王明晶，潘冬梅，顏軼男，代春鵬，劉桂瓊*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070；2 湖北致清和農(nóng)牧有限公司，湖北宜昌 443100）

青春期啟動受下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamic Pituitary Gonadal，HPG）內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因（）是HPG 軸上游的重要調(diào)控激素，參與啟動青春期。1996 年，Lee 等發(fā)現(xiàn)基因具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。基因的編碼產(chǎn)物是kisspeptin，與其受體GPR54 結(jié)合通過/系統(tǒng)發(fā)揮功能?；蚓幋a的前體物質(zhì)可以水解為Kisspeptin54、Kisspeptin14、Kisspeptin13和Kisspeptin10。Kisspeptins 的羧基末端都有10 肽片段Arg-Phe-NH2（-RF amide）序列（即第45 位酪氨酸與54 位苯丙氨酸之間的酰胺化肽段），該片段與受體結(jié)合并激活受體，因此Kisspeptin-10 是kisspeptin結(jié)合和激活其受體GPR54 的區(qū)域，也是具有生物活性的最小序列。師美紅等發(fā)現(xiàn)小鼠卵巢次級卵泡的kisspeptin 表達減少，降低卵泡對FSH 的敏感性，使血清中FSH 水平升高，從而募集大量的初級卵泡，最終可能使卵母細胞耗竭，這表明基因的表達可能通過影響卵母細胞質(zhì)量影響胚胎的產(chǎn)生。基因的多態(tài)性對羊產(chǎn)羔數(shù)的影響是國內(nèi)外研究的熱點，張圓等發(fā)現(xiàn)濟寧青山羊基因G296C 位點GG 型產(chǎn)羔數(shù)高，而曹貴玲等則發(fā)現(xiàn)CC 型母山羊的產(chǎn)羔數(shù)高于其他2 種基因型的母羊。Mahmoud 等發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)含子1 的T121A 位點與產(chǎn)羔數(shù)有顯著相關(guān)，其中TT基因型母羊發(fā)情期雌二醇17的水平較高，推測該位點可能通過影響雌二醇分泌影響山羊的產(chǎn)羔數(shù)。黔北麻羊和貴州黑山羊群體基因內(nèi)含子1 的G277C 位點和T486A 位點與產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)，G277C 位點的GG 基因型個體的產(chǎn)羔數(shù)最高，T486A 位點的TT、TA 基因型個體的產(chǎn)羔數(shù)均顯著高于AA 基因型個體。安雪姣等發(fā)現(xiàn)基因的多態(tài)性與小尾寒羊的產(chǎn)羔數(shù)無關(guān)，但季節(jié)性發(fā)情綿羊群體基因g.1317523C>T位點的基因型頻率和基因頻率與常年發(fā)情綿羊群體差異顯著，推測該位點可能與綿羊的季節(jié)性繁殖有關(guān)。杜丹丹發(fā)現(xiàn)湖羊基因的g.37C>T、g.38G>A、g.89G>A、g.4783C>G、g.5117T>C 位點的等位基因頻率在高繁組與低繁組間差異顯著，推測這些位點可能與綿羊的高產(chǎn)性狀有關(guān)，但其所選擇樣本量較少。夷陵綿羊是以東弗利生羊、小尾寒羊和湖羊3 個品種雜交選育而成的綿羊群體，其突出特點是產(chǎn)多羔，因此本研究以該群體為研究對象，檢測其基因序列，尋找該群體基因的多態(tài)位點，分析其與產(chǎn)羔性狀的關(guān)系，為進一步研究基因?qū)d羊繁殖性狀的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 采集湖北致清和農(nóng)牧有限公司292 只成年經(jīng)產(chǎn)母羊的血樣5 mL，用乙二胺四乙酸二鉀（EDTA2K dipotassium edetate，EDTA-2K）抗凝，樣品-20℃保存。記錄母羊二胎以上的產(chǎn)羔數(shù)，計算母羊的平均產(chǎn)羔數(shù)。

1.2 綿羊基因的PCR 擴增 酚-氯仿抽提法提取綿羊基因組DNA，OD/OD值在1.6～1.8 之間，測定濃度 并稀釋至50 μg/μL，-4 ℃保存。用Primer-BLAST 設(shè)計引物擴增綿羊基因序列（序列號：NC_040263.1）的3 個外顯子（引物序列見表1）。PCR 反應(yīng)體系：1 μLDNA（50 μg/μL），上下游引物（100 umol/L）各1 μL，10 μL MIX，7 μL 蒸餾水。擴增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，退火30 s，72℃ 1 min，30 個循環(huán)，72℃延伸10 min。第3 外顯子GC 含量高，因此選用高保真酶和降落PCR 程序進行擴增。根據(jù)北京全式金生物技術(shù)有限公司的高保真酶試劑盒說明在25 μL 的PCR 反應(yīng)體系中添加7.5 μL 的GC Enhancer。降落擴增程序的退火溫度為65～55℃，每1 個循環(huán)退火溫度降1℃，再55℃退火溫度下20 個循環(huán)。PCR 擴增產(chǎn)物送天一輝遠生物科技有限公司測序。

表1 KISS1 基因引物序列

1.3 基因頻率計算、連鎖分析、單倍型構(gòu)建及其與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析 比對擴增個體基因序列和參考序列，確定SNP 位點，綿羊基因參考序列第1 外顯子第1 位堿基位為+1。計數(shù)基因各多態(tài)位點的基因型，計算基因型頻率和基因頻率。用Haploview 對基因各多態(tài)位點進行連鎖分析和單倍型構(gòu)建。用SPSS 中單因素方差分析對基因型和單倍型組合與個體產(chǎn)羔數(shù)進行差異顯著分析，分析模型如下：

其中：Y為個體表型記錄；為群體均值；G為各位點的基因型或單倍型效應(yīng)；E為隨機誤差。

2 結(jié)果

2.1 夷陵綿羊基因的PCR 擴增 以夷陵綿羊基因組DNA 為模板擴增基因外顯子，擴增產(chǎn)物用2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。由圖1 可知，PCR 擴增產(chǎn)物條帶明亮、無雜帶，說明基因引物特異性較好，片段大小與引物設(shè)計擴增的片段大小一致，說明擴增的DNA 片段是目的片段。

圖1 夷陵綿羊KISS1 基因外顯子擴增片段

2.2基因SNP 位點信息 將瓊脂糖凝膠電泳檢測的PCR 產(chǎn)物測序，用SeqMan 軟件分析292 只綿羊基因外顯子序列的多態(tài)性，共檢測到14 個SNPs位 點，即g.18C>T、g.21A>G、g.61C>T、g.62G>A、g.113G>A、g.191C>G、g.205G>C、g.3410G>A、g.5666C>T、g.5760C>G、g.5760C>T、g.5765C>T、g.5768G>A、g.5894G>T、g.5906T>C（圖2）。

圖2 夷陵綿羊KISS1 基因多態(tài)性

表2 是這些突變位點在基因中的位置、等位基因及對應(yīng)氨基酸信息，由表2 可知，除g.18C>T、g.21A>G 和g.5760C>G/T 外，其余11 個SNPs 位點為非同義突變。在11 個非同義突變中，g.61C>T、g.62G>A位點突變導(dǎo)致編碼的精氨酸密碼子突變?yōu)榻K止密碼子。

表2 夷陵綿羊KISS1 基因SNP 位點

2.3基因SNP 位點的基因頻率 g.5765C>T 與g.5894G>T 位點在夷陵綿羊群體中只檢測到2 種基因型，g.5765C>T 位點主要是CC 基因型，g.5894G>T 位點主要是GG 基因型。在這些基因突變位點中，g.21A>G位點參考基因序列堿基的基因頻率較低，其余位點參考基因序列堿基的基因頻率都很高。由表3 可知，夷陵綿羊基因的g.61C>T、g.62G>A、g.113G>A、g.205G>C 位點偏離哈代-溫伯格平衡（<0.05）。

表3 KISS1 基因SNP 位點等位基因頻率

2.4基因SNP 位點的連鎖分析 對14 個SNPs位點進行連鎖不平衡分析，結(jié)果表明g.18C>T、g.21A>G位點構(gòu)成連鎖區(qū)塊1（Block1），g.61C>T 和g.113G>A位點構(gòu)成連鎖區(qū)塊2（Block2），g.191C>G 和g.205G>C位點構(gòu)成連鎖區(qū)塊3（Block3）（圖3）。Blolck1、Blolck2 和Blolck3 的分別為0.562、0.986、0.966，因此Blolck2 和Blolck3 呈現(xiàn)連鎖不平衡。

圖3 夷陵綿羊KISS1 基因SNP 位點的連鎖圖譜

分別對3 個連鎖區(qū)塊構(gòu)建單倍型，用Blolck1 的g.18C>T 和g.21A>G 共2 個位點在綿羊群體中構(gòu)建了7 種單倍型組合，分別是：CCGG、CTAG、CCAG、CTAA、TTAA、CCAA 和CTGG，分別占總數(shù)的57.6%、24.0%、8.83%、4.59%、2.12%、1.41% 和1.41%。用Blolck2 的g.61C>T 和g.113G>A 共2 個位點在綿羊群體中構(gòu)建了4 種單倍型組合，分別是：CCGG、CTGA、TTAA 和CTAA，其中單倍型組合CCGG 為主要單倍型組合，占總數(shù)的75.4%，CTGA 和TTAA 則分別占20.4%和3.87%，CTAA 的頻率最低，為0.352%。用Blolck3 的g.191C>G 和g.205G>C 共2 個位點在 綿羊群體中構(gòu)建了5 種單倍型組合，分別是：CCGG、CGGC、GGCC、CGGG 和CGCC，分別占 總數(shù)的66.7%、27.0%、5.32%、0.709% 和0.355%，其中單倍型CCGG 為主要單倍型。

2.5基因SNP 位點及其單倍型對夷陵綿羊產(chǎn)羔數(shù)的影響 在11 個非同義突變中，g.18C>T、g.21A>G、g.61C>T、g.62G>A、g.113G>A、g.191C>G、g.205G>C、g.3410G>A、g.5666C>T、g.5760C>G、g.5768G>A、g.5894G>T、g.5906T>C 的多態(tài)性與夷陵綿羊產(chǎn)羔數(shù)沒有關(guān)聯(lián)。基因和g.5765C>T 位點的多態(tài)性與夷陵綿羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果見表4。g.5765C>T 位點只有2 種基因型，其中CC 基因型母羊產(chǎn)羔數(shù)比CT基因型高0.45 頭（<0.05）。

表4 KISS1 基因SNP 位點基因型與綿羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析

由于樣本的部分單倍型數(shù)量較少，因此在進行關(guān)聯(lián)分析時，只選取樣本含量大于10 的單倍型組合與綿羊產(chǎn)羔數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析。Block1、Blolck2 和Blolck3 中的單倍型與產(chǎn)羔數(shù)均無顯著相關(guān)。

3 討論

綿羊繁殖力是影響其經(jīng)濟效益的重要指標(biāo)，夷陵綿羊選育自四季發(fā)情、繁殖力強的湖羊，且湖羊血統(tǒng)占50%，故具有與湖羊相近的繁殖性能，平均產(chǎn)羔率達200% 以上，因此研究影響夷陵綿羊產(chǎn)羔數(shù)的分子標(biāo)記對于綿羊多胎資源的開發(fā)利用及生產(chǎn)實踐有重要意義?；蛟诰d羊的下丘腦、垂體、卵巢等組織器官中表達，但基因的SNP 位點與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)無顯著關(guān)聯(lián)。且基因在卵巢中的表達量隨日齡和發(fā)情周期而改變，并且發(fā)情期母羊卵巢基因的表達量極顯著高于發(fā)情后期、間情期和發(fā)情前期，因此基因可能在母羊發(fā)情排卵中發(fā)揮功能。

在山羊基因的多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的研究中，發(fā)現(xiàn)影響產(chǎn)羔數(shù)的位點主要位于基因的內(nèi)含子，在綿羊的相關(guān)研究中，主要對基因多態(tài)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)進行了關(guān)聯(lián)分析，其結(jié)果不一致。安雪姣等發(fā)現(xiàn)基因的SNP 位點與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)無顯著關(guān)聯(lián)，Chu 等則發(fā)現(xiàn)小尾寒羊基因G1035A位點顯著影響小尾寒羊的產(chǎn)羔數(shù)，而湖羊基因該位點只存在G 等位基因，因此該位點不影響湖羊的產(chǎn)羔數(shù)，該位點與本研究的g.3410G>A 位點相同，也與本研究夷陵綿羊的產(chǎn)羔數(shù)無關(guān)，可能的原因是本研究所用群體的湖羊血統(tǒng)占50%。本研究選擇基因為候選基因，研究該基因SNP 與綿羊產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)夷陵綿羊基因外顯子上有14 個SNPs 位點，其中11 個SNPs 位點為非同義突變位點，g.5760C>G/T位點有3 個復(fù)等位基因，之前沒有相關(guān)研究結(jié)果，該位點突變位于密碼子的第3 位堿基，不改變編碼的氨基酸。杜丹丹在基因的外顯子區(qū)域篩查到g.37C>T、g.38G>A、g.89G>A 和g.3556G>A 位點，且這些位點的等位基因頻率可能與綿羊產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)，這4 個位點與本研究的g.61C>T、g.62G>A、g.113G>A 和g.3410G>A為同一位點，擴大樣本后將這些SNPs 位點與產(chǎn)羔數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，這4 個SNPs 位點的多態(tài)性與綿羊的產(chǎn)羔數(shù)之間沒有關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)g.5765C>T 位點與產(chǎn)羔數(shù)顯著關(guān)聯(lián)，其中CC 基因型為優(yōu)勢基因型，且CC 基因型母羊的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CT 型母羊，該位點位于CDS 區(qū)，發(fā)生非同義突變后，使原編碼的脯氨酸（Pro）改變?yōu)榱涟彼幔↙eu），因此該位點對夷陵綿羊繁殖性狀的選育具有一定的指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

夷陵綿羊基因存在14 個SNPs 位點，這些位點形成3 個連鎖區(qū)塊，這14 個SNPs 位點中僅g.5765C>T 與產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)，因此g.5765C>T 位點可能是影響夷陵綿羊產(chǎn)羔數(shù)的主效位點，可作為綿羊選育的輔助標(biāo)記。