小鼠原位肺癌模型構(gòu)建及在放射治療研究中的意義

劉振宇,王宏偉

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院放射治療科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

WHO、Globcan 2020統(tǒng)計(jì)報(bào)道2020年肺癌新發(fā)病例2206771例，占比約11.4%，是2020年癌癥病發(fā)率的第二位，而肺癌死亡病例為1796144例，占比約18%，病死率排第一位。盡管手術(shù)、放療、化療和靶向治療取得了很大進(jìn)展，但由于在診斷時(shí)大多數(shù)患者已局部晚期或出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，預(yù)后仍然較差，5年生存率僅為15%[1]。醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究的重要組成部分，更是臨床實(shí)驗(yàn)及治療的理論依據(jù)和基礎(chǔ)。理想的動(dòng)物模型應(yīng)該具備動(dòng)物來源容易、操作簡單、定位準(zhǔn)確、重復(fù)性好、腫瘤組織學(xué)類型、生物學(xué)特征與人類相近、所需周期較短、移植成功率高等特點(diǎn)。C57BL/6小鼠除了具備上述特點(diǎn)，還有價(jià)格低廉、耐受性強(qiáng)、模型成熟、免疫功能正常的優(yōu)勢[2]。小鼠肺臟在生物特性、分子特征方面和人類具有相似性，幾乎能找到所有人類同源基因[3]。周足力等[4]用免疫缺陷裸鼠荷人源肺惡性腫瘤的建模成功率是29.65%，腫瘤生長達(dá)500 mm3所用平均成瘤時(shí)間約32～237 d，該模型雖在臨床藥物實(shí)驗(yàn)及還原人類肺癌基因型發(fā)揮了一定作用，但成瘤時(shí)間長且成瘤率較低，仍需加以改進(jìn)以提高臨床實(shí)用性。為驗(yàn)證原位小鼠肺癌模型的可行性和穩(wěn)定性，以及在活體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的情況下直觀觀察腫瘤生長特性及侵襲性，本實(shí)驗(yàn)以LLC小鼠肺癌細(xì)胞系直接經(jīng)皮穿刺原位接種于10只C57BL/6小鼠肺內(nèi)，并以肺部磁共振成像(MRI)的方法直觀檢驗(yàn)。原位移植模型腫瘤侵襲特征及組織病理學(xué)、生物學(xué)特性,是一種接近肺癌患者的模型,為肺癌放射治療等研究提供良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑與器材：小鼠肺癌細(xì)胞系(LLC細(xì)胞系)。用“四季青”新生牛血清(批號(hào)：19120103)，GE公司DMEM/HIGHGLUCOSE基礎(chǔ)培養(yǎng)基(批號(hào)：AF29498406),配置含10%血清DMEM/HIGHGLUCOSE基礎(chǔ)培養(yǎng)基加1%雙抗(100 U/ml青霉素,100 μg/ml鏈霉素)。置于37 ℃、5%CO2混合氣體培養(yǎng)箱。水合氯醛溶液、磷酸鹽平衡生理鹽水溶液(PBS平衡鹽液)、0.25%胰酶(GE公司)、培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)、熒光顯微鏡等均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)萬方教授團(tuán)隊(duì)腫瘤實(shí)驗(yàn)室提供。磁共振成像設(shè)備及技術(shù)支持由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院影像科提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:無特定病原體(SPF)級(jí)C57BL/6小鼠，6～8周，雌性，體重約22 g，共10只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)飼養(yǎng)間并進(jìn)行無菌手術(shù)操作。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)科研中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室批準(zhǔn)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：LLC細(xì)胞系經(jīng)由公司發(fā)貨干冰運(yùn)輸隔天到，密封完好，給予-80 ℃冰箱保存；隔日復(fù)蘇，置于含10%血清、1%雙抗的DMEM/HIGHGLUCOSE基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，放于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，每2天換液處理，約每3 d進(jìn)行消化傳代一次。細(xì)胞匯合率達(dá)80%傳代培養(yǎng)(圖1)。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立：細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)及配制2×107個(gè)/ml，LLC細(xì)胞無血清懸液0.2 ml，在SPF級(jí)手術(shù)間操作，腹腔注射濃度為4%的水合氯醛溶液麻醉(麻醉用量為小鼠體重的1%)，小鼠右側(cè)臥位，定位于小鼠左側(cè)腋下以碘伏消毒并備皮，再次消毒后行1 cm切口，鈍性分離至肋骨表面，可見明顯呼吸及肺臟活動(dòng)，在肋骨上緣1 ml注射器垂直穿刺約3 mm，緩慢注射細(xì)胞懸液約50 μl并停留3～5 s迅速拔針，觀察數(shù)秒是否氣胸形成，呼吸如常，碘伏再次消毒以細(xì)絲線單純間斷縫合2針。將手術(shù)后小鼠放置鼠籠，觀察至心肺活動(dòng)及進(jìn)食水正常。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞生長情況 體外培養(yǎng)LLC細(xì)胞系鏡下呈現(xiàn)出梭形，并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)體外細(xì)胞第3天出現(xiàn)快速增長，并且在25 cm2卡瓶中匯合率達(dá)80%，可進(jìn)行1∶2傳代培養(yǎng)(圖1)。

2.2 動(dòng)物MRI影像學(xué)表現(xiàn) 實(shí)驗(yàn)小鼠自移植腫瘤后每7天行MRI掃描，每次MRI參數(shù)一致并使用同一線圈。圖2為移植第21天后影像學(xué)圖像示左側(cè)肺內(nèi)多個(gè)邊界尚清、混雜信號(hào)的不規(guī)則腫塊影、多層面顯示氣管及血管受侵征象、縱膈淋巴結(jié)融合影，對(duì)側(cè)肺臟可見有明顯數(shù)量不等轉(zhuǎn)移灶，影像信號(hào)似人類肺腫瘤顯示，未發(fā)現(xiàn)肝臟腎臟異常信號(hào)影。解剖后證實(shí)位置及大小同影像學(xué)表現(xiàn)。

圖2 移植第21天實(shí)驗(yàn)鼠MRI成像

2.3 小鼠生存指標(biāo) 10只小鼠體重均值在接種細(xì)胞約13 d后出現(xiàn)持續(xù)下降趨勢。小鼠模型在做MRI掃描全部存活，生命狀態(tài)尚穩(wěn)定，經(jīng)麻醉后頸脫處死。

2.4 病理學(xué)報(bào)告 形態(tài)與原代體外細(xì)胞形態(tài)相似，程長梭形，核幼稚，細(xì)胞核深染，核異型性明顯，排列雜亂緊密，與鄰近肺組織特征完全不同(圖3)。

圖3 腫瘤組織切片(左圖：HE染色×40；右圖：HE染色×20)

3 討 論

3.1 不同肺癌動(dòng)物模型優(yōu)缺點(diǎn) 目前常用的肺癌小鼠模型有：化學(xué)誘導(dǎo)模型、移植模型、轉(zhuǎn)基因模型等[5]。其中移植模型按移植細(xì)胞來源分為鼠源—同種移植模型和非鼠源—異種移植模型，最多來源是人源肺癌細(xì)胞；按移植部位可分為原位和非原位，原位模型有經(jīng)氣道移植，經(jīng)皮移植等，非原位模型最多見為前胸部皮下、背部及腹部皮下等。

化學(xué)誘導(dǎo)的肺癌動(dòng)物模型與移植模型、轉(zhuǎn)基因模型相比，由于其易應(yīng)用，更接近癌癥發(fā)生的因果聯(lián)系，尤其是最接近人類肺癌形成、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的方案，是研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的最佳選擇。另外，有多項(xiàng)研究報(bào)道，不同化學(xué)物可誘導(dǎo)出不同分型的肺腫瘤[6]。為研究化學(xué)誘導(dǎo)的肺腺癌發(fā)生的細(xì)胞和分子變化，Spella等[7]通過腹腔注射煙草致癌物氨基甲酸酯10周，開發(fā)了C57BL/6小鼠肺腺癌模型。NNK用于誘導(dǎo)腺癌[8]。N-亞硝基-三氯乙基脲(NTCU)促進(jìn)鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展[9]。Mervai等[10]通過在FVB/N小鼠菌株中使用二乙基亞硝胺誘導(dǎo)腺癌，開發(fā)了一種新的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)動(dòng)物模型。吳逸明等[11]采用煤-焦瀝青(CTP)支氣管灌注的方法,誘發(fā)大鼠肺癌動(dòng)物模型。歷時(shí)實(shí)驗(yàn)6個(gè)月余僅出現(xiàn)少部分原位腫瘤，時(shí)間耗時(shí)長，成本大且造模成功率低。隨后的研究中魯植艷[12]改進(jìn)方法，以改制的 ZY 型12號(hào)腰穿針插入左下葉支氣管與傳統(tǒng)的呼吸道給藥方法，對(duì)比造模時(shí)間明顯縮短，成功率明顯提高，但相對(duì)操作復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)水平要求較高。

移植模型中異位移植模型是肺癌實(shí)驗(yàn)研究階段首選的動(dòng)物模型，由于造模操作簡單，對(duì)于臨床藥物開發(fā)及藥物毒理等研究方面具有不可替代的意義。馬雪曼等[13]在進(jìn)行異位移植與原位移植造模對(duì)比研究中得出顯著結(jié)論，雖然原位移植腫瘤操作難度稍大，但成功率無明顯差異，并且原位移植動(dòng)物模型在其他臟器轉(zhuǎn)移方面的研究有著不可替代的作用。原位移植模型在腫瘤微環(huán)境方面研究也具有重要意義。在臨床工作中，臨床分期為Ⅰ期、Ⅱ期的惡性腫瘤均可以手術(shù)完全切除，但很多患者仍因發(fā)生轉(zhuǎn)移而致死致殘[14]。本次實(shí)驗(yàn)小鼠原位肺癌動(dòng)物模型構(gòu)建中我們可以觀察到腫瘤轉(zhuǎn)移的過程，與人類腫瘤轉(zhuǎn)移方式非常相似，為構(gòu)建更多臟器的轉(zhuǎn)移瘤模型提供了參考，也為放射治療開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究提供更優(yōu)平臺(tái)。文獻(xiàn)報(bào)道原位移植模型中經(jīng)氣道移植腫瘤，存在明顯不足，實(shí)驗(yàn)周期長、操作難度大、小鼠手術(shù)創(chuàng)傷大，存活期短等問題不可忽略[15]。異種原位移植中，人源異種移植可以很好的體現(xiàn)患者原有腫瘤的生物學(xué)特性[4]，是最能體現(xiàn)其腫瘤異質(zhì)性并且是可以提供患者個(gè)性化用藥的基礎(chǔ)模型。但是，由于人源肺癌移植動(dòng)物模型應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須是免疫抑制小鼠，在研究免疫藥物方面具有一定的局限性。

轉(zhuǎn)基因模型中有代表性的是小鼠小細(xì)胞肺癌模型[16]，該模型再現(xiàn)了人類小細(xì)胞肺癌的關(guān)鍵特征，包括組織病理學(xué)外觀，關(guān)鍵神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物的表達(dá)和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散模式。佘佐亞等[17]用帶有綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因構(gòu)建小鼠肺癌模型，雖然22周后得到100%的造模成功率，但表現(xiàn)出明顯不足，就是在長時(shí)間誘癌過程中,動(dòng)物早期染毒感染率高，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率高,達(dá)到60% (30/50) 。轉(zhuǎn)基因模型從腫瘤進(jìn)展，以及對(duì)不同類型腫瘤的控制都有優(yōu)勢，但綜合分析操作難度、生存期、造模周期、個(gè)體對(duì)腫瘤免疫反應(yīng)及腫瘤微環(huán)境方面，鼠源肺原位移植動(dòng)物模型是在放射治療中最佳的選擇。

3.2 肺癌原位動(dòng)物模型的構(gòu)建及在放射治療中動(dòng)物模型的意義 從動(dòng)物模型的角度出發(fā)，近年來有大量研究表明腫瘤細(xì)胞對(duì)腫瘤微環(huán)境的塑造及調(diào)節(jié)有不可忽略的作用，腫瘤微環(huán)境(TME)期初由 Ioannides提出，TME在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移等方面有顯著影響，而且也在對(duì)腫瘤細(xì)胞自身生長的限制有明顯作用[18]。并且賀春艷等[19]研究發(fā)現(xiàn)NSCLC組織與癌旁組織對(duì)比肺癌基因如缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-α)的表達(dá)明顯升高，并且與腫瘤生長直徑等密切相關(guān)。岳英等[20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出結(jié)論： NSCLC 患者免疫微環(huán)境中多種免疫細(xì)胞包括CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、PD-L1蛋白參與腫瘤的生長，并促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。這有力的表明原位模型可以通過不同分型的惡性腫瘤的肺內(nèi)移植來構(gòu)建不同突變基因的肺癌模型，并且模擬TME。同樣從肺癌放療角度出發(fā)，原位動(dòng)物模型與異位模型優(yōu)勢也是很明顯的，異位人源肺癌模型是有著人類有相同基因的模型，在化學(xué)治療實(shí)驗(yàn)上提供了巨大貢獻(xiàn)。但在放療實(shí)踐中，不同部位腫瘤的微環(huán)境不盡相同，這對(duì)放射治療的療效有著重要影響，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為皮下空間的組織環(huán)境中，腫瘤的灌注和氧含量狀況與人類肺癌微環(huán)境不同。在放療中腫瘤細(xì)胞氧合程度及分次放療再氧合是至關(guān)重要的。有研究表明，在放療前通過高氧水平預(yù)處理多形性成神經(jīng)膠質(zhì)瘤(GBM),對(duì)輻射抵抗的腫瘤患者放療是一種安全有效的輔助治療手段。

3.3 本次肺癌原位動(dòng)物模型的構(gòu)建不足、注意事項(xiàng)及改進(jìn)空間 首先，本次研究中，在種植階段未進(jìn)行Matrigel基質(zhì)膠與細(xì)胞懸液混合移植入小鼠肺內(nèi)，可能是導(dǎo)致較早的肺內(nèi)轉(zhuǎn)移及肺外(胸膜)轉(zhuǎn)移的原因。其次，對(duì)小鼠進(jìn)行MRI掃描，采用與人體相同的MRI參數(shù)設(shè)置，對(duì)圖像質(zhì)量會(huì)有一定影響，如果使用專用小鼠參數(shù)會(huì)更好；上機(jī)過程中由于小鼠負(fù)荷腫瘤并麻醉狀態(tài)對(duì)于呼吸與心臟功能的抑制，機(jī)房設(shè)備環(huán)境溫度影響導(dǎo)致小鼠狀態(tài)不佳，表現(xiàn)為呼吸淺慢、心臟搏動(dòng)幅度減小次數(shù)減少，給予電加熱設(shè)備后小鼠生命狀態(tài)逐漸明顯好轉(zhuǎn)。最后，本實(shí)驗(yàn)小鼠解剖后未進(jìn)行原位移植瘤的腫瘤微環(huán)境與皮下異位移植腫瘤微環(huán)境的對(duì)比研究，進(jìn)一步研究可能發(fā)現(xiàn)皮下腫瘤與原位腫瘤及不同移植腫瘤微環(huán)境的不同，在放射治療中有研究價(jià)值。

總之，本研究成功的實(shí)現(xiàn)了LLC細(xì)胞在C57BL/6小鼠原位肺癌荷瘤模型的構(gòu)建，并運(yùn)用MRI直觀體現(xiàn)肺內(nèi)腫瘤存在及生長情況，造模成功率高，為后續(xù)開展放射治療實(shí)驗(yàn)研究提供了較為理想的動(dòng)物模型。但本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較少，未觀察模型的自然生存期，今后會(huì)繼續(xù)增加動(dòng)物數(shù)量，增加多個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，對(duì)比皮下移植模型及原位移植模型的優(yōu)缺點(diǎn)，繼續(xù)優(yōu)化構(gòu)建模型方法，改進(jìn)不足，滿足科學(xué)實(shí)驗(yàn)要求，為放射治療研究提供最優(yōu)模型。