階段均有不同程度表達(dá)。在白色綿羊皮膚中，6 月齡綿羊的mRNA 表達(dá)量顯著高于0、3、12 月齡，且在0 月齡中表達(dá)最低。在黑色綿羊皮膚中，3、6、12月齡的mRNA 表達(dá)量顯著高于0 月齡黑色綿羊皮膚中的表達(dá)，且6 月齡mRNA 表達(dá)量最高（圖1B）。不同發(fā)育階段的黑色綿羊皮膚中mRNA的表達(dá)量均顯著高于相同月齡白色綿羊皮膚中的表達(dá)量（圖1C）。

圖1 綿羊皮膚組織中TRPM1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量

2.2 綿羊皮膚組織中TRPM1 蛋白水平檢測(cè)結(jié)果 由圖2 可見，TRPM1 蛋白在不同發(fā)育階段的黑、白綿羊皮膚中均有表達(dá)。在白色綿羊皮膚中，TRPM1 蛋白在6月齡表達(dá)量最高，但與其他月齡TRPM1 蛋白表達(dá)量差異不顯著（圖2A、B）。在黑色綿羊皮膚中，6 月齡、12 月齡的TRPM1 表達(dá)量顯著高于0 月齡和3 月齡（圖2C、D），且6 月齡TRPM1 蛋白表達(dá)最高（圖2D）。12 月齡的黑色綿羊皮膚TRPM1 表達(dá)量顯著高于白色綿羊皮膚TRPM1 的表達(dá)量，而0 月齡和6 月齡的黑色綿羊皮膚TRPM1 表達(dá)量之間差異不顯著（圖2E）。

圖2 綿羊皮膚中 TRPM1 Western Blotting 結(jié)果及其相對(duì)表達(dá)量

2.3 TRPM1 蛋白在不同綿羊毛色皮膚中的定位分析由圖3 可見，在白色和黑色綿羊皮膚中，TRPM1 蛋白定位于毛囊毛干、外根鞘、毛乳頭和毛基質(zhì)。陰性對(duì)照未見陽性表達(dá)。圖4 顯示，TRPM1 蛋白在黑色綿羊皮膚中毛囊的毛干、外根鞘、毛乳頭和毛發(fā)基質(zhì)的表達(dá)量均高于在白色綿羊中的表達(dá)量，但差異并不顯著。

圖3 黑白色綿羊皮膚 TRPM1 蛋白表達(dá)定位的免疫組化分析（200×）

圖4 TRPM1 蛋白在白、黑色綿羊皮膚中的光密度值分析

3 討論

3.1在綿羊組織的定位及對(duì)毛色蛋白表達(dá)的影響 黑素小體是負(fù)責(zé)合成、儲(chǔ)存和運(yùn)輸黑色素的細(xì)胞器，黑素小體的遺傳、發(fā)育和形成皮膚顏色主要由表皮中黑色素的含量和組成決定。黑色素細(xì)胞系源自神經(jīng)嵴，黑色素細(xì)胞前體從神經(jīng)管離開到背側(cè)發(fā)育為皮膚，并最終形成黑色素細(xì)胞，黑色素是由酪氨酸酶的酶活性啟動(dòng)，經(jīng)黑素小體轉(zhuǎn)移到表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和毛皮質(zhì)角質(zhì)形成細(xì)胞中。在不同類型皮膚中，黑色素細(xì)胞分布于基底層、棘狀層、顆粒層到角化層。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，參與了綿羊毛色的形成和毛囊的生長(zhǎng)及發(fā)育，TRPM1 蛋白定位于綿羊皮膚中的毛囊毛干、外根鞘、毛乳頭和毛基質(zhì)。的敲除導(dǎo)致酪氨酸酶活性和細(xì)胞內(nèi)黑色素降低，深色皮膚中黑色素含量大于淺色皮膚。在鴨羽毛毛囊中基因的下調(diào)可能是造成鴨白羽的原因之一。青柏等研究證明，在馬屬動(dòng)物中，是決定豹點(diǎn)毛表型的調(diào)控基因，并且證實(shí)基因與蒙古馬斑點(diǎn)毛色表型存在著密切的關(guān)系。以白色斑塊為特征的阿帕盧薩馬皮膚中基因的表達(dá)量明顯降低。此外，人類淺色皮膚中的黑素細(xì)胞與深色皮膚的黑素細(xì)胞相比，mRNA 的表達(dá)減少了80%。在波爾山羊和麻城黑山羊雜交羊的研究中，頭頸部黑色皮毛中的表達(dá)較白色區(qū)域高。棕色羊皮中的的表達(dá)較灰色和白色皮膚顯著上調(diào)，而其在灰色和白色羊皮中的表達(dá)無顯著差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同毛色綿羊皮膚中均有不同程度的表達(dá)，而在黑色皮膚中的表達(dá)高于白色皮膚，且TRPM1 蛋白在黑色綿羊皮膚中毛囊的毛干、外根鞘、毛乳頭和毛基質(zhì)的表達(dá)量均高于在白色綿羊中的表達(dá)量，表明在黑色皮膚的表達(dá)量高于白色皮膚，此結(jié)果與前人研究一致。

3.2在不同毛色不同發(fā)育階段綿羊皮膚中的表達(dá) 甘肅高山細(xì)毛羊從出生到18 月齡，毛囊的生長(zhǎng)速度逐漸加快，到18 月齡時(shí)，毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育幾乎停止。在小鼠10.5 d 的胚胎，成黑素細(xì)胞中開始出現(xiàn)多巴色素互變異構(gòu)酶（Dopachrome Tautomerase，DCT），最后胚胎生長(zhǎng)到15.5 d 時(shí)出現(xiàn)酪氨酸（Tyrosine，Tyr）和酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（TYRP1）。本研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊不同毛色不同發(fā)育階段綿羊皮膚中的表達(dá)具有差異性。據(jù)此可以推斷，TRPM1 蛋白可能參與綿羊毛囊生長(zhǎng)發(fā)育過程以及毛色的形成；并且基因在綿羊皮膚黑色素形成及沉積的過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。但基因在不同顏色的綿羊皮膚中產(chǎn)生不同結(jié)果及在不同發(fā)育階段不同毛色綿羊皮膚的形成機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究予以闡明。

4 結(jié)論

基因在不同毛色不同發(fā)育階段綿羊皮膚中均有不同程度的表達(dá)，且在黑色綿羊皮膚中表達(dá)量高于白色綿羊皮膚。在不同發(fā)育階段綿羊皮膚中，6 月齡的mRNA 及蛋白表達(dá)均高于0、3、12 月齡。TRPM1 蛋白定位于毛囊毛干、外根鞘、毛乳頭和毛發(fā)基質(zhì)?？梢?，基因參與綿羊毛囊生長(zhǎng)發(fā)育過程及毛色的調(diào)控。