獅子山礦區(qū)重金屬污染農(nóng)田土壤細(xì)菌群落分析

摘 要：該研究采用單因子指數(shù)法和尼梅羅綜合污染指數(shù)法評價(jià)農(nóng)田重金屬污染程度，測定土壤相關(guān)酶活，并采用16s rDNA Illumina高通量測序技術(shù)，對銅陵市獅子山礦區(qū)周圍受重金屬污染農(nóng)田細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了分析，以期了解銅陵獅子山礦區(qū)受重金屬污染農(nóng)田的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌種。結(jié)果表明，該地區(qū)農(nóng)田土壤中銅、鋅、砷、鎘含量很高，屬于重金屬嚴(yán)重污染。農(nóng)田土壤中過氧化氫酶、酸性磷酸酶和脲酶活性高，土壤酶活與重金屬之間具有較好的相關(guān)性，不同元素的重金屬對酶活的響應(yīng)不同。高通量測序結(jié)果顯示，屬于Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Acidobacteria門的序列總和占全部序列的80.11%，是門水平上的優(yōu)勢菌種。在屬水平上，Arthrobacter具有相對較高的豐度，為優(yōu)勢菌種。研究結(jié)果顯示，銅陵礦區(qū)重金屬嚴(yán)重污染情況下，土壤細(xì)菌仍具有較高的活性和多樣性，為篩選具有重金屬抗性的優(yōu)勢菌種提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：土壤;重金屬;酶;細(xì)菌

中圖分類號 X53 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2022）11-0109-06

Analysis on Bacterial Community of Soil in Farmland Contaminated by Heavy Metals in Shizishan Mining Area

LI Yang

（Anhui Guozhen Environmental Restoration Co.， Ltd.， Hefei 230093， China）

Abstact： In this paper， single factor index and Niemelo comprehensive pollution index method were applied to evaluate the degree of heavy metal pollution in farmland， the soil enzyme activities were determine， 16S rDNA Illumina high-throughput sequencing was used to analyze the bacteria community diversity of heavy metal contaminated farmland， in order to understand the bacterial community structure and dominant species of heavy metal contaminated farmland in the Shizishan mining area in Tongling. The results showed that the content of copper， zinc， arsenic and cadmium in farmland soils in this area was very high， which was seriously polluted by heavy metals. The activities of catalase， acid phosphatase and urease in the soil were high， soil enzyme activity and heavy metals had a good correlation， different elements of heavy metals on the enzyme activity in response to different. The sequence of Proteobacteria， Chloroflexi， Actinobacteria and Acidobacteria accounted for 80.11% of the total sequence， which were the dominant species at the door level. At the genus， Arthrobacter had a relatively high abundance and which was the dominant species. Although soil heavy metal pollution were serious， that soil bacteria still had high activity and diversity and could provide the basis for screening heavy metal resistance bacteria.

Key words： Soil; Heavy metal; Enzyme; Bacterial

1 引言

隨著工業(yè)發(fā)展，我國土壤重金屬污染日趨嚴(yán)重，尤其是礦區(qū)附近土壤[1]。含有重金屬的污染物進(jìn)入土壤，不僅會降低土壤質(zhì)量，也會危害人類健康[2]。土壤微生物數(shù)量大，種類繁多，在土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定中扮演著十分重要的角色[3]。土壤微生物對重金屬脅迫的響應(yīng)要比同一環(huán)境中的動(dòng)物和植物更加靈敏，在重金屬脅迫下，土壤微生物從數(shù)量、活性、群落結(jié)構(gòu)以及多樣性等方面作出復(fù)雜的響應(yīng)[4]。

獅子山礦區(qū)位于安徽省銅陵市東郊約7km，是長江中下游礦帶最大的銅礦田，也是我國重要的銅資源生產(chǎn)基地之一。由于常年的礦山開發(fā)，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，Cd、Pb、Zn、Cu、As等是該地區(qū)主要的重金屬污染元素，且污染正在逐漸加劇[5]。已有研究報(bào)道指出，礦區(qū)附近土壤由于長期受高濃度多重金屬脅迫，土壤微生物作出復(fù)雜的響應(yīng)。張雪晴等[6]指出隨著礦區(qū)土壤重金屬綜合污染程度加大，土壤微生物多樣性和酶活隨之降低;郭建華等[7]試驗(yàn)結(jié)果表明，礦區(qū)附近受重金屬污染的土壤微生物多樣性并不簡單地隨污染程度加大而降低。目前，對于獅子山礦區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性以及長期受重金屬脅迫的農(nóng)田土壤中優(yōu)勢菌種還缺少報(bào)道，因此明確該地區(qū)土壤中的優(yōu)勢細(xì)菌群落對于篩選重金屬抗性菌種以及促進(jìn)重金屬污染生物修復(fù)等研究具有重要意義。

重金屬通過誘導(dǎo)活性氧自由基產(chǎn)生，進(jìn)而對微生物體造成產(chǎn)生不同程度的損傷，是重金屬致毒的重要途徑[8]。由于活性氧自由基的壽命短、檢測困難，通過采用測定土壤酶活性來推測機(jī)體所受氧化脅迫程度[9]。礦區(qū)附近土壤微生物由于長期受高濃度重金屬脅迫，譚林立等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Cd、Pb對土壤脲酶活性均有一定抑制作用，對脫氫酶有顯著抑制作用;王偉等[11]在研究汞污染對葡萄—土壤系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在低Hg污染條件下，土壤堿性磷酸酶、過氧化氫酶和蔗糖酶活性均有一定增加，而土壤脲酶活性卻顯著下降;在高Hg污染下，4種土壤酶活性均出現(xiàn)下降趨勢。羅虹、曹靖等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤被Cu、Cd等多種重金屬復(fù)合污染時(shí)，重金屬會對土壤磷酸酶、脲酶等產(chǎn)生一定的激活作用[12-13]。由此可以看出，重金屬污染對土壤酶的活性會造成影響，但二者并不是簡單的線性關(guān)系，且不同的土壤酶活對不同金屬的響應(yīng)也有所不同。

目前，關(guān)于土壤微生物多樣性已有多種成熟的研究方法，包括傳統(tǒng)的分離純培養(yǎng)和稀釋平板計(jì)數(shù)、氯仿熏蒸法、Biolog微平板法、PCR-DGGE法、磷脂脂肪酸法（PLFA）以及新一代高通量測序和基因芯片技術(shù)[14-17]。楊元根等利用氯仿熏蒸法對城市和農(nóng)村的土壤微生物量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)重金屬含量較高的城市土壤微生物量較農(nóng)村土壤相對減少，但微生物呼吸強(qiáng)度和生理活動(dòng)卻顯著高于重金屬含量低的農(nóng)村土壤[18];陳欣瑤等采用磷脂脂肪酸法對受重金屬脅迫的土壤微生物進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)重金屬脅迫對AM真菌的多樣性和均勻性有明顯抑制作用，減弱了其抵抗外界脅迫的能力[19]。以高通量技術(shù)為代表的新一代測序技術(shù)憑借低成本、高通量、流程自動(dòng)化等優(yōu)勢為研究微生物群落結(jié)構(gòu)提供了新的技術(shù)平臺，該方法也廣泛應(yīng)用于重金屬污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析[1，20，21]。Marcin等用16s rDNA焦磷酸測序來分析重金屬污染土壤中的細(xì)菌群落，發(fā)現(xiàn)Zn顯著降低了土壤細(xì)菌多樣性及其豐度[1];丁傳雨[20]等用16s rRNA Illumina分析能源植物修復(fù)鎘污染土壤過程中的細(xì)菌群落，發(fā)現(xiàn)Cd的添加對Gemmatimonas、Flavisolibacter等細(xì)菌的相對豐度有影響。銅陵獅子山礦區(qū)現(xiàn)有的研究主要是針對其土壤中重金屬的特性和耐性植物以及生態(tài)退化的現(xiàn)狀[22-23]。而對于該礦區(qū)農(nóng)田土壤的優(yōu)勢菌種還缺少報(bào)道。基于此，本研究選用銅陵獅子山礦區(qū)周邊農(nóng)田土壤，評價(jià)重金屬污染程度，分析土壤酶活性，并采用16s rDNA Illumina高通量測序技術(shù)，分析該地區(qū)農(nóng)田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其優(yōu)勢菌種，為篩選具有重金屬抗性的優(yōu)勢菌種提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 土壤樣品采集 土壤樣品于2020年5月16日采集于安徽省銅陵市獅子山尾礦礦區(qū)附近一塊較大農(nóng)田，主要農(nóng)作物為油菜。經(jīng)緯度為N30°55′14.31"，E117°53′20.75″，每隔1km設(shè)1個(gè)采樣區(qū)，共設(shè)3個(gè)取樣區(qū)，每區(qū)10個(gè)采樣點(diǎn)，利用內(nèi)徑5cm的PVC管，采集耕作層土壤（0～20cm），將每區(qū)采集土樣混合成1個(gè)樣品，分別編號為S1、S2和S3。將每個(gè)混合樣品一分為二，一份立即用于土壤細(xì)菌分析，另一份自然風(fēng)干后用于各項(xiàng)理化性質(zhì)和土壤酶活的測定[24]。

2.2 理化性質(zhì)測定 準(zhǔn)確稱取風(fēng)干樣0.5g（精確到0.0001g）于聚四氟乙烯消煮管中，采用HCl-HNO3-HF-HClO4四酸消解法于全自動(dòng)石墨爐消解儀中進(jìn)行消解，電感耦合等離子發(fā)射光譜儀ICP-AES測定土壤中Cu、Zn、As、Pb、Cd的含量。土壤堿性有效氮采用堿解擴(kuò)散法[25];速效磷和速效鉀分別采用Olsen法和1mol/L中性醋酸銨浸提火焰光度計(jì)法測定;土壤pH采用水土比為2.5∶1進(jìn)行測定[26]。

2.3 土壤重金屬污染評價(jià)方法 采用單因子指數(shù)法（Pi）和尼梅羅綜合污染指數(shù)法（Pc）[24]。

2.3.1 單因子指數(shù)法 單因子指數(shù)計(jì)算公式為：

[Pi=Ci/Si] （1）

式中，Pi為土壤中金屬i的環(huán)境質(zhì)量指數(shù);Ci為金屬i的實(shí)際測量值（mg·kg-1）;Si為土壤中重金屬i的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)值（mg·kg-1）（GB 15618─1995）。試供樣品為農(nóng)田土壤，執(zhí)行土壤環(huán)境質(zhì)量二級標(biāo)準(zhǔn)。該方法可以直觀反映出各污染物的污染程度，而不能全面、綜合地反映土壤污染程度[27]。

2.3.2 尼梅羅綜合污染指數(shù)法 尼梅羅綜合污染指數(shù)計(jì)算公式為：

[Pc=[（Ci/Si）2max+（Ci/Si）2ave]/2] （2）

式中，（Ci/Si）max為土壤污染指數(shù)的最大值;（Ci/Si）ave為土壤污染指數(shù)的平均值。綜合污染指數(shù)法的土壤分類標(biāo)準(zhǔn)如下：0.7

2.4 土壤酶活性的測定 土壤酶活采用風(fēng)干土樣[28]，選用南京建成試劑盒測定土壤過氧化氫酶、酸性磷酸酶以及脲酶活性，使用紫外分光光度法，按試劑盒步驟進(jìn)行操作，分別于240nm[29]、660nm、578nm[30]波長處測定其吸光度。

2.5 土壤總DNA的提取與純化 土壤總DNA的提取采用PowerSoil DNA Isolation Kit（MO BIO，USA）試劑盒，按照說書的提取步驟進(jìn)行，將提取到的土壤總DNA使用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop檢測DNA純度和濃度。

2.6 高通量測序 土壤DNA適當(dāng)稀釋后作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用引物（515F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′;806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對細(xì)菌16S rDNA的V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，片段長度約為300 bp，PCR反應(yīng)體系為60μL，其中包含10x Ex Taq Buffer 6μL、dNTP 6μL、BSA 0.6μL、Ex Taq 0.3μL、Primer F 1.2μL、Primer R 1.2μL、DNA 1μL，補(bǔ)ddH2O至60μL。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃、5min，94℃、30s，52℃、30s，72℃、45s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，循環(huán)完成后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度，將各樣品進(jìn)行等濃度混樣，利用Illumina Hiseq2500，PE·250測序平臺對樣品進(jìn)行測序。本次高通量測序委托廣州美格生物科技有限公司進(jìn)行測序。

2.7 數(shù)據(jù)分析 高通量數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析采用Qiime（Quantitative Insights into Microbial Ecology），對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接及質(zhì)控以獲取擴(kuò)增片段，對拼接結(jié)果進(jìn)行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類及物種注釋以獲得每個(gè)樣品OTUs分布及物種信息[28]。基于以上信息對樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析，對物種的多樣性及豐富度進(jìn)行分析。每個(gè)樣品所得微生物數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)均一化后顯示。重金屬數(shù)據(jù)分析和相關(guān)圖表制作在Excel 2010中進(jìn)行，相關(guān)性分析在SPSS中進(jìn)行。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤理化性質(zhì)及重金屬含量 土壤各項(xiàng)理化性質(zhì)如表1所示，土壤樣品重金屬濃度及污染指數(shù)如表2所示。從表1可以看出，3個(gè)平行土壤樣品均為酸性土壤。從表2可以看出，土壤樣品的綜合污染指數(shù)均在3以上，屬于嚴(yán)重污染。其中，Cu、Cd、As3種元素的單因子污染指均在5左右，屬于嚴(yán)重污染;Zn的濃度是土壤環(huán)境質(zhì)量二級標(biāo)準(zhǔn)的0.8～1.8倍;土壤Pb濃度最低，未超過標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 土壤酶活及與重金屬污染之間的相關(guān)性 土壤過氧化氫酶（S-CAT）、酸性磷酸酶（S-ACP）和脲酶（S-UE）的活性如表3所示。其中脲酶活性最高，酸性磷酸酶次之，過氧化氫酶活性相對較低。從表4可以看出，土壤脲酶與Cu、Cd呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與As、Pb呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與Zn未達(dá)到顯著水平。酸性磷酸酶與Cu呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與Zn、As呈顯著正相關(guān)（P<0.05），Cd呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與Pb未達(dá)到顯著水平。過氧化氫酶與Zn、Pb呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與Cd呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與As未達(dá)到顯著水平。由上可見，同一種土壤酶活對于不同種重金屬元素，同一種元素對于不同酶活之間均會表現(xiàn)出不同的響應(yīng)。其中，Cd對于3種酶活性均產(chǎn)生一定的刺激作用，除Cu以外的4種元素均對酸性磷酸酶活性產(chǎn)生一定的刺激作用。

3.3 高通量測序結(jié)果 高通量測序結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)樣品的文庫覆蓋率在99%以上，可較全面地反映土壤細(xì)菌的種類和結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)樣品的平均序列條數(shù)為161941，OTUs平均數(shù)為4220。由圖1可知，3個(gè)樣品稀釋曲線趨于平坦，說明本研究中3個(gè)樣品測序數(shù)據(jù)量合理。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)土壤樣品中細(xì)菌有9個(gè)門，包括Proteobacteria（變形菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）、Verrucomicrobia（疣微菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Gemmatimonadetes（芽單胞菌門）、Planctomycetes（浮霉菌門）、Nitrospirae（硝化螺旋菌門）（圖2）。其中，Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Acidobacteria 4個(gè)門的序列總和占全部序列的80.11%。為了進(jìn)一步揭示土壤樣品中微生物的組成結(jié)構(gòu)，分析了樣品在屬水平上相對豐度大于0.1%的物種相對豐度（圖3）。由圖3可知，相對豐度大于0.1%的物種僅有13種，其中包括Arthrobacter（節(jié)桿菌屬）、Anaerolinea（厭氧繩菌屬）、Bradyrhizobium（短根瘤菌屬）、Streptomyces（鏈霉菌屬）、Rhodoplanes（紅游動(dòng)菌屬）以及Rubrivivax（紅長命菌屬）等。在屬水平上，物種的豐度都相對較低，但Arthrobacter表現(xiàn)出了相對較高的豐度，占全部序列的4.19%。

4 討論

根據(jù)單因子指數(shù)法，該地區(qū)土壤中Cu、Zn、As、Cd元素超出了國家二級標(biāo)準(zhǔn)幾倍，屬于重金屬污染;根據(jù)尼梅羅綜合指數(shù)評價(jià)法，該地區(qū)屬于重金屬嚴(yán)重污染，這與現(xiàn)有對該地區(qū)重金屬污染研究結(jié)果顯示一致[31-32]。污染的主要原因?yàn)榈V區(qū)長年開采，以及在開發(fā)和冶煉金屬過程中產(chǎn)生的尾礦、礦渣和酸性廢水。該地區(qū)土壤長期受重金屬污染，土壤微生物的活性因此受到了一定程度的抑制或激活。土壤微生物活性與土壤酶活密切相關(guān)。重金屬的濃度效應(yīng)是決定對土壤酶活的關(guān)鍵，且單一重金屬和重金屬復(fù)合污染對酶活會表現(xiàn)出不同的響應(yīng)[33]。有研究指出，在單一Pb污染下，土壤酸性磷酸酶活性隨著Pb濃度增加而降低，而土壤脲酶呈相反變化。單一Cd污染下，2種酶活效應(yīng)與Pb呈相反趨勢。Pb、Cd復(fù)合污染條件下，脲酶和酸性磷酸酶活性均隨重金屬濃度增加而減小[34]。重金屬對過氧化氫酶的影響報(bào)道不一致，如Belyaeva等的研究表明過氧化氫酶活性受重金屬的影響較小，而Khan等的研究報(bào)道則為過氧化氫酶活性在Cd、Pb的濃度成正比。本研究中，供試土壤中Pb濃度低而Cd濃度高，與上述研究中Pb、Cd單一污染條件下酶活呈相反的趨勢，這可能是多種重金屬復(fù)合污染共同作用所體現(xiàn)的結(jié)果，也可能是由于該地區(qū)長期耕作使植物的根際微生物發(fā)生了改變[35-38]。同時(shí)土壤是一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境，因此非生物等外界條件也會在一定程度上影響土壤酶活和微生物[39]。

目前，對于該礦區(qū)的細(xì)菌多樣性以及優(yōu)勢菌群的研究還鮮見報(bào)道，對該地區(qū)已有的研究主要集中在土壤中重金屬特性以及生態(tài)退化的現(xiàn)狀[5，32]。本研究結(jié)果表明，在該地區(qū)長期受重金屬脅迫的土壤中，微生物多樣性相對不高，但優(yōu)勢菌群相對較多，可能是這些菌種在重金屬長期脅迫下產(chǎn)生了抗性[40]。張漢波等[41]研究發(fā)現(xiàn)，Arthrobacterjie（節(jié)桿菌屬）對Pb、Zn、Cd都具有抗性，其中對Pb的抗性最強(qiáng);肖煒等[42]發(fā)現(xiàn)Proteobacteria（變形菌門）對Pb、Cd表現(xiàn)出了很強(qiáng)的耐受性;謝學(xué)輝[43]在研究中指出Chloroflexi（綠彎菌門）對Cu、Zn具有一定的抗性;馮淏[44]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）對鉻具有非常強(qiáng)的耐受性，在修復(fù)鉻污染方面具有非常大的潛力。本研究發(fā)現(xiàn)Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Acidobacteria等4個(gè)門以及Arthrobacterjie節(jié)桿菌屬屬于該地區(qū)優(yōu)勢菌種，這些菌種在各種研究文獻(xiàn)記載中發(fā)現(xiàn)對一種或多種重金屬具有耐受性。這些微生物可能具有某些特殊功能，能夠耐受重金屬脅迫。另外，該地區(qū)的土壤表現(xiàn)為酸性，可能與土壤中重金屬共同作用使微生物產(chǎn)生了抗性[45]。因此，本研究對于篩選重金屬抗性菌株具有一定的意義，為篩選重金屬抗性菌株提供了一定的依據(jù)[46-47]。但是，這些菌種對重金屬的抗性機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[48-49]。

5 結(jié)論

采用單因子指數(shù)法和尼梅羅綜合指數(shù)法評價(jià)銅陵獅子山礦區(qū)受重金屬污染的農(nóng)田，該研究區(qū)域農(nóng)田污染的重金屬元素為Cu、Zn、As、Cd，屬于重金屬嚴(yán)重污染。由于農(nóng)田長期耕作，該研究區(qū)域過氧化氫酶、酸性磷酸酶和脲酶活性高。高通量測序結(jié)果表明在細(xì)菌門水平上，該研究區(qū)域優(yōu)勢菌種為變形菌門Protebacteria、綠彎菌門Chloroflexi、酸桿菌門Acidobacteria和放線菌門Actinobacteria;在屬水平上Arthrobacter為優(yōu)勢菌種。

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作者簡介：李陽（1990—），男，安徽合肥人，工程師，研究方向：土壤修復(fù)。? 收稿日期：2022-02-05