李 超，傅高惠，陳慧芳，蔡健鋒，劉俊杰，白銀山

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528231）

自然界中，卵子受精后形成合子，開始的合子基因組處于沉默狀態(tài)，胚胎發(fā)育主要依賴卵母細(xì)胞質(zhì)中儲存的RNA 和蛋白質(zhì)。隨著合子基因組逐步被激活（Zygotic Genome Activation，ZGA）以及母源RNA 和蛋白質(zhì)在發(fā)育過程中也逐漸被清除，胚胎發(fā)育調(diào)控開始由合子基因組主導(dǎo)，這一過程為母源-合子轉(zhuǎn)換（Maternal-Zygotic Transition，MZT）。關(guān)于哺乳動物卵子受精過程、雌雄原核遷移機(jī)制、合子卵裂、MZT 過程和ZGA 發(fā)生的分子機(jī)制，在人和老鼠中已有大量研究被報(bào)道，但對于禽類相關(guān)分子機(jī)制的研究尚不明確和完善。

隨著發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，家禽早期胚胎發(fā)育的分子機(jī)制也有了一些新的發(fā)現(xiàn)。研究顯示，禽卵子受精后的早期胚胎將在母體內(nèi)發(fā)育持續(xù)24～26 h，其中早期胚胎發(fā)生多次卵裂并伴隨著MZT 過程。Han 等測序發(fā)現(xiàn)，最初合子轉(zhuǎn)錄不活躍，ZGA 啟動主要依賴于和等重要母源轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。與哺乳動物不同，禽類合子基因組中的母方基因先被激活，來調(diào)控早期胚胎前期卵裂過程，父方基因組在發(fā)育后期才被激活。另外，NOTCH、WNT、MAPK、TGF-信號通路在早期發(fā)育過程中也被啟動，這揭示禽類胚胎發(fā)育分子機(jī)制獨(dú)特的模式。本文主要圍繞禽類卵子發(fā)育、卵子受精以及合子在母體內(nèi)發(fā)育的主要分子機(jī)制進(jìn)行綜述，以推動禽早期胚胎發(fā)育在生命科學(xué)研究領(lǐng)域的研究和應(yīng)用。

1 禽類卵子發(fā)育

禽類卵巢高度發(fā)達(dá)，具有獨(dú)特的卵子發(fā)育過程。禽類卵泡由1 個卵母細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞（Theca Cell，TCs）和顆粒細(xì)胞（Granulosa Cells，GCs）組成。禽卵泡發(fā)育過程中的雄激素和雌激素主要由TCs 產(chǎn)生，而哺乳動物卵巢中的雌激素由GCs 分泌。GCs 在禽卵泡發(fā)育過程中受到促卵泡刺激素（Follicle Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）調(diào)控。發(fā)育初期，位于卵巢皮質(zhì)內(nèi)的原始卵泡被激活為生長卵泡（1～4 mm），其中和在卵泡發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。6 個原始卵泡逐個被激活成生長卵泡后排列整齊，依次從卵巢血管系統(tǒng)中吸收大量脂質(zhì)和葉黃素，每個卵泡在經(jīng)歷約9 d 的發(fā)育后，形成一個富含蛋白質(zhì)的卵黃，最終成熟卵泡（最大40 mm）被排出卵巢，此時(shí)的卵子被卵黃膜包裹。

2 卵子受精

禽類雌性生殖道由漏斗部、膨大部、峽部、子宮和陰道組成，卵子受精過程在漏斗部完成。自然狀態(tài)下，卵子和精子只有在合適的時(shí)間和位置才能結(jié)合形成受精卵，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)后續(xù)發(fā)育。禽類受精過程和方式不同于哺乳動物，為增加配子相遇的機(jī)會，禽類精子進(jìn)入雌性生殖道后將被儲存在漏斗部和子宮與陰道交界處的一種特殊的管狀內(nèi)陷結(jié)構(gòu)中，這種結(jié)構(gòu)被稱為精子儲存小管（Sperm Storage Tubules，SST）。SST 的存在使禽類精子得以在雌性體內(nèi)存活2～15 周。研究發(fā)現(xiàn)，在禽SST 中儲存的精子自身是不運(yùn)動的，其能夠利用外源脂肪酸氧化釋放的能量來對抗SST 中液體的流動，防止精子流出SST。一些蛋白如碳酸酐酶、親和素、水通道蛋白和堿性磷酸酶在精子儲存過程中發(fā)揮重要作用。此外，SST 的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)化生長因子TGF-可以避免精子在雌性體內(nèi)發(fā)生免疫反應(yīng)。

排卵后，儲存在漏斗部SST 的精子在孕酮的作用下解離并釋放，隨后完成受精。受精整個過程僅需15 min，包括精子頂體反應(yīng)、精子穿透卵黃膜、雌雄原核融合以及合子形成。但值得注意的是，哺乳動物受精為單精入卵，而禽類表現(xiàn)為多精入卵。研究發(fā)現(xiàn)，精子進(jìn)入卵子的過程可以引起卵子內(nèi)Ca發(fā)生變化，形成Ca波激活信號。哺乳動物的單個精子進(jìn)入卵子后，形成的Ca波可以從進(jìn)入部位擴(kuò)散到整個卵子中，促使受精完成；而禽類單個精子所形成的Ca波僅能傳播至單個卵子的1/8～1/4，導(dǎo)致無法完成受精，這是致禽卵子需要多精入卵的原因之一。與哺乳動物相同，最后僅有1 個雄原核與雌原核融合，禽類卵子會選擇與最靠近雌原核的雄原核發(fā)生融合。未發(fā)生融合的其他雄原核則會發(fā)生退化，其在進(jìn)入卵子3～4 h 后開始向細(xì)胞質(zhì)外圍移動，最終被脫氧核糖核酸酶降解（圖1）。目前，關(guān)于禽類多精入卵和雄原核的選擇機(jī)制的研究還有很多未知，仍需要更進(jìn)一步的探究。

圖1 禽胚受精的多精入卵過程

3 禽胚胎早期發(fā)育過程

卵子受精后產(chǎn)生的合子在雌性生殖道內(nèi)移動24～26 h。膨大部的上皮組織在約3 h 內(nèi)分泌蛋白來包裹卵黃。隨后合子在峽部移動約1.5 h，獲得由X 型膠原組成的殼膜。最終合子進(jìn)入子宮停留約20 h，從母體血液中吸收Ca并將其附著于殼膜表面以形成碳酸鈣晶體（即蛋殼），在移動過程中合子會緩慢旋轉(zhuǎn)，使Ca分布更加均勻。

受精卵在子宮移動過程中不斷發(fā)生卵裂，根據(jù)耶爾基勒迪及柯查夫（Eyal-Giladi and Kochav，EGK）禽早期胚胎時(shí)段分類標(biāo)準(zhǔn)，可將其分為EGK I 期、EGK II 期、EGK III 期、EGK IV 期、EGK V 期、EGK VI 期、EGK VII 期、EGK VIII 期、EGK IX 期和EGK X 期（明暗區(qū)形成期）。EGK I 早期發(fā)生2 次卵裂，形成4個細(xì)胞，隨后以輻射狀產(chǎn)生8 個細(xì)胞，此時(shí)胚胎中心的初始卵裂區(qū)細(xì)胞體積小于后期卵裂細(xì)胞；EGK II 期生成16 個完全細(xì)胞化的卵裂球；EGK III 期的中心分裂區(qū)細(xì)胞比外圍細(xì)胞分裂速度更快，共形成128 個細(xì)胞，與此同時(shí)卵黃上部的細(xì)胞開始分層；EGK IV 期形成512 個細(xì)胞；EGK V 期細(xì)胞分裂速度較前期更為迅速，此時(shí)進(jìn)入快速卵裂期；EGK VI 期的細(xì)胞數(shù)約為8 000個，且卵黃上一般有5～6 層細(xì)胞；EGK VII 期細(xì)胞層開始與卵黃分離形成明區(qū)，未分離區(qū)域與卵黃粘連導(dǎo)致透明度較差的區(qū)域則為暗區(qū)；EGK VIII 期細(xì)胞層數(shù)不斷減少，到EGK IX 期明區(qū)顯著并擴(kuò)展，暗區(qū)也凸顯出來；EGK X 期胚胎的細(xì)胞數(shù)可達(dá)55 000 個，此時(shí)明區(qū)細(xì)胞層數(shù)逐漸減少至1～2 層，上層以單個細(xì)胞連續(xù)排列，下層細(xì)胞則不連續(xù)排列；靠近暗區(qū)的細(xì)胞仍然是多層的，與卵黃保持緊密接觸。明區(qū)細(xì)胞層與卵黃之間的空隙被稱為囊胚腔，此時(shí)的明區(qū)和暗區(qū)十分清晰（圖2）。

圖2 早期胚胎發(fā)育過程

4 早期胚胎發(fā)育分子機(jī)制

4.1 母源物質(zhì)清除 禽類中關(guān)于母源物質(zhì)清除存在2 種理論。第1 種理論認(rèn)為母源物質(zhì)的清除主要由母源因子調(diào)控，該理論中RNA 的清除有多種機(jī)制，如RNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)的RNA 降解、小RNA 誘導(dǎo)的mRNA 翻譯沉默、空間控制RNA 的清除和依賴N甲基腺苷的RNA 衰變；此外，還包括自噬-溶酶體途徑、泛素-蛋白酶降解途徑和內(nèi)吞作用3 種蛋白質(zhì)清除途徑。第2種理論則認(rèn)為母源物質(zhì)的清除主要由合子調(diào)控，即主要受合子的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物的控制。

4.2 ZGA 時(shí)期 在動物早期胚胎發(fā)育過程中，ZGA 一般會出現(xiàn)兩波，第1 波發(fā)生在受精后被稱為ZGA 小波，可以引起少量合子基因組的轉(zhuǎn)錄；第2 波一般在幾次卵裂之后出現(xiàn)稱為ZGA 大波，轉(zhuǎn)錄出大量合子基因組RNA。不同物種的ZGA 時(shí)間都有所不同，在人和小鼠早期胚胎發(fā)育過程中，ZGA 發(fā)生在8 細(xì)胞之前。早期研究利用RNA 聚合酶II C 末端結(jié)構(gòu)域磷酸化檢測，推測禽胚胎ZGA 的發(fā)生時(shí)期。最新研究中，通過對禽早期胚胎在母體內(nèi)發(fā)育各個階段測序，發(fā)現(xiàn)卵子-合子期、合子-EGK I 期及EGK I-EGK X 期這3大階段中的部分時(shí)期呈現(xiàn)基因表達(dá)差異（Differentially Expressed Genes，DEGs）。其中DEGs 在卵子-合子和EGK III-EGK VI 期改變最大，推斷禽ZGA 小波發(fā)生在卵子-合子期，而ZGA 大波發(fā)生在EGK IIIEGK VI 期（表1）。隨后研究也證實(shí)了禽類ZGA小波發(fā)生時(shí)期處于卵子-合子期，并將ZGA 大波發(fā)生時(shí)間區(qū)間細(xì)化到EGK IV-EGK V 期，并在后續(xù)時(shí)期中保持。

表1 禽胚胎在管道中發(fā)育DEGs 的表達(dá)[5]

4.3 早期胚胎發(fā)育相關(guān)分子機(jī)制 ZGA 很大程度上依賴于母源轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。在已知動物胚胎發(fā)育時(shí)期，對ZGA 發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子包括和。在禽類中，以及SOX3 在各時(shí)期的表達(dá)水平已被研究鑒定。和能夠維持胚胎干細(xì)胞的自我更新和多能性，并且起著調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用，在卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育的整個時(shí)期均表現(xiàn)為弱表達(dá)，而的表達(dá)量隨著胚胎發(fā)育時(shí)間的推移逐漸增高；具有DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、染色質(zhì)結(jié)合活性和蛋白質(zhì)異二聚體化活性等功能，在胚胎發(fā)育過程中，其表達(dá)量也逐漸增加，尤其是在ZGA 大波后（EGK V-EGK X 期）增加量變化顯著；在神經(jīng)組織中表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化，可以作為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的標(biāo)志物和神經(jīng)干細(xì)胞的重要標(biāo)記基因，但在禽類卵母細(xì)胞和早期胚胎中均不表達(dá)；是調(diào)控胚胎發(fā)育和決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在發(fā)育前期呈低水平表達(dá)，在EGK VIII-EGK X 期轉(zhuǎn)變?yōu)楦咚奖磉_(dá)。目前，許多轉(zhuǎn)錄因子尚未在鳥類基因組中發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究對特異性轉(zhuǎn)錄因子在ZGA 的表達(dá)與鑒定，及其在細(xì)胞分裂和分化中作用的評估都具有重要意義。

哺乳動物雌雄原核融合過程中將發(fā)生ZGA 小波，其雄原核激活比雌原核時(shí)間更早。但在家禽中，母方基因組在禽的ZGA 小波期間首先轉(zhuǎn)錄，如D和基因表達(dá)上調(diào)，而父方基因組保持沉默。研究顯示這些在禽類ZGA 小波中激活的母方基因與早期胚胎細(xì)胞分裂有關(guān)，父方基因組的轉(zhuǎn)錄抑制主要通過基因組蛋白的修飾實(shí)現(xiàn)。當(dāng)ZGA 大波開始后父方基因組被激活，胚胎發(fā)育由雙等位基因共同調(diào)控，這種雌原核先激活的調(diào)控機(jī)制，可防止禽類合子因多個雄原核的存在而可能產(chǎn)生的遺傳偏差。在ZGA過程中還涉及GO和KEGG功能富集通路（表2）。

表2 ZGA 涉及的GO 和KEGG 功能富集通路[5]

禽類早期胚胎發(fā)育中ZGA 過程涉及多種信號通路，這些途徑中的基因表達(dá)具有差異。NOTCH 信號通路中，和在合子中的表達(dá)高于EGK VI 期，而和在EGK VI 期的表達(dá)高于合子。WNT 信號通路中的和以及NOTCH 信號通路中的和在禽胚中差異表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞分裂及分層。在WNT 信號通路中，和在EGK VI 期中的表達(dá)相較于合子更高，而和在合子與EGK VI 期中的表達(dá)水平相當(dāng)，并且WNT 配體和受體相關(guān)基因和從合子開始上調(diào)，并在EGK VI 期后開始下調(diào)，而和則 在EGK VI-EGK VIII 期上調(diào)。MAPK 信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)與早期胚胎的有絲分裂有關(guān)，其中和在合子中的表達(dá)高于EGK VI 期，而和在合子和EGK VI 期的表達(dá)相當(dāng)。TGF-信號通路中，和在EGK VI 期的表達(dá)顯著高于合子（表3）。與哺乳動物相比，NOTCH 信號通路中的和在禽的各個階段均參與表達(dá)，但在人和小鼠中沒有表達(dá)；激酶、和在哺乳動物的早期分裂中表達(dá)較低，主要在分裂期表達(dá)；在TGF-家族中，僅在禽胚胎明區(qū)形成期特異性表達(dá)，而在哺乳動物的胚胎發(fā)育后期才表達(dá)。

表3 禽類卵裂過程基因表達(dá)的動態(tài)變化[53]

表觀遺傳學(xué)修飾是胚胎發(fā)育的基礎(chǔ)，其中能編碼持續(xù)型甲基化轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)DNA 復(fù)制后的子鏈DNA 甲基化，參與細(xì)胞增殖調(diào)控。在禽早期胚胎中，在合子-EGK VI 期上調(diào)并在EGK VIII 期開始下調(diào)，表達(dá)的動態(tài)變化使得早期胚胎發(fā)育中基因組甲基化的水平不斷改變，從而調(diào)控胚胎發(fā)育所需基因的表達(dá)。和是從頭甲基化酶，對多能干細(xì)胞的干性維持具有重要作用，和在EGK VIII-EGK X 期上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)和在合子-EGK VI 期下調(diào)并在EGK VIII 開始上調(diào)，組蛋白H3 乙?；嚓P(guān)的基因在合子-EGK VI 期上調(diào)，在EGK VIII 期開始下調(diào)。

5 禽胚胎體外發(fā)育及基因表達(dá)調(diào)控

禽胚在體外發(fā)育，中樞神經(jīng)系統(tǒng)在最開始就被誘導(dǎo)發(fā)育、接下來啟動血管發(fā)育。根據(jù)Hamburger and Hamilton 制定的禽蛋產(chǎn)出發(fā)育標(biāo)準(zhǔn)（HH），可以將產(chǎn)出后48 h 分為HH1-12 期。轉(zhuǎn)錄抑制因子（Positive Regulatory Domain 1，PRDM1）能夠決定胚胎發(fā)育時(shí)期細(xì)胞命運(yùn)并調(diào)控組織器官發(fā)育，尤其在神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮重要調(diào)控作用。在HH4 期，出現(xiàn)在胎盤前區(qū)域和神經(jīng)板邊界的細(xì)胞中，HH5 期其表達(dá)上調(diào)，HH7 期其延伸到外胚層和中胚層。此外，和這7種與相關(guān)的基因在禽胚中表達(dá)。禽類的血管系統(tǒng)起源于中胚層，位于原條后側(cè)的中胚層前體中的細(xì)胞受到包括BMP、FGF 和WNT 等途徑調(diào)節(jié)分化為血液、血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞。在HH7 期，血島中一些細(xì)胞已開始表達(dá)分化為紅細(xì)胞；到HH10 期，早期血管母細(xì)胞標(biāo)志物和造血標(biāo)志物開始局限在血細(xì)胞中表達(dá)，而早期血管母細(xì)胞標(biāo)志物和血管標(biāo)志物將標(biāo)記內(nèi)皮血管細(xì)胞系。

6 小結(jié)和展望

隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展和禽類胚胎發(fā)育生物學(xué)的不斷完善，關(guān)于禽早期胚胎發(fā)育規(guī)律及分子機(jī)制逐漸被解析，但仍存在很多問題尚未得到闡述，禽類屬于多精子入卵的動物，其中的調(diào)控機(jī)制并不清楚。卵子受精以后，基因表達(dá)模式的改變、信號通路的激活和啟動早期胚胎發(fā)育等事件，促進(jìn)了新生命的起始和發(fā)育，一直是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。禽類作為胚胎發(fā)育研究的理想的動物模型，其分子機(jī)制對推動養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展和鳥類胚胎發(fā)育具有重要意義。本文主要對禽早期胚胎發(fā)育過程中的各階段主要事件進(jìn)行闡述和總結(jié)，探究其中的分子機(jī)制及其之間的聯(lián)系，有利于更好地推進(jìn)禽早期胚胎發(fā)育分子機(jī)制的研究，為完善禽類胚胎發(fā)育機(jī)制奠定基礎(chǔ)。